Name: Paw-Arrastrar: una novela, Análisis sensible de la prueba Cilindro Ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-29T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Aprende a analizar el comportamiento de arrastre de pata en ratones mediante la prueba del cilindro para evaluar lesiones cerebrales focales. Este método sensible detecta déficits motores que los análisis tradicionales no identifican.

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Agradecemos al Sr. John Crowell y el Sr. Terry Upshall por su experiencia técnica y asistencia con la fotografía y videografía. Esta labor fue apoyada por las subvenciones de funcionamiento a JLV de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud y la Corporación de Investigación y Desarrollo de Terranova y un Corazón y fundación del movimiento de Canadá Asociación Canadiense para la concesión de Recuperación Stroke Catalyst. RBR era un receptor de un Keith Griffiths Memorial del corazón y derrame Fundación de Becas de Posgrado.

Declaración de Ética: Todos los experimentos fueron aprobados por la Universidad Memorial de Comité de Ética Animal Care de Terranova de acuerdo con las directrices del Consejo Canadiense de los Animales. 1. Los ratones <ol><li> Utilice ratones adultos. En este estudio, se utilizaron ratones macho adulto FVBN (n = 10) entre 2-4 meses. Los ratones en una hr 12:12 reverso del ciclo de luz-oscuridad y proporcionar comida para roedores estándar y agua ad libitum. </li></ol> 2. Los materiales requeridos para la Prueba de Cilindro <ol><li> Obtener una tabla con una tapa transparente para filmar la prueba cilindro. Las dimensiones de la mesa son irrelevantes, la parte superior debe ser de plexiglás o vidrio, y debe haber espacio suficiente para colocar un espejo por debajo de la mesa. Esto permite que para el ratón que se grabó en vídeo desde abajo. Use un espejo debajo de la tabla para reflejar la imagen a través del cilindro. Como alternativa, utilice una cámara al revés si está disponible. Las dimensiones de la mesa utilizados en este protocolo son 54 x 56 x 66.5cm (WxLxH) con un 51 x 51cm superior (ancho x largo). </li><li> Obtener un espejo. Las dimensiones del espejo utilizados en este protocolo son 34 x 58 cm (ancho x largo). </li><li> Obtener un cilindro transparente / plexiglás para el ratón para llevar a cabo. Las dimensiones del cilindro utilizados en este protocolo son 17.5cm de alto, 8,8 cm ID, 9.5cm diámetro exterior con un espesor de pared de 0.35cm. Un cilindro más alto puede ser necesario para las cepas de ratón más activos. </li><li> Coloque el cilindro en el tablero de la mesa y filmar el reflejo en el espejo de abajo. </li><li> Se requiere una cámara de vídeo y el trípode. Grabar videos en aproximadamente 650KB / s, que es de aproximadamente 190 MB por cada 5 min de vídeo cilindro. Asegúrese de que la cámara tiene una funcionalidad de zoom para asegurar que el cilindro abarca todo el campo de visión. NOTA: La cámara de vídeo utilizado en este protocolo es un Sony DCR-SR42, 40x zoom óptico, zoom digital 2,000x, 680kpix que utiliza la definición estándar, vídeo NTSC entrelazado). </li><li> Obtener software para el análisis - un pl mediosayer con el apoyo de vídeo y modulación velocidad de reproducción. El reproductor de medios utilizados en este protocolo es la v2.1.2 VLC Media Player. </li><li> Obtener un equipo con un sistema operativo capaz de ejecutar el reproductor multimedia y un monitor. </li><li> Se requiere el almacenamiento electrónico de videos. Descargar videos a un disco duro externo o copiarlo en DVD para el almacenamiento a largo plazo. NOTA: En 190 MB por vídeo, 84 sesiones caben en una tarjeta SD de 16 GB y 168 sesiones caben en una tarjeta SD de 32 GB. Debido al costo relativamente bajo de los medios SD, y la incertidumbre de cuánto tiempo algunos ratones requieren para completar 20 traseros, se recomienda una tarjeta de 32 GB. En el estudio actual, los videos fueron copiados de la cámara a un disco duro externo de 2 TB y luego vueltos a copiar en DVD como copia de seguridad. </li></ol> 3. Configuración experimental de la prueba del cilindro <ol><li> Fije espejo debajo de la mesa en un ángulo de 45 grados a la mesa. Haga esto utilizando dos soportes unidos a las patas de la mesa de Support la parte superior e inferior del espejo, respectivamente. Ubicaciones de los soportes se observan en una vista lateral de la mesa (Figura 1A) y una vista de cara de la tabla (Figura 1B). </li><li> Coloque cilindro en el centro de la mesa. Dibuje cuatro líneas equidistantes en el que el cilindro se sienta en la mesa con un marcador negro (Sharpie) de manera que el cilindro puede ser levantada y regresó a la misma posición (Figura 2). Dibujo ellos en la parte inferior de la mesa transparente permite que el tablero de la mesa a limpiar entre los ensayos con animales sin disolver la tinta de marcador. </li><li> Conecte la cámara y el trípode. Apunte la cámara hacia el espejo para que la imagen está mirando directamente a través del cañón del cilindro. Asegúrese de que la pared interior completa del cilindro es visible y sin obstrucciones por la base (Figura 3). Ver una vista lateral en de la configuración, incluyendo el ángulo relativo de la configuración de la cámara y el espejo, desde arriba (Figura 4A) y de lanivel de la mesa, incluyendo una cría de ratón (Figura 4B). </li><li> Prepare tarjetas de referencia para identificar cada ratón antes de la filmación. Asegúrese de que las tarjetas suelen incluir un número de identificación para cada ratón, el punto de tiempo de la prueba (por ejemplo., 3 ​​días después del tratamiento) y la fecha de la sesión de filmación. No incluya el grupo de tratamiento en la tarjeta de señal para garantizar el experimentador está cegado. </li><li> Se requiere de Cine en condiciones de iluminación interior estándar como este nivel de luz para ver claramente los movimientos del ratón alrededor del cilindro. NOTA: Si está disponible a filmar en la oscuridad con una cámara de luz roja puede ser suficiente, sin embargo, uno primero habría que probar si toca la pata y lastres son claramente visibles para la cuantificación. </li></ol> 4. Ejecución <ol><li> Comienza el rodaje. Mostrar la tarjeta de señal del ratón apropiada frente a la lente de la cámara. </li><li> Baje el ratón en el cilindro de la parte superior abierta inmediatamente después de la filmación de la tarjeta de señal. </li><li> Comienza el rodaje de ratón. Reducir al mínimo el ruido durante este tiempo, como los ratones pueden perder el interés en explorar si sobresaltada. </li><li> Observar la parte trasera ratones para explorar el cilindro. Capturar el vídeo hasta que el ratón realiza un mínimo de veinte partes posteriores. NOTA: Un trasera ocurre cuando ambas patas delanteras pierden el contacto con el suelo y el ratón se coloca en sus piernas traseras. </li><li> Limpie mesa y el cilindro con una solución de limpieza adecuada entre cada ratón para desinfectar y eliminar los olores de ratón. </li><li> La congelación es cuando los ratones dejan de explorar y permanecer tranquilamente sentado en cuatro patas durante aproximadamente 5 minutos. Si los ratones se congelan antes de que ocurran veinte partes posteriores, puede ser necesario para eliminarlos desde el cilindro durante 10-20 min antes de reanudar la prueba. Si los ratones no realizan veinte partes posteriores, se retiran del estudio. NOTA: En nuestra experiencia, los ratones nunca han necesitado ser excluido debido a un fallo de explorar el cilindro. </li></ol> 5. Evaluación de la prueba del cilindro usando la pata-ArrastrarAnálisis <ol><li> Reproduzca el vídeo a una velocidad de entre 0,25x y 0.67X velocidad regular dependiendo de la rapidez con el ratón explora el cilindro. Utilice un reproductor multimedia que ofrece velocidades de reproducción lentas. </li><li> Cuantificar el número total de toques pata. Toques de la pata se producen cuando las traseras de ratón (Figura 5A), toca el lado del cilindro (Figura 5B), posteriormente desmonta con ambas patas simultáneamente (Figura 5C) y tierras (Figura 5d). La pata puede o no puede ponerse en contacto con la pared del cilindro con una palma completa, pero algún tipo de contacto con la pared del cilindro debe ocurrir. Evaluar toques pata contando el número de veces que el ratón hace contacto (no importa cuán breve) con la pared del cilindro con una o ambas patas delanteras mientras está de pie sobre sus patas traseras durante una trasera. Tenga en cuenta que el contacto con la pared del cilindro solamente se cuenta como un &quot;toque la pata&quot; o &quot;pata-arrastre&quot; si el ratón está en una posición trasera - de pieen sus extremidades traseras con ambas patas delanteras fuera de la mesa. Si el ratón se mantiene en una postura de 3 puntos - ambos miembros posteriores y una pata de la mesa y se pone a tocar la pared con la pata libre - esto no se cuenta como un toque de la pata. Los ratones pueden trasero y tocar la pared del cilindro con una sola pata y esto se cuenta como un toque de la pata. Nota: un ratón también puede mover su cuerpo alrededor del cilindro durante una parte trasera, lo que hace más de dos contactos. Estos contactos se cuentan - uno para cada contacto pata izquierda y uno para cada contacto pata derecha. </li><li> Cuantificar el número de pata-arrastres. Comportamiento arrastrando la pata es distinta de toques normales pata. <ol><li> Si los contactos de la pata de la pared del cilindro con una palma abierta completa (Figura 6B), que poco a poco se apartarán de la pared, a menudo con un ligero temblor. El movimiento comienza con los dígitos arrastrando contra la pared del cilindro, ya sea en una dirección medial o hacia abajo, (Figura 6C) antes de caer lejos completely (Figura 6D). El ratón y luego desmontar con su pata afectada (Figura 6E) antes de aterrizar en cuatro patas (Figura 6F). Esto se considera una pata y arrastre y debe ser contada en un recuento. </li><li> Si la pata no hace contacto con la pared del cilindro con una palma totalmente abierta, se pastar la pared del cilindro con sus dígitos antes de caer fuera de la pared del cilindro. Del mismo modo, un ratón puede arrastrar su pata contra la pared del cilindro, pero no lo liberan por completo antes de desmontar. Estos se consideran tanto la pata-arrastra, así como toques y debe ser contada como tanto en un recuento. </li><li> La pata también puede arrastrar a lo largo de la pared del cilindro, mientras que un ratón explora el cilindro. En este caso, la pata seguirá la torsión del torso del ratón, ya que explora izquierda o derecha de su posición original (Figura 7A-D) antes de desmontar (Figura 7E). Esto no se considera una pata y arrastre, ya que depende del ratón elegir al azaruna dirección para explorar y no depende de que fue dañado hemisferio cortical. </li></ol></li><li> Paw-arrastres se expresan como un porcentaje de la pata-arrastra por número total de toques pata durante una sesión. Expresar el número de pata-drags como un porcentaje del total de contactos de la pata para cada extremidad anterior por separado. </li><li> Toques que resulta en una pata y arrastre cuentan como una pata y arrastre y un toque simultáneamente. Por lo tanto, si un ratón arrastra su pata cada vez que sus contactos pata la pared del cilindro, el porcentaje de la pata-arrastrando se expresa como 100%. </li></ol> 6. Otros Diseño Experimental Sugerencias <ol><li> Para reducir al mínimo las variables extrañas: <ol><li> Pruebe los ratones al mismo tiempo en cada día de pruebas. Prueba de los ratones durante su ciclo de estela. Mantener los ratones en un ciclo de luz de marcha atrás 12 horas facilita el rendimiento. </li><li> Los ratones pueden ser reacios a explorar el cilindro si hincapié ya sea por el ruido o un nuevo entorno. Prueba de ratones en su local de confinamiento o una habitación que han been familiarizado con reduce el estrés. Esto puede ocurrir si la habitación es ruidoso, si el ratón ha sido empujado antes de entrar en el cilindro o debido a la habituación. NOTA: La prueba debe realizarse una vez antes de la manipulación experimental para servir como una lectura de línea de base. Después de la manipulación, días de pruebas son a discreción del experimentador, aunque se aconseja de evitar un número excesivo de las exposiciones al cilindro en un corto período de tiempo. </li><li> Los ratones puede llegar a ser reacios a atrás después de 6-7 exposiciones al cilindro. Para el estudio actual, los ratones se pusieron a prueba en el cilindro para un total de siete veces, antes de la isquemia y en los días 1, 3, 7, 14, 21 y 28 después de la cirugía. NOTA: En este estudio se utilizó la cepa FVBN ratón. Hemos probado previamente ratones C57BL / 6 en el cilindro y el comportamiento de la pata-arrastrando observada después de una ET-1 lesión isquémica (datos no mostrados). C57BL / 6 ratones eran más activos que los ratones FVBN cuando la cría y con frecuencia saltaron sobre el borde del cilindroantes de subir a cabo. Taller cilindros se deben usar si los ratones intentan escapar saltando. </li></ol></li></ol> 7. La endotelina-1 Cirugía e infarto Medidas Volumen <ol><li> Realizar endotelina-1 cirugía y mediciones de volumen del infarto de acuerdo con los protocolos publicados previamente 4. Para dirigirse a la corteza motora de la extremidad anterior anterior, cada ratón debe recibir tres ET-1 inyecciones en las siguientes coordenadas: (i) 0,7 anteroposterior (AP) /1.5 medial-lateral (ml) / - 1,2 dorsal-ventral (DV), ( ii) 0,4 AP / 1,25 ml / - 1,2 DV y (iii) 0,1 AP / 1,75 ml / -1,2 DV 4. </li></ol> 8. Análisis estadístico <ol><li> Se recomienda una de dos vías para medidas repetidas análisis de varianza (ANOVA) para analizar el porcentaje de pata-arrastrando las patas para afectados y no afectados a través de diferentes puntos de tiempo. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen intereses financieros en competencia.

Los puntos clave para establecer la hora de cuantificar el comportamiento de la pata y arrastrando en la prueba del cilindro son los siguientes: i) cuantificar el número de pata-arrastra frente toques totales pata de cada pata antes de la lesión cerebral para establecer una línea de base; ii) cuantificar el número de pata-drags frente toques totales pata de cada pata después de la lesión isquémica; y iii) discriminar entre una pata y arrastre y el movimiento lateral de la pata a lo largo de la pared del cilindro durante...

El objetivo de las estrategias de regeneración neural es demostrar tanto la reparación de tejidos y la recuperación funcional. La recuperación funcional es típicamente evaluado con pruebas de comportamiento que miden los déficits funcionales, en este caso relacionado con las habilidades motoras que están asociados con el daño a las regiones específicas del cerebro. La lesión cerebral traumática o daño isquémico a la zona de la extremidad anterior de la corteza sensitivomotora se pueden demostrar por una serie de pruebas de comportamiento. Una de estas pruebas, la prueba del cilindro se utiliza ampliamente en ratas para evaluar los déficits funcionales en la actividad de la extremidad anterior 1. La prueba tiene un bajo coste de puesta a punto que requiere sólo un cilindro, una cámara y una mesa con una tapa transparente. Es fácil de administrar, ya que se basa en el comportamiento exploratorio natural de los roedores, por lo que no se requiere pre-entrenamiento y la privación de alimentos o recompensas. A pesar de estas numerosas ventajas, la prueba del cilindro se utiliza bajo-evaluar déficits extremidades anteriores en ratones después de lesiones focales en la extremidad anterior sensorimotor corteza, que atribuimos al análisis del comportamiento del ratón en la prueba de cilindro. Miembro Anterior asimetría es la medida clásica de análisis para la prueba del cilindro. Cuando se coloca en el cilindro, roedores exploran de forma natural las paredes del cilindro con la cría en sus patas traseras y tocando las paredes del cilindro con sus patas extremidades anteriores para mantener el equilibrio postural. El número de toques de la pata con la pared con cada extremidad anterior es fácilmente cuantificado por el rodaje de roedores durante esta exploración del cilindro. Asimetría extremidad anterior se produce cuando la extremidad anterior de la pata afectada hace menos toques con la pared de la extremidad anterior de la pata afectada y es indicativo de daño a la corteza sensitivomotora contralateral. En ratas, las inyecciones intra-corticales del agente vasoconstrictor, la endotelina (ET-1), en el córtex sensoriomotor extremidad anterior causa una lesión isquémica focal que resulta en déficits de comportamiento en la extremidad anterior contralateral. Las deficiencias en el uso de la extremidad anterior contralateral se detectan fácilmente como los cambios en forelimb asimetría en la prueba del cilindro en ratas 1-3. En contraste con las ratas sin embargo, los cambios en la asimetría de la extremidad anterior son variables y menos consistente en ratones después comparables ET-1 inyecciones 4-6. Aquí se demuestra una novela análisis del comportamiento del miembro anterior en la prueba de cilindro - análisis del comportamiento de la pata y arrastrando. Hemos demostrado previamente que el análisis de la pata-arrastrando es una medida más sensible de daño a la corteza sensitivomotora extremidad anterior en ratones que el análisis de la asimetría de la extremidad anterior clásica y por lo tanto es aplicable a una variedad de modelos de lesiones corticales focales. El examen de cómo los contactos patas delanteras la pared del cilindro después del daño isquémico a la corteza sensoriomotora extremidad anterior reveló un comportamiento novedoso en ratones - pata-4 arrastrando. Una pata de arrastre se produce cuando un ratón se coloca sobre sus patas traseras para explorar la pared del cilindro y luego arrastra su pata afectada (contraindicado lesional) a lo largo de la pared del cilindro hacia su línea media o hacia abajo, mientras que la paredsu pata afectada proporciona apoyo postural contra la pared. Paw-arrastra rara vez ocurre en los ratones lesionados por lo tanto, la aparición de una pata-resistencia es un indicador positivo de la lesión en la extremidad anterior sensoriomotoras corteza 4. Hemos cuantificado previamente comportamiento pata-arrastrando en ratones después de ET-1 daño isquémico a la corteza sensoriomotora extremidad anterior y han mostrado un comportamiento pata-arrastrando sostenida en ratones hasta dos semanas después del accidente cerebrovascular 4. Aquí nos muestran que el comportamiento de la pata-arrastre se mantiene hasta cuatro semanas después del accidente cerebrovascular. Análisis del comportamiento de la pata-arrastrando proporciona una nueva y sensible herramienta para evaluar el daño isquémico focal a la corteza sensoriomotora extremidad anterior en ratones. Su bajo costo de configuración, facilidad de administración y anotando hacen de esta una herramienta simple, pero útil para evaluar rápidamente los déficits conductuales extremidades anteriores en ratones.

<table><tbody><tr>Cilindro <td></td><td></td><td>de plexiglás</td><td>de 17,5 cm de altura, diámetro exterior de 9,5 cm, diámetro interior de 8,8 cm, espesor de la pared de 0,35 cm (o 3,5 mm)</td></tr><tr><td>mesa</td><td></td><td></td><td>de visualización 54x56x66,5 cm (ancho x largo x alto), la parte superior de la mesa es una lámina de plexiglás de 51x51 cm.</td></tr><tr><td>espejo</td><td></td><td></td><td>34x58 cm</td></tr><tr><td>espejo cámara de video</td><td>Sony</td><td>DCR-SR42</td><td>Cámara de video con almacenamiento interno, funcionalidad SD, computadora con zoom óptico de 40x</td></tr><tr><td>Dell</td><td></td><td>Optiplex 760</td><td>Procesador: Intel, 3.0 GHz, memoria 4.00GB (RAM)&nbsp;</td></tr><tr><td>monitor de ordenador</td><td>Samsung S22C350H</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel (Microsoft Office Professional Plus)</td><td>Microsoft</td><td>v14.0.7106.5003</td><td></td></tr><tr><td>VLC Media Player</td><td>Video LAN</td><td>v2.1.2</td><td>Reproductor multimedia con velocidad de reproducción, modulación y soporte de vídeo</td></tr><tr><td>Disco duro externo</td><td>Western Digital</td><td>WDBAAU0020HBK-01 2</td><td>TB</td></tr></tbody></table>

paw-arrastrar: una novela, análisis sensible de la prueba cilindro ratón

Paw-Dragging: a Novel, Sensitive Analysis of the Mouse Cylinder Test

La prueba de cilindro se utiliza rutinariamente para predecir el daño isquémico focal a la corteza motora de la extremidad anterior en roedores. Cuando se coloca en el cilindro, roedores explorar por la crianza y tocando las paredes del cilindro con sus patas extremidades anteriores de apoyo postural. Después de una lesión isquémica a la corteza sensoriomotora extremidad anterior, ratas dependen más de su pata extremidad anterior afectada por el apoyo postural resulta en un menor número de toques con su pata afectada que se denomina asimetría extremidad anterior. En contraste, el daño isquémico focal en el cerebro de ratón no resultar en déficits consistentes comparables en la asimetría de la extremidad anterior. Si bien el déficit de asimetría extremidad anterior se observan con poca frecuencia, los ratones no demuestran una novela derrame cerebral posterior comportamiento llamado &quot;pata-arrastre&quot;. Paw-arrastre es la tendencia de un ratón para arrastrar su pata afectada a lo largo de la pared del cilindro en lugar de empujar directamente fuera de la pared cuando el desmontaje de una parte trasera a una posición de cuatro patas. Hemos demostrado previamente quecomportamiento arrastrando la pata es muy sensible a pequeñas lesiones isquémicas corticales a la corteza motora de la extremidad anterior. Aquí le ofrecemos un protocolo detallado para el análisis de la pata y arrastrando. Definimos lo que una pata-de arrastre es y demostrar cómo cuantificar el comportamiento de la pata y arrastrando. La prueba del cilindro es una prueba sencilla y económica de administrar y no requiere de estrategias de privación de alimentos pre-entrenamiento o. En el uso de análisis de la pata-arrastrar con la prueba del cilindro, se llena un nicho para predecir lesiones isquémicas corticales como photothrombosis y endotelina-1 (ET-1) isquemia inducida - dos modelos que están cada vez más en popularidad y producen lesiones focales más pequeños de oclusión de la arteria cerebral media. Por último, medir el comportamiento de la pata y arrastrando en la prueba del cilindro permitirá que los estudios de la recuperación funcional después de una lesión cortical utilizando una amplia cohorte de cepas de ratones transgénicos, donde previo análisis de la asimetría de la extremidad anterior ha fallado en detectar déficits consistentes.

Hemos demostrado anteriormente que el comportamiento de la pata-arrastrando aparece después de una lesión isquémica focal a la corteza sensoriomotora extremidad anterior y es un indicador positivo de daños 4. Inyecciones intra-corticales de ET-1 en el córtex sensoriomotor extremidad anterior se utilizaron para inducir una lesión isquémica (Figura 8A, B). Este estudio examinó si el comportamiento de la pata-arrastrando extendió por más de 14 días después de la lesión para su uso potencial para...

Classical análisis de asimetría de la extremidad anterior de la prueba de cilindro se usa rutinariamente para evaluar los déficits de comportamiento en ratas después de la lesión cerebral o ictus; sin embargo, no puede detectar déficits consistentes en ratones. Este estudio demuestra que la cuantificación de comportamiento pata-arrastre es un análisis más sensible de la lesión cerebral en ratones.

Paw-Arrastrar: una novela, Análisis sensible de la prueba Cilindro Ratón

The cylinder test is routinely used to predict focal ischemic damage to the forelimb motor cortex in rodents. When placed in the cylinder, rodents explore ...

Hola, soy la Dra. Jackie Vander Loot. Hola, y mi nombre es Brian Room. Hoy discutiremos un análisis sensible de la prueba de arrastre de la pata en el cilindro.La prueba del cilindro es un test de la función motora de las cuatro extremidades en roedores. En esta prueba, los ratones exploran un cilindro de plexiglás erguyéndose y utilizando sus cuatro patas para mantenerse en postura contra la pared del cilindro. Examinar el uso de las cuatro patas mientras el ratón explora el cilindro nos permite determinar si presenta déficits motores.En concreto, comparamos el uso de cada pata anterior antes y después del accidente cerebrovascular. Tras un accidente cerebrovascular, la pata anterior contralateral al hemisferio lesionado se utiliza con menos frecuencia. Este cambio en el uso de la pata anterior afectada frente a la no afectada es una medida de la asimetría de las cuatro extremidades. Actualmente, el análisis de asimetría de las cuatro extremidades se utiliza en ratones y ratas tras lesiones isquémicas extensas, como la oclusión de la arteria cerebral media, como determinante conductual del accidente cerebrovascular. En contraste con lesiones grandes, no se observa asimetría en las cuatro extremidades en ratones con lesiones isquémicas focales pequeñas. Esto puede deberse a que el análisis de asimetría de las cuatro extremidades en la prueba del cilindro es sensible a lesiones extensas, pero no es útil para detectar lesiones más pequeñas.Las lesiones isquémicas focales pequeñas, como la foto-trombosis y la isquemia inducida por el endotelio, están volviéndose más populares en la mayoría de los modelos. Esto subraya la necesidad de ensayos conductuales funcionales para evaluar estas lesiones corticales menores. En mi laboratorio, Brian Room ha desarrollado un análisis novedoso del test del cilindro que denominamos arrastre de la pata.Al examinar cómo las cuatro patas del ratón entran en contacto con la pared del cilindro tras una lesión isquémica endotelial, observamos un comportamiento novedoso en la pata afectada. En ratones no lesionados, al levantarse, una pata que se arrastra entrará en contacto con la pared del cilindro ya sea con una sola pata o con ambas patas, mientras que el ratón apoya firmemente sus cuatro patas contra la pared para sostenerse durante la exploración, y luego utiliza sus patas para empujarse desde la pared. Al volver a la posición sobre las cuatro patas, tras una lesión isquémica endotelial, la pata afectada no proporciona un soporte firme a pesar de entrar en contacto con la pared del cilindro.En lugar de seguir el contacto, la palma se levanta y los dedos se arrastran a lo largo de la pared del cilindro antes de soltarse por completo. Este movimiento de arrastre de la pata ocurre ya sea con la pata moviéndose en dirección horizontal hacia la línea media del cuerpo o en dirección vertical hacia el suelo. Anteriormente hemos cuantificado el comportamiento de arrastre de la pata en ratones tras una lesión isquémica enphi uno y demostrado un aumento del comportamiento de arrastre de la pata por la extremidad afectada hasta dos semanas después de la isquemia.Además, nuestros datos mostraron que el comportamiento de arrastre de la pata se correlaciona con daño en la corteza motora. En este video, mostraremos cómo configurar la prueba del cilindro y analizar el comportamiento de arrastre de la pata en videos grabados. La prueba del cilindro es fácil de configurar y realizar, y tiene bajos costos operativos.Es necesario contar con una mesa que tenga un centro hueco, el cual está cubierto con una lámina de plexiglás. Esto nos permite grabar desde abajo. El cilindro de plexiglás se coloca sobre la superficie de la mesa.En la parte inferior de la superficie de la mesa, se dibujan cuatro líneas negras para indicar la posición del cilindro. Esto sirve como guía para que el cilindro pueda retirarse y reemplazarse entre los ensayos sin afectar su posición. En el marco del video también, las marcas se colocan en el reverso de la mesa de manera que limpiarla con etanol al 70% no borre la tinta.Para filmar al ratón desde abajo utilizando una cámara y un trípode, incluimos un espejo en un ángulo aproximado de 45 grados debajo de la superficie de la mesa. Esto nos permite evitar las complicaciones de construir un aparato separado para sostener la cámara en su lugar debajo de la mesa. El espejo se mantiene en posición con soportes de sujeción como se muestra aquí y aquí.El tamaño de los soportes y el tamaño del espejo dependerán de las dimensiones del espacio entre las patas de la mesa. La cámara y el trípode se colocan a una distancia tal que toda la pared del cilindro pueda verse en el campo de visión. Esta distancia generalmente no es mayor a unos pocos pies, pero puede variar según el ángulo del espejo, la altura del trípode y las capacidades de zoom de la cámara.Para realizar la prueba, se colocan los ratones desde la parte superior del cilindro antes de comenzar la grabación. Se utilizan tarjetas indicadoras para señalar qué ratón está realizando la prueba. Esto puede incluir el número del ratón o un nombre clave, de modo que la persona que evalúe los videos del cilindro permanezca ciega respecto al tratamiento.La fecha de grabación y el número de ensayo también pueden incluirse en la tarjeta. Se filma a los ratones hasta que hayan realizado 20 erguidos. Para que se cuente de esta manera, ambos patas deben abandonar el suelo; los erguidos en los que no se cumpla esto no se cuentan.Si el ratón toca la pared con una pata mientras la otra permanece en el suelo, los videos del cilindro se analizan utilizando el reproductor multimedia VLC. Aunque cualquier reproductor multimedia con modulación de velocidad de reproducción sería adecuado para usar, los arrastres de patas pueden contarse mediante conteos mecánicos o escribiendo un registro en papel. Registramos los conteos en papel y posteriormente transferimos los datos a una hoja de cálculo.Reproducción del video a 0,5 veces la velocidad normal. Se recomienda esta velocidad para poder contar de manera efectiva. En ocasiones, puede ser necesario pausar y repetir a una velocidad más baja.Téngase en cuenta que un ratón también puede mover su cuerpo alrededor del cilindro durante una elevación, realizando más de dos contactos. Estos contactos se contabilizan, uno por cada contacto del pata delantera izquierda y uno por cada contacto del pata delantera derecha. Los arrastres de la pata se cuentan como un porcentaje del número total de contactos de la pata con la pared del cilindro. Para cada pata, los contactos se evalúan contando el número de veces que el ratón toca la pared del cilindro con una o ambas patas delanteras.Téngase en cuenta que un ratón también puede mover su cuerpo alrededor del cilindro durante un levantamiento, realizando más de dos contactos. Estos contactos se cuentan, uno por cada toque de la pata delantera izquierda y uno por cada toque de la pata delantera derecha. La cuantificación del comportamiento de arrastre de la pata es distinta de la cuantificación de los toques normales de la pata; el arrastre de la pata puede ocurrir con un arrastre vertical o un arrastre horizontal de la pata.Arrastrar a menudo implica un ligero temblor en la pata afectada cuando se separa de la pared del cilindro, lo que sugiere debilidad y falta de control motor. Con frecuencia se observan variaciones del arrastre estereotípico de la pata en la pata afectada. Un ejemplo es un arrastre incompleto de la pata, en el que la palma se levanta pero los dedos se arrastran contra el cilindro, aunque ambas patas finalmente pierden contacto con la pared al mismo tiempo. Al evaluar el comportamiento de arrastre de la pata, es importante no confundir el movimiento exploratorio lateral del ratón alrededor del cilindro con un déficit en la función motora de las cuatro extremidades.Durante la exploración lateral, el ratón se mueve lateralmente alrededor del cilindro y la pata trasera sigue la dirección del torso del ratón. Por ejemplo, el ratón se encarama y toca la pared con ambas patas, reposiciona una de sus patas y luego se desplaza lateralmente hacia la pata reposicionada. Cuando esto ocurre, las patas traseras se arrastran entonces a lo largo de la pared hasta que se vuelven a colocar para brindar soporte.El giro del torso del ratón es otra señal de comportamiento exploratorio lateral. Este comportamiento es claramente diferente al arrastre de la pata, ya que el arrastre de la pata no implica movimiento lateral alrededor de la pared del cilindro durante o inmediatamente antes del arrastre. Nuestros estudios han examinado el arrastre de la pata tras una lesión isquémica focal pequeña en la corteza motora de las cuatro extremidades.Aquí mostramos que el comportamiento de arrastre de la pata con los cuatro picos P afectados alcanza un máximo a un día después del accidente cerebrovascular y disminuye a los siete días posteriores al accidente cerebrovascular, momento en el cual se estabiliza y permanece elevado hasta cuatro semanas después del accidente cerebrovascular, ya que el déficit parece ser prolongado. Esto permitirá a los investigadores estudiar los efectos del accidente cerebrovascular crónico tras una lesión cortical pequeña. Además, los tratamientos para el accidente cerebrovascular pueden estudiarse a corto o largo plazo en ratones con lesiones corticales pequeñas.Nuestro nuevo análisis de arrastre de PO en la prueba celular tiene potencial como ensayo conductual para el accidente cerebrovascular isquémico focal en ratones, como los inducidos por foto-trombosis o endofilina. Uno en ratones con lesiones como la oclusión de la arteria cerebral media, donde la asimetría lam ocurre la mayor parte del tiempo. El arrastre de POD puede utilizarse para determinar la magnitud de lesiones más pequeñas y similares.Los experimentos con arrastre de pod se elevan hasta 28 días posteriores al accidente cerebrovascular. Tiene potencial para ser utilizado en diversos estudios de tratamiento del accidente cerebrovascular a corto y largo plazo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Behavior

Comportamiento

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El grano y Pruebas de Manejo de Capellini: Simple medidas cuantitativas de la función de las patas delanteras diestro en ratas y ratones

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