Producción, Caracterización y posibles usos de un Humano esofágica mucosas Modelo ingeniería tisular 3D

El objetivo general de este procedimiento es producir un modelo de ingeniería tisular en 3D del epitelio esofágico humano para su uso como plataforma experimental. Esto se logra aislando primero fibroblastos esofágicos humanos normales y células epiteliales de muestras de tejido esofágico humano. En el segundo paso, los fibroblastos se siembran en un andamio esofágico acelular deepitelial, signo de poro, y se cultivan durante siete días.

A continuación, se invierte el andamio y las células epiteliales esofágicas humanas aisladas se añaden al cultivo durante cuatro días. En el paso final, el modelo se traslada a la interfaz aire-líquido durante otros cinco días de cultivo, lo que permite que se desarrolle un epitelio estratificado maduro. En última instancia, la inmunohistoquímica se utiliza para caracterizar los marcadores clave de proliferación y diferenciación expresados por las células epiteliales modelo.

Las principales ventajas de esta técnica frente al cultivo celular convencional en 2D es que permite a las células tener las interacciones célula, célula y matriz celular que tendrían in vivo. Y usando esta técnica, podemos producir un epitelio escamoso estratificado maduro similar al esófago normal. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades por tres razones.

En primer lugar, puede ser un desafío garantizar que la mayoría de las células epiteliales no se diferencien antes de ser incluidas en el andamio. En segundo lugar, se debe tener cuidado para garantizar que se proporcione la interfaz aire-líquido correcta durante el período en que el epitelio está madurando. Y tres, puede ser un desafío mantenerla durante todo el período de la cultura.

Para aislar las células epiteliales del esófago humano, coloque el tejido de la mucosa escamosa esofágica recolectado en una placa de Petri estéril y use un bisturí esterilizado con etanol para cortar el tejido en tiras de 0,5 centímetros. A continuación, incubar el tejido al 0,1% cubierto a 37 grados centígrados, deteniendo la digestión al cabo de una hora con cinco mililitros de FCS. A continuación, sujetando las tiras con pinzas, raspe suavemente la superficie epitelial con la hoja del bisturí durante uno o dos minutos por tira para eliminar las células epiteliales en el medio circundante cuando se hayan raspado todas las tiras, transfiera el medio que contiene las células epiteliales desprendidas a un tubo de centrífuga de 15 mililitros.

Después de centrifugar las células, deseche el sen y vuelva a suspender el pellet en 12 mililitros de medio epitelial. A continuación, deseche el medio de un cultivo de células encadenadas y utilice una pipeta estéril para colocar las células epiteliales en las células alimentadoras para aislar los fibroblastos esofágicos humanos. Transfiera las tiras de tejido raspadas a una placa de Petri estéril y, finalmente, pique el tejido con el bisturí.

Digiere las piezas en 10 mililitros de colagenasa al 0,5%, una solución cubierta a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono con una atmósfera humidificada durante la noche. Al día siguiente, transfiera el digestión a un tubo de centrífuga de 50 mililitros y centrifuga las células. Resus suspendiendo el paladar en 10 mililitros de medio de cultivo de fibroblastos.

El cultivo en un matraz T 75 en una incubadora de cultivos celulares. Para preparar los andamios esofágicos de cerdo descelularizados, comience usando tijeras y un par de pinzas para abrir el esófago de un cerdo longitudinalmente. A continuación, lave el esófago en una olla estéril de 180 mililitros que contenga 100 mililitros de PBS estéril durante 10 minutos agitando suavemente para eliminar los residuos del día mientras se enjuaga el tejido.

Rocíe una tabla de disección de corcho con etanol al 70% cuando el corcho esté seco en el esófago sobre la tabla con la mucosa hacia arriba. Ahora, use pinzas estériles para agarrar la superficie mucosa en un extremo del esófago y separar el tejido de la tabla para separar la mucosa de la submucosa subyacente. Luego, con una hoja de bisturí estéril, diseccione el esófago longitudinalmente a lo largo de la lengua propia, retirando los alfileres a medida que avanza la disección para permitir que la mucosa se levante.

Deseche la submucosa subyacente y use un bisturí para cortar la mucosa restante en trozos cuadrados de cinco centímetros. Lavar las piezas en 150 mililitros de PBS estéril con una agitación suave como se acaba de demostrar. Después de cinco minutos, transfiera el tejido a una olla de 180 mililitros que contenga 150 mililitros de una solución molar de cloruro de sodio.

Suplementado con antibióticos a 37 grados. Después de 72 horas, transfiera el tejido a 150 mililitros de PBS estéril, momento en el que el epitelio habrá comenzado a separarse visiblemente del tejido subyacente. Use pinzas estériles y una hoja de bisturí para quitar el epitelio que se desprende y coloque el tejido restante en una olla nueva de 150 mililitros de PBS estéril con tres lavados de cinco minutos con agitación suave, el tejido ahora debe almacenarse en glicerol durante un mínimo de cuatro meses.

Para esterilizar completamente el andamio, comience la preparación del modelo de mucosa esofágica rehidratando piezas de andamio porcino que hayan sido esterilizadas en glicerol durante al menos cuatro meses. En 100 mililitros de PBS estéril durante cinco agitaciones de 10 minutos. Reemplazar el supinato con PBS fresco para cada lavado.

Después de la quinta agitación, pruebe la esterilidad del andamio con una incubación nocturna en 100 mililitros de DMEM a 37 grados centígrados. A la mañana siguiente, transfiera los andamios a pocillos individuales de una placa de seis pocillos con el lado submucoso hacia arriba. A continuación, coloque un anillo estéril de acero inoxidable de grado médico en el centro de cada andamio y utilice pinzas estériles para presionar suavemente los anillos y asegurar un sellado adecuado con el tejido cinco veces.

Centre los cinco fibroblastos esofágicos humanos en un medio de fibroblastos de 0,2 mililitros en el centro de cada anillo. Luego inunde el área alrededor del exterior del anillo con al menos dos mililitros más de medio fibroblastos e incube los andamios en una incubadora de cultivo celular. Después de 24 horas, retire los anillos y reemplace el medio en cada pocillo con al menos cinco mililitros de fibroblastos frescos.

Medio, cuidando que los andamios queden totalmente sumergidos. Después de una semana, deseche el medio y use pinzas para invertir la superficie mucosa de los andamios hacia arriba. Vuelva a colocar los anillos en los andamios y luego agregue una vez el centro de las seis células epiteliales en 0,2 mililitros de medio compuesto, uno en el centro de cada anillo.

Tape el área exterior del anillo con aproximadamente dos mililitros de medio compuesto uno y devuelva las construcciones a la incubadora. Después de 24 horas, retire los anillos y reemplace el medio en cada pocillo con al menos cinco mililitros de medio compuesto fresco, uno, asegurándose de que los andamios estén completamente sumergidos. Después de otras 24 horas, reemplace el medio con al menos cinco mililitros de medio compuesto. Dos.

En el cuarto día, coloque rejillas estériles de malla de acero inoxidable de grado médico en los pocillos de una nueva placa de seis pocillos y transfiera las construcciones a las rejillas con la mucosa hacia arriba. Finalmente, agregue suficiente medio compuesto tres para llegar a la parte inferior del compuesto mientras deja la superficie expuesta al aire, asegurándose de que la muestra se mantenga en una interfaz de aire líquido. La parte más complicada del procedimiento es configurar la interfaz aire-líquido.

Si no está claro si la rejilla está en contacto con líquido, toque con una punta estéril a la tubería, ya que es más fácil ver si la tubería está sumergida. Alternativamente, puede intentar balancear la placa suavemente, ya que es más fácil ver el líquido cuando se está moviendo y verificar que haya líquido en la rejilla y que no cubra su muestra. Esto, la evaluación lógica del epitelio presenta un epitelio escamoso estratificado maduro de múltiples capas, similar pero más delgado al observado con el esófago humano normal, con las células volviéndose progresivamente más planas y, en última instancia, nucleares a medida que migran hacia la superficie.

La caracterización inmunohistoquímica de los marcadores clave de proliferación y diferenciación demuestra que la microanatomía del epitelio modelo es similar a la del epitelio esofágico humano normal. Por ejemplo, se observa una expresión comparable de citoqueratina 14 tanto en el esófago nativo como en el epitelio modelo, con tinción restringida a las células de la capa basal. Este modelo ha sido modificado con éxito para incorporar células tumorales mediante la sustitución de las células epiteliales primarias por células de carcinoma, lo que demuestra la flexibilidad del modelo.

Por ejemplo, las células de carcinoma escamoso producen un epitelio visible en el constructo como una región amarilla definida con grandes hendiduras dentro del epitelio, lo que probablemente refleja la presencia de moléculas de celdas disfuncionales, incluidas las células de adenocarcinoma de esófago. Después de dos semanas de crecimiento en la interfaz aire-líquido y confirmado en el análisis h y e como una reducción evidente en el grosor del andamio en la región debajo de las células Después de este procedimiento, se pueden aplicar otros métodos de expresión génica como la transferencia del norte o del oeste al mismo tejido para responder preguntas como, ¿Cómo responde el epitelio a las tensiones ambientales? Por lo tanto, esto proporciona un recurso realmente valioso para analizar más preguntas con mayor profundidad después de su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores interesados en la metaplasia de Barrett estudiaran el efecto de la exposición a componentes específicos del reflujo en la expresión génica en el esófago humano normal.