Name: Un método enzimático para rescatar a las células madre mesenquimales de médula ósea Las muestras Clotted (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Aprenda a aislar células madre mesenquimales de muestras de médula ósea coaguladas mediante digestión enzimática con uroquinasa. Este método rápido y económico mejora la disponibilidad celular para investigación.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional Suiza Subvención CR3I3_140717/1 y la Fundación Suiza para Parapléjicos.

NOTA: aspirados de médula ósea humana de la cresta ilíaca se obtuvieron de consentir los donantes con la aprobación del comité de ética del cantón de Lucerna. Aspirados de médula ósea canina de la cresta ilíaca se recogieron con consent.Human del dueño del perro (aprox. 20 ml) y canina (aprox. 10 ml) aspirados de médula ósea eran anti-coagulado mediante la adición de 15 ml de 3,8% de citrato de sodio inmediatamente después de la retirada en el teatro de operaciones. Las muestras se transfirieron al medio ambiente de laboratorio para el procesamiento de la misma día como retirada. 1. Preparación de uroquinasa (Antes del 1 st Uso) <ol><li> Reconstituir la uroquinasa usando solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) de acuerdo con las instrucciones del fabricante: Añadir 10 ml de PBS al matraz-septum de entrada utilizando una jeringa de 10 ml. Disolver la sustancia seca por agitación para obtener 50.000 unidades de inyección (U) por ml. </li><li> Preparar alícuotas de 500 mu l (25.000 U) en cada stubos terile. Alícuotas Tienda -20 ° C y usarlo cuando sea necesario durante al menos 6 meses. </li></ol> 2. Preparativos Pasos (Antes de cada hueso Tratamiento Ósea) <ol><li> Descongelar una alícuota de la uroquinasa (25.000 U) por aspirado de médula ósea coagulada (volúmenes aspirado hasta 25 ml han sido tratados con éxito utilizando una única alícuota de 25.000 U). </li><li> Precaliente un baño de agua o incubadora de agitación a 37 ° C. </li></ol> 3. digestión enzimática del Clot <ol><li> Realizar todo el trabajo en un gabinete de bioseguridad de flujo laminar para evitar la contaminación microbiana de las muestras de médula ósea durante el procesamiento. Cuando se trabaja con material humano potencialmente infecciosos, se recomienda el uso de guantes de protección, así como un manejo cuidadoso. </li><li> Colocación de un filtro 100 micras de células en la parte superior de un tubo de 50 ml estéril. Vierta cuidadosamente el aspirado de médula ósea a través del filtro de células, inclinando el colador o en movimiento alrededor del material de coágulo. Utilice una punta de pipeta estéril paramejor flujo a través de la malla del filtro. NOTA: Evite cualquier dilución del coágulo, por ejemplo, lavando el coágulo con PBS. Urokinase actúa indirectamente y requiere componentes del suero (es decir., Plasminógeno) de la biopsia de efectivo resumen. Mientras continúa el procedimiento con el material de coágulo, el filtrado se puede mantener a temperatura ambiente hasta su uso posterior en el paso 3.6. </li><li> Transferir el material de coágulo de médula ósea en una placa de cultivo celular vacía utilizando pinzas estériles. Cortar los escombros en trozos pequeños de aproximadamente 2 mm 3 utilizando un bisturí estéril. </li><li> Transferencia de las pequeñas piezas de coágulo en un tubo de reacción de 50 ml utilizando las pinzas estériles. Asegúrese de que el coágulo picada tiene una apariencia húmeda. Si parece estar seca, use algo del filtrado desde el paso 3.1 para humedecer. </li><li> Se tritura el coágulo pipeteando arriba y hacia abajo para 5 veces usando una pipeta de 5 ml de microtitulación. Añadir 1 alícuota de uroquinasa a la muestra. Incubar durante 30 minutos a 37 ° C, ya sea en un baño de agua o enun (suavemente) incubador con agitación. </li><li> Se tritura pipeteando arriba y hacia abajo para 5 veces usando una pipeta de 5 ml. Realice este paso en un gabinete de bioseguridad. Incubar durante 30 minutos a 37 ° C. Después de la incubación, se tritura de nuevo 5 veces usando una pipeta de 5 ml. Pasad una fresca filtro celular 100 micras para poner en común con el filtrado del paso 3.2. </li><li> Centrifugar la suspensión celular a temperatura ambiente durante 10 min a 500 x g. Eliminar el sobrenadante. Vuelva a suspender el sedimento celular en medios de comunicación como se describe a continuación o de acuerdo con el procedimiento estándar de su laboratorio para el cultivo de expansión MSC. </li></ol> 4. Siembra de Cultura de expansión de células y placas UFC <ol><li> Resuspender las células (que consta de eritrocitos y células mononucleares) en 50 ml de medio basal: Alpha-MEM suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 2,5 mg / ml de anfotericina B . Contar las células 1:10 diluido en solución de azul de tripano usando un chambe Neubauerr. </li><li> Placa de las células en matraces de cultivo celular en la densidad de 5 x 10 7 células / cm 2 y se incuban en un incubador humidificado a 37 ° C. Si está disponible, utilice hipóxicas (5% oxígeno). Para el control de ensayo CFU, placa 10 9 células en una placa de cultivo celular de 10 cm de diámetro. </li><li> Después de 3 días de cultivo, las células madre mesenquimales están unidos a la placa de cultivo celular mientras que otras células permanecen en suspensión. Cambiar los medios de comunicación con medio basal suplementado con 5 ng / ml de factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF). Para el control de ensayo CFU, tratar la placa de cultivo celular de igual manera. </li><li> Continuar el cultivo de células para un total de 2 semanas, el intercambio de los medios de comunicación tres veces a la semana. Si las células superan el 80% de confluencia, dividido por tripsinización. Para el control de ensayo CFU, intercambiar los medios de comunicación del mismo modo, pero no dividir las células durante el transcurso de las dos semanas. </li></ol> 5. Giemsa para ensayo CFU <ol><li> Preparar 10 ml de solución de Giemsa-por plato: dilUTE La solución madre (7,6 g / l Giemsa en glicerol: metanol) 1:10 en agua estéril (siempre preparar una dilución de trabajo fresco). </li><li> Retire el papel de la placa de cultivo celular y se lavan las células con PBS. Sea muy precavido al aplicar el líquido a la placa de Petri y evitar el lavado de las células. </li><li> Fijar las células en metanol puro durante 5 min a RT. Deseche el metanol. Añadir la solución de Giemsa y se incuba durante 60 minutos en un incubador humidificado a 37 ° C. </li><li> Lavar dos veces con PBS. Deje secar al aire la cabeza primera placa sobre una toalla de papel. Contar las colonias manualmente. Esto se logra mejor utilizando un rotulador en la parte posterior de la placa. </li></ol> 6. MSC Diferenciación <ol><li> MSC caninos diferenciación NOTA: MSCs caninos se diferenciaron en condrogénica, osteogénica y linajes adipogénicas por estimulación con el sustrato adecuado durante cuatro semanas. </li><li> Para Diferenciación Adipogénico, MSC cultura en monocapa a 4 x 10 5 ceLLS / cm 2 alternando dos condiciones de cultivo diferentes como sigue; <ol><li> Cultivo en medios de mantenimiento adipogénesis que contiene DMEM + GlutaMAX, 3% de FBS, 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 2,5 mg / ml de anfotericina B y la insulina 170 mM. </li><li> Cultura en la adipogénesis medios de inducir con medio de mantenimiento suplementado con 3% de FBS, 5% de suero de conejo, dexametasona 1 mM, 500 mM 3-isobutil-1-metilxantina, 33 mM biotina, 5 mM rosiglitazona y 17 mM pantotenato 16. </li><li> Revel las gotas de lípidos mediante tinción con rojo aceite-O. En pocas palabras, fijar las células con formaldehído al 10%, lavar con PBS y manchar con 0,35% de aceite rojo O en isopropanol. </li></ol></li><li> Para el cultivo de la diferenciación osteogénica MSCs en monocapa a 7 x 10 3 células / cm 2 y estimular en el siguiente: <ol><li> Advanced DMEM (GIBCO) + GlutaMAX, 5% de FBS, 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 2,5 mg / ml de anfotericina B, 501; M de ácido L-ascórbico 2-fosfato, 10 mM ß-glicerofosfato y 100 nM de dexametasona. </li><li> Identificar los depósitos de mineralización por tinción Von Kossa (5% AgNO3). Brevemente, fijar las células con 10% de formaldehído, se lava con PBS y se mancha con 5% AgNO 3 en agua destilada. </li></ol></li><li> Diferenciación condrogénica <ol><li> Cubos de corte (3 mm por lado) de un dispositivo médico en forma de esponja, constituidas a partir de liofilizado de colágeno de tipo I, y se utilizan como material de soporte para apoyar las células 17. </li><li> MSCs semilla en la parte superior de los cubos a la concentración de 4 x 10 6 células / ml (~ 70.000 células / cubo). </li><li> Antes de la adición de medios de comunicación, permiten que las células se adhieran a los cubos de 30 min. </li><li> Mantener construcciones-MSC colágeno en medios condrogénica que consisten en DMEM / F12 + GlutaMAX, 2,5% de FBS, 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 2,5 mg / ml de anfotericina B, 40 ng / ml de dexametasona, 50 g / ml ascórbico ácido 2-fosfato,50 mg / ml de L-prolina, 1x insulina-transferrina-selenio X, y 10 ng / ml factor de crecimiento transformante-β1. </li><li> Utilice la tinción con azul Alcian para visualizar la acumulación de proteoglicanos en construcciones secciones. En pocas palabras, manchar las secciones O / N con 0,4% de azul alcián disuelto en 0,01% de H 2 SO 4 y 0,5 M hidrocloruro de guanidina. A continuación, lavar las secciones se lavaron durante 30 minutos en el 40% de DMSO y 0,05 M de MgCl2. Las células fueron counterstained con rojo nuclear. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotency+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+adult+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow.</a> Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).</li>
<li>Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).</li>
<li>Bartholomew, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+suppress+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+prolong+skin+graft+survival+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo.</a> Exp Hematol. 30 (1), 42-48 (2002).</li>
<li>Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+applications+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Clinical applications of mesenchymal stem cells.</a> J Hematol Oncol. 5, 19(2012).</li>
<li>Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mesenchymal+stem+cells%3A+characterization%2C+differentiation%2C+and+application+in+cell+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy.</a> J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).</li>
<li>Malempati, S., Joshi, S., Lai, S., Braner, D. A., Tegtmeyer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Videos+in+clinical+medicine.+Bone+marrow+aspiration+and+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Videos in clinical medicine. Bone marrow aspiration and biopsy.</a> N Engl J Med. 361 (15), e28(2009).</li>
<li>Cuthbert, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-platform+quality+control+assay+to+quantify+multipotential+stromal+cells+in+bone+marrow+aspirates+prior+to+bulk+manufacture+or+direct+therapeutic+use%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Single-platform quality control assay to quantify multipotential stromal cells in bone marrow aspirates prior to bulk manufacture or direct therapeutic use.</a> Cytotherapy. 14 (4), 431-440 (2012).</li>
<li>Veyrat-Masson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+content+of+fresh+bone+marrow%3A+a+proposed+quality+control+method+for+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal content of fresh bone marrow: a proposed quality control method for cell therapy.</a> Br J Haematol. 139 (2), 312-320 (2007).</li>
<li>Lazarus, H. M., Haynesworth, S. E., Gerson, S. L., Rosenthal, N. S., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+expansion+and+subsequent+infusion+of+human+bone+marrow-derived+stromal+progenitor+cells+%28mesenchymal+progenitor+cells%29%3A+implications+for+therapeutic+use%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progenitor cells (mesenchymal progenitor cells): implications for therapeutic use.</a> Bone Marrow Transplant. 16 (4), 557-564 (1995).</li>
<li>Bertolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+expansion+score+for+tissue-engineering+applications+with+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">An in vitro expansion score for tissue-engineering applications with human bone marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2013).</li>
<li>Casiraghi, F., Remuzzi, G., Abbate, M., Perico, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+mesenchymal+stromal+cell+therapy+and+risk+of+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Multipotent mesenchymal stromal cell therapy and risk of malignancies.</a> Stem Cell Rev. 9 (1), 65-79 (2013).</li>
<li>Bonab, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+of+mesenchymal+stem+cell+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Aging of mesenchymal stem cell in vitro.</a> BMC Cell Biol. 7, 14(2006).</li>
<li>Niku, S. D., Hoon, D. S., Cochran, A. J., Morton, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+lymphocytes+from+clotted+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of lymphocytes from clotted blood.</a> J Immunol Methods. 105 (1), 9-14 (1987).</li>
<li>De Vis, J., Renmans, W., Segers, E., Jochmans, K., De Waele, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+immunophenotyping+of+leukemia+cells+in+clotted+blood+and+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric immunophenotyping of leukemia cells in clotted blood and bone marrow.</a> J Immunol Methods. 137 (2), 193-197 (1991).</li>
<li>St Antoine, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+thrombolytic+drugs+on+clotted+blood+and+bone+marrow+specimens+to+generate+usable+cells+for+cytogenetic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pathol+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Application of thrombolytic drugs on clotted blood and bone marrow specimens to generate usable cells for cytogenetic analyses.</a> Arch Pathol Lab Med. 135 (7), 915-919 (2011).</li>
<li>Kisiel, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterization%2C+and+in+vitro+proliferation+of+canine+mesenchymal+stem+cells+derived+from+bone+marrow%2C+adipose+tissue%2C+muscle%2C+and+periosteum%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterization, and in vitro proliferation of canine mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, muscle, and periosteum.</a> Am J Vet Res. 73 (8), 1305-1317 (2012).</li>
<li>Bertolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+different+commercial+scaffolds+on+the+in+vitro+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells+to+nucleus+pulposus-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Spine+J%22%5BJournal%5D)">Influence of different commercial scaffolds on the in vitro differentiation of human mesenchymal stem cells to nucleus pulposus-like cells.</a> Eur Spine J. 21, Suppl 6. S826-S838 (2012).</li>
<li>Makridakis, M., Roubelakis, M. G., Vlahou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%3A+insights+into+the+secretome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Stem cells: insights into the secretome.</a> Biochim Biophys Acta. 1834 (11), 2380-2384 (2013).</li>
<li>Benvenuti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosiglitazone+stimulates+adipogenesis+and+decreases+osteoblastogenesis+in+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol+Invest%22%5BJournal%5D)">Rosiglitazone stimulates adipogenesis and decreases osteoblastogenesis in human mesenchymal stem cells.</a> J Endocrinol Invest. 30 (9), RC26-RC30 (2007).</li>
<li>Jaiswal, N., Haynesworth, S. E., Caplan, A. I., Bruder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+differentiation+of+purified%2C+culture-expanded+human+mesenchymal+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro.</a> J Cell Biochem. 64 (2), 295-312 (1997).</li>
<li>Patel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+banking+for+research--bench+to+bedside+and+back--myth%2C+reality+or+fast+fading+reality+at+the+dawn+of+a+personalised+healthcare+era%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Bank%22%5BJournal%5D)">Tissue banking for research--bench to bedside and back--myth, reality or fast fading reality at the dawn of a personalised healthcare era.</a> Cell Tissue Bank. 12 (1), 19-21 (2011).</li>
<li>Smith, H. W., Marshall, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cell+signalling+by+uPAR%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of cell signalling by uPAR.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 23-36 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Rutinariamente muestra de médula ósea, mientras que el paciente está sometido a cirugía (en nuestro caso la cirugía, principalmente la columna vertebral), con la ventaja de que sólo poco trabajo adicional tiene que ser llevada a cabo por el personal de la sala de operaciones. A pesar de que las muestras se mezclan con citrato de sodio inmediatamente después de la retirada, muchas muestras fueron parcialmente coagulada cuando llegaron en el laboratorio para su procesamiento. En esta etapa, el remuestreo para reemplazar m...

Las células madre mesenquimales (MSCs) juegan un papel importante en la medicina regenerativa y la ingeniería de tejidos. Ellos pueden migrar, diferenciarse en diversos tipos de células 1 y injertarse, lo que les hace candidatos ideales para las terapias autólogas 2,3. Últimamente, los ensayos clínicos con MSC para la reparación de hueso y cartílago, se lanzaron enfermedad injerto contra huésped o enfermedad cardíaca 4. Estos MSCs se pueden cosechar a partir del tejido del cordón umbilical o tejido adiposo pero los resultados más prometedores se obtuvieron a partir de la médula ósea células madre derivadas 5. La cresta ilíaca permite recoger una cantidad considerable de médula ósea y por lo tanto sirve como sitio principal de la aspiración 6. Sin embargo, la calidad del aspirado disminuye con el aumento de volumen de la médula ósea retirada. Mientras que los primeros 5 ml de aspirado de médula ósea contienen MSCs de alta calidad, la retirada de volúmenes más grandes conduce a la dilución de la sangre periférica con aspirado de fesde el hueso altamente vascularizado 7. Debido a los presentes megacariocitos y plaquetas, aspirado de médula ósea son propensos a la coagulación, a menos que se utilizan anticoagulantes. Pero incluso con anticoagulantes, se pueden producir coágulos. En la médula ósea, MSCs representar sólo una pequeña proporción de la piscina total de células 8 y tienen que ser expandida en cultivo durante más de ingeniería de tejidos o aplicaciones terapéuticas 4. La calidad de una cultura de este tipo depende en gran medida de la piscina célula inicial, es decir., La diversidad y un alto número de partida 9. Los números bajos de las MSC de retiros pueden explicarse en parte por la variabilidad de los donantes. Por otro lado, las MSC de muestras de baja calidad requieren más tiempo en la cultura y pases extendido para alcanzar el número deseado de células. En cualquier caso, los pases extendida es una fuente de la senescencia celular y puede conducir a la pérdida de la diferenciación potencial 10. Por lo tanto, los protocolos que pueden maximizar celular y optimizadoield y prevenir los efectos perjudiciales tienen que desarrollarse 11,12. Cuando empezamos a trabajar con las MSC caninos, nos quedamos asombrados al ver que alrededor de tres de cada cuatro muestras de médula ósea canina contenían coágulos, mientras que las muestras humanas afortunadamente coagulada (uno de cada diez) fueron menos frecuentes. Por otra parte no fue una sorpresa, que observamos rendimientos mucho más bajos de las MSC de muestras coaguladas. Para resolver el problema recurrente de muestras coaguladas, hemos desarrollado el protocolo mediante el uroquinasa fármaco trombolítico en lugar de remuestreo. Terapias trombolíticos pueden contrarrestar situaciones que amenazan la vida tales como la oclusión de los vasos sanguíneos que causan ataques cardiacos, derrames cerebrales o embolias debido a la coagulación no deseada. Trabajan por la degradación de los coágulos a través de la escisión enzimática de la fibrina por la plasmina y de plasminógeno enzimática activadores. A pesar de la amplia utilización para el tratamiento de los pacientes, sólo existen muy pocas publicaciones que las actividades trombolíticos utilizadospara aplicaciones de laboratorio para rescatar muestras coaguladas, centrándose sobre todo en los linfocitos. En 1987, Niku et al. describe el uso de estreptoquinasa para disolver los coágulos de sangre que resulta en linfocitos funcionales 13 y cuatro años más tarde, De Vis et al. extendido el uso de estreptoquinasa para aislar las células leucémicas de la sangre y la médula ósea para aplicaciones de citometría de flujo 14. Una publicación más reciente sugiere el uso de alteplasa para el diagnóstico del cáncer 15. Mientras utiliza el mismo enfoque enzimática, nuestro protocolo se centra en el aislamiento de multipotentes MSC forma médula ósea para proporcionar una herramienta para los investigadores en el campo de las células madre.

<table><tbody><tr>Componentes <td></td><td></td><td></td><td>del medio basal</td></tr><tr><td>PenStrep 100X</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>FGF-básico humano</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>MEM Alpha con nucleósido, con glutamina estable</td><td>Amimed</td><td>1-23S50-I</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Amimed</td><td>2-01F36-I</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Applichem</td><td>A1907</td><td></td></tr><tr>Componentes <td></td><td></td><td></td>del<td>medio adipogénico</td></tr><tr><td>DMEM-HAM F12 + GlutaMAX</td><td>Amimed</td><td>1-26F09-I</td><td></td></tr><tr><td>Insulina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>Suero de conejo&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>16120099</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Applichem</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutil-1-metilxantina</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Biotina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazona&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R2408</td><td></td></tr><tr><td>Pantotenato&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5155</td><td></td></tr><tr><td>Aceite Red-O&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Componentes del medio osteogénico Ácido</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-ascórbico 2-fosfato</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>&szlig;-glicerofosfato</td><td>Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de plata (AgNO3)</td><td>Sigma</td><td>S6506</td><td></td></tr><tr><td>Componentes</td><td></td><td></td><td></td> del medio condrogénico</tr><tr><td>Biopad - dispositivo médico en forma de esponja&nbsp;</td><td>Euroresearch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-prolina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5607</td><td></td></tr><tr><td>Insulina-Transferrina-Selenio X</td><td>Gibco</td><td>51500056</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento transformador humano-&beta; 1&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>Azul Alcián 8GX</td><td>Sigma</td><td>A3157</td><td></td></tr><tr><td>Nuclear rojo rápido</td><td>Sigma</td><td>N8002</td><td></td></tr><tr><td>Genérico</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citrato trisódico dihidratado</td><td>Applichem</td><td>A3901</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Applichem</td><td>964.9100</td><td></td></tr><tr><td>Uroquinasa</td><td>Medac</td><td>1976826</td><td></td></tr><tr><td>0,5% Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Tinción de Giemsa</td><td>Liquem</td><td>A0885</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehído</td><td>Liquem</td><td>A0877</td><td></td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico (H2SO4)</td><td>Liquem</td><td>A0655</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Apliquem</td><td>A1584</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio (MgCl2)</td><td>Apliquem</td><td>A3618</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de guanidina</td><td>Applichem</td><td>A1499</td><td></td></tr><tr><td>Consumibles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml tubo de reacción</td><td>Axygen</td><td>SCT-50ML-25-S</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 10 ml</td><td>Braun</td><td>4606108V</td><td></td></tr><tr><td>Aguja estéril (22G)</td><td>Braun</td><td>4657624</td><td></td></tr><tr><td>1,7 ml Microtubos</td><td>Brunschwig</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; M filtro de células</td><td>Falcon</td><td>6.05935</td><td></td></tr><tr><td>pinza estéril</td><td>Bastos Viegas, SA</td><td>489-001</td><td></td></tr><tr><td>bisturí estéril</td><td>Braun</td><td>5518059</td><td></td></tr><tr><td>Primaria plato de curtura celular</td><td>Falcon</td><td>353803</td><td></td></tr><tr><td>C-Chip Neubauer Mejorado</td> Matraz de cultivo celular <td>Bioswisstech</td><td>505050</td><td></td></tr><tr><td>- Matraz T300</td><td>TPP</td><td>90301</td><td></td></tr><tr><td>Equipamiento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cabina de bioseguridad microbiológica clase II</td><td>Skan</td><td>82011500</td><td></td></tr><tr><td>baño de agua</td><td>Memmert</td><td>1305.0377</td><td></td></tr><tr><td>Stripettes Pipeta serológica 5ml</td><td>Microscopio Corning</td><td>4487-200ea</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>incubadora humidificada Heracells 240</td><td>Thermo 51026331</td><td></td><td></td></tr><tr><td>científico Heraeus Multifuge 1S-R</td><td>Thermo scientific</td><td>75004331</td><td></td></tr></tbody></table>

un método enzimático para rescatar a las células madre mesenquimales de médula ósea las muestras clotted

An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

Las células madre mesenquimales (MSC), generalmente obtenidas de la médula ósea, a menudo requieren cultivo de expansión. Nuestro protocolo utiliza uroquinasa de grado clínico para degradar los coágulos en la médula ósea y liberar MSC para su uso posterior. Este protocolo proporciona una alternativa rápida y económica al remuestreo de médula ósea. La médula ósea es una fuente importante de MSC, que son interesantes para la ingeniería de tejidos y las terapias con células madre autólogas. Tras la retirada, la médula ósea puede coagularse, ya que comprende todo el sistema hematopoyético. Los coágulos resultantes también contienen MSC que se pierden para el cultivo en expansión o la terapia directa con células madre. Experimentamos que el 74% de las muestras de médula ósea canina contenían coágulos y produjeron menos de la mitad del número de células madre esperado de las muestras sin coagular. Por lo tanto, desarrollamos un protocolo para la digestión enzimática de esos coágulos para evitar el remuestreo de médula ósea costoso y laborioso. La uroquinasa, un fármaco trombolítico clínicamente aprobado y fácilmente disponible, elimina los coágulos de la médula ósea casi por completo. Como consecuencia, los aspirados de médula ósea tratados producen un número similar de MSC que las muestras no coaguladas. Además, después del tratamiento con uroquinasa, las células mantuvieron su actividad metabólica y la capacidad de diferenciarse en linajes condrogénicos, osteogénicos y adipogénicos. Nuestro protocolo rescata muestras de sangre y médula ósea coaguladas sin afectar la calidad de las células. Esto deja obsoleto el remuestreo, reduce considerablemente los costos de muestreo y permite el uso de muestras coaguladas para investigación o terapia.

Los hechos que el 74% de las muestras de médula ósea caninas (n = 54) contenía coágulos cuando llegaron a nuestro laboratorio (Figura 1 A) junto con la disminución de los rendimientos de MSC partir de estas muestras, nos hizo creer que un número considerable de las MSC estaba atrapado dentro de los coágulos . De hecho, un simple DAPI-mancha del material de coágulo seccionada confirma la presencia de células nucleadas en alta densidad (Figura 1B). Da lugar a un bajo número de MSC disponi...

Las células madre mesenquimales generalmente se obtienen de la médula ósea y requieren cultivo de expansión. Cuando las muestras se coagulan antes del procesamiento, se puede aplicar un protocolo que utiliza el fármaco trombolítico uroquinasa (enzimático) para degradar el coágulo. De este modo, las células se liberan y están disponibles para el cultivo en expansión. Este protocolo proporciona una alternativa rápida y económica al remuestreo.

Un método enzimático para rescatar a las células madre mesenquimales de médula ósea Las muestras Clotted

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

El objetivo general de este procedimiento consiste en aprovechar muestras de médula ósea coagulada digiriendo los coágulos con urokinasa. Esto se logra primero filtrando la muestra de médula ósea a través de un filtro para células. A continuación, el coágulo de médula ósea se corta en trozos pequeños.Luego, el co&aacute;gulo se transfiere a un tubo Falcon y se digiere utilizando urokinasa. Finalmente, el material del co&aacute;gulo digerido se siembra para la expansi&oacute;n de c&eacute;lulas madre mesenquimales o CMM. En &uacute;ltima instancia, las placas se comparan con una placa control utilizando em sustain para evaluar la eficacia de la digesti&oacute;n.La implicación de esta técnica se extiende hacia la terapia o el diagnóstico con células madre autólogas. Debido a que el injerto requiere la expansión y diferenciación de un gran número de células madre. Tuvimos por primera vez la idea de este método al darnos cuenta de que muchas muestras de médula ósea procedentes de DOC estaban coaguladas cuando llegaban a nuestro laboratorio.Sencillamente no queríamos desechar muestras tan valiosas para reconstituir la uroquinasa. Inyecte 10 mililitros de PBS estéril en el frasco de entrada con septo y vortexee para disolver hasta una concentración de 50.000 unidades por mililitro. Aliquote 500 microlitros de 25.000 unidades cada uno en tubos estériles y almacene a menos 20 grados Celsius durante hasta seis meses para llevar a cabo una reacción de digestión. Desele un alícuota de uroquinasa por cada aspirado de médula ósea turbio de hasta 25 mililitros.Precalentar un baño de agua o un incubador agitador a 37 grados Celsius bajo una cabina de flujo laminar con seguridad biológica. Y mientras se usan guantes, colocar un filtro celular de 100 micrómetros encima de un tubo de 50 mililitros. Verter cuidadosamente el aspirado de médula ósea a través del filtro celular, inclinando el filtro o moviendo el material coagulado.Vierta cuidadosamente el aspirado de médula ósea a través del filtro celular sin inclinar el colador ni mover el material del coágulo. Utilice una pipeta estéril para lograr un mejor flujo a través de la malla del filtro, junto con pinzas estériles. Transfiera el material del coágulo de médula ósea a una placa de cultivo celular vacía.Luego, utilice un escalpelo estéril para cortar los restos en trozos cúbicos de dos milímetros. A continuación, con una pipeta microlitera de cinco mililitros, tri-ture el coágulo pipeteando hacia arriba y hacia abajo cinco veces. Después, añada un alícuota de urokinasa a la muestra e incube a 37 grados Celsius durante 30 minutos en un baño de agua o en un incubador agitador.Después de la incubación en la cabina de seguridad biológica, se vuelve a realizar la tri-turación y se incuba durante 30 minutos adicionales. Luego, se realiza la tri-turación cinco veces más y se pasa la muestra a través de un filtro celular nuevo de 100 micrómetros, recolectándolo junto con el filtrado inicial. Se centrifuga la suspensión celular a 500 × g y temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de desechar el sobrenadante, se utilizan 50 mililitros de medio basal para resuspender el precipitado.Utilizando solución azul de tripano, diluya un alícuota de células resuspendidas uno a diez y agregue la suspensión a una cámara de Neubauer para contarlas. Después de contar las células, siembrelas en frascos de cultivo celular a una densidad de cinco por diez a la siete células por centímetro cúbico para la placa de control del ensayo de UFC.10 a la novena células en un plato de cultivo celular redondo de 10 centímetros de diámetro, incubar en una cámara humedecida a 37 grados Celsius. Tras tres días de cultivo, las CMM se adherirán al plato de cultivo celular mientras que otras células permanecerán en suspensión. Utilice medio basal que contenga cinco nanogramos por mililitro de factor de crecimiento de fibroblastos básico para reemplazar el medio en las placas experimentales y de control.Continúe el cultivo durante un total de dos semanas, cambiando el medio tres veces por semana. Si las células superan el 80 % de confluencia, retire las células del cultivo con tripsina y divídalas para realizar el ensayo de UCF.Prepare 10 mililitros de solución de GSA por placa utilizando agua estéril para diluir la solución stock. De uno a 10. Retire el medio del plato de cultivo celular y use PBS para lavar cuidadosamente las células con metanol puro.Fije las células a temperatura ambiente durante cinco minutos. Luego deseche el metanol y agregue la solución de gemsa. Incube en una cámara humidificada a 37 grados Celsius durante 60 minutos después de la incubación.Use PBS para lavar las células dos veces. Luego seque la placa al aire. Colóquela primero sobre una toalla de papel con un marcador en la parte posterior de la placa.Contar manualmente las colonias para la diferenciación adipogénica. Cultivar las CMM en monocapa a cuatro veces 10 a la quinta células por centímetro cuadrado. Alternar entre dos condiciones de cultivo diferentes para la primera condición.Cultive las células en un medio de mantenimiento para adipogénesis y, para la segunda condición, cultive las células. Un medio de inducción de adipogénesis con medio de mantenimiento según las recetas descritas en el protocolo del texto. Para visualizar las gotas lipídicas, use formaldehído al 10% para fijar brevemente las células.Luego, lave las células con PBS antes de usar el rojo de aceite O al 0,35 % en isopropanol para teñir las células destinadas a la diferenciación osteogénica. Cultive las CMM en monocapa a siete veces 10 de las terceras células por centímetro cuadrado. Después de estimular las células utilizando el medio descrito en el protocolo del texto, fije brevemente las células con formaldehído al 10 %. Una vez que las células hayan sido lavadas con PBS, use Von Kossa para identificar los depósitos minerales y llevar a cabo la diferenciación congénica a partir de un dispositivo médico con forma de esponja constituido por cubos de colágeno tipo uno liofilizados, cortados con tres milímetros por lado. Siembre las CMM sobre la superficie de los cubos a una concentración de cuatro veces 10 a la octava células por mililitro, tras permitir que las células se adhieran a los cubos durante 30 minutos a temperatura ambiente.Mantenga los constructos de colágeno de MSC en medio congénico según se indica en el protocolo del texto. Añada solución de Ian Blue al 0,4 % a las secciones e incube durante la noche a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, use DMSO al 40 % y cloruro de magnesio 0,05 molar para lavar las células durante 30 minutos antes de usar rojo nuclear rápido para contratinjar las células como se muestra aquí.Una sección teñida con DAPI simple del material del coágulo confirma la presencia de células nucleadas en alta densidad, lo que indica que un número considerable de CMM se encuentran atrapadas dentro de los coágulos. Utilizando el protocolo descrito en este video, el tratamiento con uroquinasa permitió la digestión de todo el coágulo excepto el 15 % en peso de los coágulos sanguíneos caninos y el 9 % en peso de los humanos, para determinar la eficacia de la digestión con uroquinasa. Las células procedentes de los filtrados de muestras coaguladas y de los coágulos digeridos se sembraron por separado y se incubaron durante dos semanas.El mantenimiento de las células mostró 3,8 veces más UFC procedentes de muestras caninas digeridas con uroquinasa que de los filtrados iniciales correspondientes. Las muestras digeridas humanas mostraron 1,6 veces más UFC que los filtrados no digeridos. En este experimento, se compararon MSC procedentes de coágulos de médula ósea con MSC derivadas de muestras de médula ósea coagulada de UNC según su capacidad de diferenciación bajo condiciones de cultivo adecuadas.Después de cuatro semanas en cultivo, fue posible diferenciar las CMM procedentes de muestras digeridas en linajes adipogénicos, osteogénicos y condrogénicos. Además, las tinciones con rojo de von Kossa, rojo O y azul de Sian indicaron que no había diferencias en el grado de diferenciación entre los grupos. Una vez dominado, el procedimiento Mr.Nick puede realizarse en aproximadamente una hora y media si se lleva a cabo correctamente.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar células madre hemo para cultivo de expansión, incluso si sus muestras están coaguladas en lugar de descartar la muestra. Nuestro protocolo utiliza la enzima kinase para digerir el coágulo y las células madre ES para cultivo de expansión.

an-enzymatic-method-to-rescue-mesenchymal-stem-cells-from-clotted

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Rata MSC fueron aisladas de fémur y la tibia y luego enriquecido por la clasificación de células magnéticas. Células seleccionadas fueron confirmados para la expresión de marcadores de superficie por citometría de flujo. Estas células fueron cultivadas a una densidad de clones para formar colonias aisladas y luego estas colonias fueron separados por cilindros de clonación.

Aislamiento y enriquecimiento de las células de rata madre mesenquimales (MSC) y la separación de una sola colonia Derivado MSC

Un método para analizar la distribución de progenitores hematopoyéticos de médula ósea en citometría de flujo, así como para aislar eficazmente altamente purificadas células madre hematopoyéticas (HSC) se describe. El procedimiento de aislamiento se basa esencialmente en el enriquecimiento magnética de c-kit + células y células de clasificación para purificar las CMH para los estudios celulares y moleculares.

El análisis fenotípico y aislamiento de células madre hematopoyéticas murinas y progenitores comprometidos Lineage

Las células madre mesenquimales (MSCs) tienen un potencial de diferenciación hacia el linaje osteoblástico cuando se estimulan con factores solubles o biomateriales específicos. Este trabajo presenta una opción novedosa para la administración de MSCs de la membrana amniótica humana (AM-hMSCs) que emplea la matriz ósea bovina Nukbone (NKB) como andamio.

El aislamiento de células madre mesenquimales humanas y su cultivo en la matriz del hueso poroso

El cultivo de células mesenquimales estromales humanas (hMSC) con suero autólogo, reduce los riesgos de rechazo por el material xenogénico y otros efectos negativos. También permite la recuperación de un subconjunto de progenitores mesodérmicos, que puede entregar hMSCs frescas. Incorporación de hMSCs en un coágulo de fibrina autóloga permite un manejo fácil y efectiva implantación quirúrgica.

Mesenquimales estromales de cultivo celular y de entrega en autólogas Condiciones: Enfoque inteligente para aplicaciones ortopédicas

Este protocolo ilustra un procedimiento seguro y eficaz para modificar CD133+ las células madre hematopoyéticas. El presentado no virales, magnético polyplex enfoque puede proporcionar una base para la optimización de los efectos terapéuticos de células madre, así en cuanto a la supervisión del producto celular administrada a través de la proyección de imagen de resonancia magnética.

Protocolo para la transferencia de microARN en médula ósea hematopoyéticas células madre adultas para permitir ingeniería celular combinado con orientación magnética

Este protocolo proporciona un método libre de enzimas para aislar las células madre mesenquimales de muestras de abdominoplastia y lipoaspiración utilizando un método explantado. La ausencia de enzimas duras o pasos de centrifugación proporciona células madre clínicamente relevantes que pueden utilizarse para estudios in vitro o transferirse de vuelta a la clínica.

Un método libre de enzimas para el aislamiento y la expansión de las células madre mesenquimales derivadas de adiposo humano

Este protocolo describe el uso de la clasificación celular activada por fluorescencia de células madre mesenquimales humanas utilizando el método de clasificación de una sola célula. Específicamente, el uso de la clasificación de una sola célula puede lograr una pureza del 99% de las células inmunofenotipadas de una población heterogénea cuando se combina con un enfoque basado en citometría de flujo multiparamétrica.

Clasificación unicelular de células madre mesenquimales inmunofenotipadas de dientes deciduos exfoliados humanos

Aquí presentamos protocolos que permiten el aislamiento de células estromales de hueso murino, médula ósea, timo y tejido tímico humano compatible con multiómicas unicelulares.

Aislamiento de células estromales de órganos hematopoyéticos

El presente protocolo describe un método rentable para purificar, expandir y caracterizar células madre mesenquimales de médula ósea (BMSC) altamente homogéneas de ratones. Este enfoque facilita la adquisición de grandes cantidades de BMSCs con alto potencial de proliferación y diferenciación, apoyando modelos de ratón y avanzando en la investigación preclínica.

Fenotipado basado en purificación, expansión y citometría de flujo de células madre mesenquimales de médula ósea derivadas de ratón

Este protocolo describe un método de clasificación basado en perlas magnéticas que utiliza anticuerpos de citometría de flujo marcados con ficoeritrina (PE) y microperlas anti-PE para aislar subpoblaciones específicas de células madre mesenquimales con alta positividad de marcadores objetivo postclasificación y actividad metabólica preservada basada en CCK-8 bajo las condiciones probadas, sin requerir costosos clasificadores celulares ni perlas personalizadas específicas para cada objetivo.

Aislamiento y validación de subpoblaciones de células madre mesenquimales positivas para podoplanina utilizando una estrategia indirecta de perlas magnéticas

Aprenda a aislar células madre mesenquimales de muestras de médula ósea coaguladas mediante digestión enzimática con uroquinasa. Este método rápido y económico mejora la disponibilidad celular para investigación.

Un método enzimático para rescatar a las células madre mesenquimales de médula ósea Las muestras Clotted

Explorar más videos