Aislamiento de células mononucleares de la del sistema nervioso central de ratas con EAE

Vale. Hola, soy Christine Beaton. Soy investigadora asistente en el laboratorio de George Chen, del Departamento de Fisiología y Biofísica de la Universidad de California en Irvine. Y hoy les mostraré cómo aislar células mononucleares del sistema nervioso central de ratas.

Este procedimiento consiste en anestesiar profundamente a la rata para realizar una perfusión cardíaca, de modo que no tengamos sangre contaminante en el sistema nervioso central. Cuando la extraigamos, retiraremos el cerebro y la médula espinal, prepararemos una suspensión de células individuales utilizando un filtro celular y, a continuación, mediante un gradiente de doble capa de percol, aislaremos las células mononucleares. Comencemos.

Ahora estoy listo para realizar la perfusión cardíaca, así que voy a mostrar todos los materiales que necesito para ello. Lo primero que necesitamos es un frasco de Bell, y aquí abajo hemos colocado toallas de papel empapadas con anestésico volátil. Puede utilizarse halano o isoflurano.

Lo siguiente que necesitamos es algo para sostener la rata y algo para recolectar la sangre. Por lo tanto, tenemos esta instalación improvisada para perfundir a las ratas. Se utilizará una aguja de calibre 21, y se administrará una solución salina mediante un sistema de perfusión intravenosa por gravedad.

Si no tiene acceso a uno de esos sistemas, también puede llenar varias jeringas con solución salina y perfundirlas manualmente. Pero esto es mucho más fácil. Y lo que también necesitamos es un cilindro de jeringa de 10 ml en el cual hemos colocado toallas Kim.

Y voy a colocar el anestésico, algo del anestésico dentro, sobre la nariz de la rata para asegurarme de que permanezca profundamente anestesiada durante el procedimiento. Y luego, por supuesto, necesitas instrumentos. Así que hoy no voy a realizar un procedimiento estéril porque no voy a colocar las células en cultivo.

Por lo tanto, todos los instrumentos que estoy utilizando no son estériles. Pero, por supuesto, si desea poner sus células en cultivo, quizás desee usar instrumentos estériles. Para los fines de este video, voy a utilizar una rata que en realidad está muerta.

Así puedo realizar el procedimiento lentamente para mostrárselo, paso a paso. Por supuesto, en un procedimiento real, necesitaría una rata profundamente anestesiada, pero no muerta. Querría que el corazón siguiera latiendo.

Así que comencemos con esta rata. Coloqué a la rata sobre su espalda, con ella orientada en sentido contrario a mí, y puse toallitas húmedas sobre su nariz. Luego, lo primero que voy a hacer es verificar que la rata esté profundamente anestesiada.

Por lo tanto, debe hacerlo antes de cada uno de esos procedimientos. Tomo mis pinzas y pellizco a la rata, y no hay ninguna reacción. Si hay alguna reacción, debe devolver la rata al belger para asegurarse de que esté profundamente anestesiada.

Luego voy a usar etanol al 70 % para empapar la mitad superior de la rata. Y después voy a abrir la cavidad torácica. Primero voy a cortar la piel y abrirla lateralmente.

Luego voy a abrir la cavidad propiamente dicha. Esta masa aquí es el corazón. Aquí pueden ver la aurícula derecha.

Esto es lo que voy a cortar para permitir que la sangre salga. Y luego, para perfundir todo el cuerpo, necesito insertar mi aguja en el ventrículo izquierdo. Así que voy a insertar mi aguja justo aquí abajo.

Y una vez que se inserte la aguja, voy a abrir el tubo IV para permitir que la solución salina fluya, y lo dejaré durante cinco a 10 minutos. Si la perfusión es buena, observará una decoloración del pulso rojo, la nariz roja y los ojos del ratón, por supuesto, lo que indica que la sangre está saliendo del cuerpo del ratón. Eso significa que la perfusión debería ser adecuada.

Aquí está el ratón tras la perfusión cardíaca. Como puede ver, la nariz, las orejas y los ojos de este ratón ya no son rosados ni rojos. Son completamente blancos, lo que indica que la perfusión funcionó correctamente.

Toda o la mayor parte de la sangre ha abandonado las manchas del ratón. Ahora que se ha realizado la perfusión cardíaca al ratón, debo cortarle la cabeza. Necesito decapitar al ratón.

Y para eso voy a utilizar equipo de laboratorio común. Ahora voy a extraer el cerebro de la rata. Voy a empapar todo el pelaje con etanol al 70 % para evitar que el pelo se disperse por todas partes.

Luego voy a retirar primero la piel. Y como no quiero utilizar el cerebro para histología, y lo voy a cortar en trozos pequeños, no tengo mucho cuidado en extraerlo de forma limpia. En una pieza, voy a insertar mis tijeras en la base del cráneo, donde el cerebro se conecta con la médula espinal justo aquí.

Y voy a cortar el hueso en cada lado y luego voy a retirar la parte superior. Y voy a hacer esto una y otra vez. Así queda el cerebro completamente expuesto.

Y como puede observarse, la perfusión funcionó bien porque el cerebro está completamente claro. En un animal no perfundido, se vería que la capa superior del cerebro estaría completamente cubierta con capilares rojos, capilares sanguíneos rojos, de modo que no se ven en absoluto, lo que indica que la perfusión fue exitosa. Ahora voy a extraer el cerebro, asegurándome de no dejar atrás el bulbo olfatorio, y lo colocaré en un tubo que contiene hielo llamado PBS.

Ahora, aún sin tener mucho cuidado en mantenerlo intacto, voy a colocar el cerebro en el tubo con PBS y voy a cortar los nervios ópticos; luego, usando una espátula, saldrá bastante fácilmente. Ahora voy a extraer la médula espinal de la misma rata. Y de nuevo, como vamos a cortarla en trozos pequeños, no voy a tener demasiado cuidado en extraerla de manera muy limpia, siempre que logre sacarla toda por completo.

Primero corto la piel a lo largo de la columna vertebral y aquí se hace visible la columna vertebral. Luego voy a retirar la carne aquí para que la columna vertebral quede expuesta por completo. Y justo aquí se puede ver la médula espinal.

Entonces, en un ratón, puedes cortar ambos extremos e inyectar PBS con la jeringa y la médula espinal saldrá casi entera. Pero en las ratas no es tan fácil. Tengo que abrirla y extraer la médula espinal con una espátula.

Ahora corto por ambos lados, y al igual que hice con el cerebro, corto y retiro el hueso para exponer la médula espinal. Y al igual que con el cerebro, la médula espinal es completamente blanca, lo que indica que la perfusión cardíaca funcionó bien. Y voy a hacer esto a lo largo de toda la columna vertebral.

Y bajo hasta aproximadamente el nivel de la cadera derecha, que es justo aquí. Luego, voy a usar unas pinzas, y esto no es muy estético, pero simplemente voy a extraer la médula espinal y colocarla en mi tubo con el cerebro. Ahora, en mi tubo, tengo tanto el cerebro como la médula espinal de la rata, y ahora estoy listo para preparar mi suspensión de células individuales.

Ahora estoy listo para preparar una suspensión de células individuales a partir de mi sistema nervioso central. Para ello, necesitaré una placa de Petri de 10 centímetros en la que colocaré un filtro de células de 70 micrones. También voy a utilizar el émbolo de una jeringa de un mililitro, así como pinzas y tijeras.

Así que voy a colocar mi muestra en el filtro celular y me aseguraré de que no quede nada en el tubo. Luego, voy a cortarla en trozos pequeños, tanto el cerebro como la médula espinal mezclados. Entonces, cuando todo esté finalmente picado, usaré el émbolo de la jeringa de Oneill y lo presionaré para hacerlo pasar a través del filtro.

Y verá progresivamente que el PBS fuera del entrenador de células se volverá más turbio a medida que las células individuales pasen a través. Si quisiera mi suspensión celular estéril, por supuesto que lo haría dentro de una cabina de cultivo de tejidos y no metería los dedos en ella. Entonces, ahora que el PBS está turbio, lo recogeré por primera vez y lo pondré en un tubo de 50 ml.

Pero también mantendré el control visual y voy a añadir más PBS a mi colador celular, y voy a presionar la muestra a través. Dado que el SNC contiene mucha grasa, es uno de los órganos que considero más difíciles para preparar una suspensión celular mediante esta técnica. He pasado todo mi SNC varias veces a través del colador celular y he recogido toda la suspensión de células individuales.

Y aquí está el tubo que llené hasta 50 ml con PBS que contiene mi suspensión de células individuales preparada a partir del SNC de la derecha. Ahora, voy a centrifugar este tubo para prepararlo para el gradiente, así que las células han terminado de centrifugarse. Tenemos un precipitado ahora, así que voy a desechar el sobrenadante y voy a resuspender mis células en 20 mililitros de percol al 30 % en PBS.

Y voy a superponerlo sobre 10 mililitros de perkel al 70 % en PBS para inducir la migración. Así que descarto el sobrenadante. Rompo el sedimento para asegurarme de que las células estén en suspensión simple y no en un agregado en el botón celular.

Ahora tengo mi suspensión de células del SNC en suspensión individual. Voy a suspender esas células en 20 mililitros de Percoll al 30 % en PBS, y voy a superponer esos 20 mililitros sobre 10 mililitros de Percoll al 70 % en PBS. Luego, voy a centrifugarlo.

Ahora voy a tomar mis 20 ml de suspensión del SNC y voy a superponerlos lentamente sobre la capa de percol al 70 % para facilitarlo. También se puede añadir un colorante como el rojo fenol en una de las capas, pero no estoy muy seguro de qué efecto tiene sobre las células, si es que tiene alguno. Por eso trato de evitarlo.

Debe avanzar lo suficientemente despacio para que las dos capas no se mezclen, de modo que no desee ninguna turbulencia importante en su capa inferior. Y a medida que la capa superior se vuelve más gruesa, puede avanzar más rápido. Ahora he añadido mis células al gradiente.

Entonces, la capa clara en la parte inferior es la capa de percol al 70 %, y la capa turbia en la parte superior es la capa de percol al 30 % que contiene mi suspensión de células individuales. Ahora voy a colocar este tubo en la centrífuga durante 20 minutos, y podré visualizar la capa de células monoculares si he trabajado bien. Así que ahora hemos terminado de centrifugar el gradiente.

Como siempre, al centrifugar un gradiente, tenga mucho cuidado en desactivar el freno para que no interrumpa el gradiente al desacelerar demasiado rápido. Ahora tenemos nuestras capas. En la parte superior del gradiente hay una capa de grasa que voy a eliminar para evitar contaminar mi suspensión celular.

Y en la interfaz entre las dos capas de percol al 30 y al 70 %, se observa que la interfaz no es nítida, sino difusa, y es precisamente ahí donde se encuentran las células. Una vez que haya eliminado las células, verá que la interfaz será mucho más definida. Así que voy a retirar la mayor parte de la grasa de la capa superior y simplemente colocarla en mi recipiente de desecho.

No necesito eliminar todo, pero quiero retirar suficiente para que no recubra completamente mi pipeta cuando baje a obtener las células monoculares. Ahora voy a utilizar otra pipeta de transferencia para llegar al nivel de la interfase y recolectar mis células. Así que ahora he recolectado varios mililitros en la interfase.

Así que probablemente tengo todas las células que podría obtener allí. El número de células monoculares en ese SNC fue realmente pequeño. Ahora tengo mis células mononucleares en el tubo.

Voy a llenar ese tubo hasta 50 ml con PBS, voy a centrifugar las células para sedimentarlas y eso va a eliminar la perla. Recomiendo lavarlas al menos un par de veces con un tubo completo de PBS para asegurarse de eliminar toda la perla. Luego, las células están listas para cualquier procedimiento que desee realizar con ellas.

Hoy les he mostrado cómo aislar células mononucleares del sistema nervioso central de ratas. Por supuesto, una vez que tienen esas células mononucleares, pueden purificarlas aún más para aislar, por ejemplo, linfocitos T de la población. Lo que voy a hacer con esas células es realizar un ensayo de citometría de flujo para detectar las poblaciones celulares que estaban en mi cerebro.

Buena suerte con su aislamiento celular.