Name: Medio Ambiente Microfluidic controlada de Investigación Dinámica de agregación de glóbulos rojos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Aprende a cuantificar agregados de glóbulos rojos en microcirculación usando técnicas de microfluídica y procesamiento de imágenes. Este método permite estudiar la dinámica del flujo sanguíneo bajo tasas de corte controladas.

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Este trabajo fue apoyado por las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá. Microfabricación se realizó con el apoyo de la instalación McGill nanoherramientas Microfab en la Universidad McGill y el Departamento de Electrónica de la Universidad de Carleton.

La sangre se recoge de los individuos sanos, con la aprobación del comité de ética de la Universidad de Ottawa (H11-13-06). 1. Microchannel Fabrication Los microcanales son fabricados en base a los métodos estándar de fotolitografía 18. <ol><li> Diseñar la geometría microcanal utilizando un diseño (CAD) asistido por ordenador e imprimir la configuración en una transparencia foto-máscara. Estas máscaras son cruciales ya que dictan la trayectoria de la luz durante el proceso de fabricación. En este caso, las dimensiones de microcanales son 120 micras de espesor, 60 micras de profundidad y 7 mm de longitud. </li><li> En una sala blanca, capa giro un epoxi basada negativo fotorresistente sobre una oblea de silicio a 2000 rpm durante 30 segundos para obtener la profundidad deseada microcanal (60 micras). </li><li> Exponer la oblea y la foto-máscara bajo una lámpara UV a 650 mJ / cm 2 para 70 seg. Asegurar para exponer sólo las áreas transparentes de lafoto-máscara a la luz UV. La exposición de las áreas transparentes permite para la polimerización de las cadenas resultantes en un endurecimiento de la foto-resistir. Sumergir la pieza de silicio en un desarrollador para eliminar el exceso de foto-resistencia. </li><li> Una vez que el molde se fabrica, mezclar un elastómero a base de silicio y un agente de curado en una proporción de 10: 1 para crear una solución de poli-dimetil-siloxano (PDMS). Ponga la solución de PDMS en una cámara de vacío para desgasificar. Vierta en el molde y se calienta a 60 ° C durante 90 min para crear microcanales. Luego unir los canales individuales a un portaobjetos de vidrio utilizando oxígeno unión de plasma durante 90 segundos. Nota: El proceso de PDMS desgasificar se lleva a cabo con el fin de eliminar las burbujas de aire generadas por el proceso de mezcla. </li><li> Asegúrese de que las dimensiones microcanales permiten pruebas con éxito. En este protocolo, los microcanales tienen una sección transversal rectangular de 120 x 60 m. En comparación, un RBC promedio tiene un diámetro de 8 micras y un espesor de 2 micras. Losrefore, el ancho de microcanales es suficiente para observar la agregación adecuada y determinar con precisión los perfiles de velocidad. </li></ol> 2. Preparación de Sangre <ol><li> Recoger la sangre de donantes voluntarios sanos, después de la aprobación de un comité de ética. Tratar la sangre con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) presente en los tubos de recogida (7,2 mg de EDTA en 4 ml de sangre). NOTA: El EDTA se utiliza para evitar la coagulación de la sangre. </li><li> Centrifugar las muestras de sangre tres veces durante 10 min a 1.400 xg (3.000 rpm) con el fin de separar los constituyentes de la sangre. Como resultado de la centrifugación, observar tres capas distintas. NOTA: Las tres capas son la capa de RBC (situado en la parte inferior del tubo), la capa leucocitaria (que consiste en células blancas de la sangre y plaquetas situadas en la parte superior de la capa de RBC) y la capa de plasma (que se encuentra en la parte superior de todos los demás constituyentes). <ol><li> Después de la primera centrifugación, recoger plasma de sangre usando una pipeta de sangre. Evite cualquier contacto con la capa leucocitaria. </li><li> Recoger y disponer de la capa leucocitaria en un recipiente con lejía diluida al 10%. </li><li> Añadir 3 ml de PBS pH 7,4 a cada uno de los tubos con la capa de RBC restante y garantizar el equilibrio apropiado de la centrífuga. Mezclar suavemente los tubos de centrífuga y una vez más en 1.400 xg (3.000 rpm) durante 10 min. NOTA: Asegúrese de que la solución de PBS no contiene magnesio o calcio ya que podrían alterar la adhesión celular. </li><li> Deseche la PBS en los tubos después de la segunda centrifugación y retire la capa leucocitaria restante si está presente. Repita los pasos 2.2.3 y 2.2.4 para la tercera centrifugación para producir glóbulos rojos limpios. </li></ol></li><li> Mezclar la cantidad requerida (0,05, 0,1 y 0,15 ml) de los glóbulos rojos limpias con plasma (0.95, 0.9 y 0.85 ml) en un tubo de 1 ml a fin de obtener RBC-suspensiones con el correspondiente (5%, 10% y 15% ) hematocrito. Compruebe hematocritos con una microcentrífuga. </li></ol> 3. Líquidos Preparación <ol><li> Añadir 60 l de la solución de partículas de trazador fluorescente (1% sólido, partícula d = 0. 86 m, λ = 542 nm abs y emisión λ = 612 nm) en los tubos de suspensión RBC-1 ml. NOTA: Las partículas de trazador fluorescente (teñidos internamente partículas de poliestireno) se utilizan para medir la velocidad del flujo dentro del microcanal. Estas partículas son fluorescentes cuando se exponen a la longitud de onda correspondiente del haz de láser (λ = 542 nm). </li><li> Preparar una solución de PBS pH 7,4 y añadir 60 l de la misma solución de partículas de trazador fluorescente en 1 ml de la solución de PBS. </li></ol> 4. Agregados Tamaño Mediciones <ol><li> Para insertar los fluidos (RBC-suspensiones y PBS) en el microcanal, utilice dos jeringas de vidrio de 25 ly 100 l. Esto haráayudar a reducir el cumplimiento del sistema. Conecte los microcanales a las jeringas a través de tubos y conectores encajan los orificios de entrada. Llenar las jeringuillas de vidrio utilizando la diferencia de presión existente entre el recipiente de fluido y la jeringa. Asegúrese de que no hay burbujas presentes en el sistema. Como un método alternativo, utilizar un sistema de presión controlada para conducir ambos fluidos en el microcanal. </li><li> Coloque el microcanal en un escenario microscopio invertido conectado a una cámara de alta velocidad y un sistema μPIV. La bomba de jeringa a los caudales deseados (por ejemplo, Q = 2 l / h para la sangre engendrar un caudal de Q = 8 l / h para PBS) Programa. NOTA: sólo se utiliza una bomba de jeringa. El uso de dos jeringas de vidrio diferentes, con dos diámetros internos diferentes, es posible variar el caudal que entra en cada rama de la Y-microcanal. </li><li> Inserte los dos fluidos en el doble Y-microcanal cada uno de una rama de entrada diferente y en diferentes caudales como se muestra en <strong&gt; Figura 1. Con el fin de probar diferentes velocidades de cizallamiento, cambiar el caudal de la bomba. Esto mantiene la misma proporción adecuada (4 en este caso) entre las dos ramas 19 (Figuras 2 y 3). Espere a que el flujo de alcanzar el estado de equilibrio antes de la adquisición de las mediciones: inspeccionar visualmente las imágenes de la cámara de alta velocidad para un flujo suave. NOTA: La relación es crucial en la obtención de un perfil de velocidad lineal dentro de la capa de sangre. </li><li> Visualice los glóbulos rojos con la cámara de alta velocidad. Conecte la cámara a un ordenador para controlar, registrar y guardar las imágenes del flujo de fluido. Una vez que los dos flujos de fluidos alcanzan el estado de equilibrio, iniciar la grabación. <ol><li> Adquirir varias imágenes para mejores resultados del tratamiento. Determine un tiempo de exposición de la cámara óptimo para una imagen clara de los agregados. NOTA: El tiempo de exposición de la cámara para este caso fue de 0,5 mseg. La elección del intervalo de tiempo entre cada trama se basa en la velocidad de cuadros de la cámara y la velocidad de flujo en tque microcanal. El tiempo entre cada fotograma procesado en este procedimiento fue de 60 mseg. Por lo tanto una cámara capaz de grabar 18 fotogramas por segundo es suficiente. NOTA: Evite el asentamiento de sangre en el tubo y la jeringa, lo que podría conducir a mediciones erróneas. </li></ol></li><li> Usando técnicas de procesamiento de imágenes (un programa MATLAB en este caso) para mejorar la calidad de la imagen, detectar los agregados en cada una de las imágenes sobre la base de intensidades de los píxeles (ilustrados en la Figura 4) como sigue: <ol><li> Mejorar las imágenes contrastan con el método de ecualización del histograma para obtener una mejor calidad de imagen para cada cuadro. </li><li> Convertir las imágenes en escala de grises en imágenes binarias. Para este propósito, establecer un valor umbral, que van desde 0 a 1, que dicta la conversión de cada píxel. Cualquier píxel en la imagen debajo del valor umbral será detectado como un píxel negro, mientras que los píxeles con valores mayores que el umbral serán detectados como píxeles blancos. </li><li> Llenar elagujeros (si está presente y necesario) que corresponden a las lagunas dentro de un agregado para obtener mejores resultados. </li><li> Detectar las células mediante la determinación de vecinos píxeles blancos en la imagen binaria de modo que las células adyacentes están asociados como agregados. </li><li> Etiquetar los diferentes agregados detectados y convertir la imagen binaria en una imagen verde-azul-rojo (RGB) para una mejor visualización. Combinar los fotogramas originales con cada una de las correspondientes imágenes procesadas para verificar la eficiencia de la técnica de procesamiento de imagen y asegurar que todas las células se toman en consideración, como se muestra en la Figura 5. Realice los pasos 4.5.1, 4.5.2, 4.5.3 , 4.5.4 y 4.5.5 para todas las tramas capturadas. </li><li> Calcular el área de cada agregado detectado en el marco basado en el número de píxeles detectados. Sobre la base de la ampliación de la lente utilizada, calcular el factor de conversión, utilizando una retícula de calibración, y convertir los resultados a 2 micras. La media de los tamaños de los agregados detectadas en cadamarco y luego un promedio de los resultados para todos los marcos para obtener el tamaño total promedio para cada grabación de RBC-suspensiones. </li><li> Calcular el área de un RBC para determinar un número representativo estimado de glóbulos rojos dentro de cada agregado detectado. El uso de estos resultados, calcular la distribución del porcentaje de glóbulos rojos dentro de cada agregado como una función de los tamaños de los agregados (representados por el número estimado de células en cada agregado), como se muestra en la Figura 6. NOTA: Para medir los agregados de RBC, el software ImageJ podría ser utilizado (en lugar de MATLAB) para realizar las mismas tareas en cada fotograma. </li></ol></li></ol> 5. velocidad del fluido y Shear Puntúa Mediciones Determinar la velocidad del fluido y por lo tanto la velocidad de cizallamiento utilizando un sistema de μPIV. <ol><li> Una vez que los datos se adquiere mediante la cámara de alta velocidad, cambiar a la cámara de doble pulsado utilizado para el sistema μPIV. Utilice un software de imagen para una imagen acquisition del flujo y el procesamiento de imágenes para la determinación de campo de velocidad. </li><li> Tome todas las precauciones necesarias, en función de la clase de láser, antes de encender el láser. A continuación, encienda el sistema, la cámara y el láser. </li><li> Calibrar la cámara basada en la ampliación del objetivo utilizado. Para este propósito, utilizar una microescala de 10 micras de precisión bajo el microscopio y establecer el tamaño de 1 pixel en la imagen. </li><li> Inicie el láser y visualizar las partículas en ambos fluidos. Encuentra el plano medio de los microcanales, centrándose en las partículas más rápidos del caudal (es decir, las partículas más rápidas deben ser el más brillante). </li><li> Ajuste el dt (intervalo de tiempo entre dos tramas consecutivas) para garantizar el desplazamiento adecuado de la partícula. Las partículas más rápidas deben moverse aproximadamente 5 a 10 pixeles entre ambas imágenes. </li><li> Comienza la grabación del flujo. Ajuste el software para adquirir 100 pares de imágenes, 5 ms de diferencia. Realice los pasos 5.4, 5.5 y 5.6 para toda la difdife- RBC-suspensiones y para diferentes velocidades de cizallamiento. NOTA: Más detalles de la metodología se dan en el estudio de Pitts y Fenech 20. </li><li> Procesar las grabaciones adquiridos utilizando el método de correlación cruzada con el software de imágenes. NOTA: Este consiste en discretizar el par de imágenes en ventanas pequeñas de tamaño predeterminado (basado en el flujo de fluido y el intervalo de tiempo elegido por el usuario) llamado ventanas de correlación y siguiendo el desplazamiento de las partículas en cada ventana. <ol><li> En primer lugar, determinar si las imágenes adquiridas requieren pre-tratamiento (incluida la sustracción de fondo, &quot;base-clipping&quot; 21 o una imagen superpuestos 22,23) para un mejor tratamiento de la información. </li><li> A continuación, seleccione el tamaño y la forma de la ventana de correlación, así como del porcentaje de imágenes superpuestas. Un estudio detallado se realizó por Pitts et al. 24 para determinar los parámetros óptimos y las técnicas de pre-procesamiento de imagen para la sangrefluir en diferentes configuraciones de canal. Exprese los resultados como un campo de velocidad media calculada a partir de los pares de 100 imágenes y el error cuadrático medio (RMS) de la velocidad. </li></ol></li><li> Extraer un perfil de velocidad en la salida del canal, a partir de los datos procesados ​​como se muestra en la Figura 7. Para un mejor perfil, promediar el campo de velocidad en el espacio. NOTA: Las barras que componen el perfil de velocidad se corresponde con el tamaño de la ventana de correlación elegido con relación a la anchura del canal. También se muestra el error RMS de la velocidad en la Figura 7, que representa el error en la estimación experimental velocidad. </li><li> Apague el láser una vez que se llevan a cabo todas las medidas y el procesamiento ,. Apague todos los componentes del sistema: software, cámaras, fase móvil, computadoras y láser. </li><li> Para calcular la velocidad de cizallamiento, primero detectar y estimar el espesor de la sangre en los microcanales en función de la grabación de la cámara de alta velocidad. Para este propósito, promedio Todoslos fotogramas de la grabación específica para obtener una imagen de fondo del vídeo. Delimitar la capa de sangre (como se muestra en la Figura 8 para los RBC-suspensiones que fluye a 10 l / hr cuando se suspenden en 5%, 10% y 15% de hematocrito). Obtener el valor de velocidad para el espesor de la capa de sangre correspondiente y calcular la velocidad de cizallamiento dividiendo el valor de la velocidad por el espesor de la capa de sangre. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Utilizando la presente metodología, es posible analizar cualitativa y cuantitativamente el RBC agregados bajo diferentes condiciones de flujo y hematocritos. Para las pruebas de éxito y la detección agregada, es crucial para determinar la relación de velocidad apropiada entre los dos fluidos en la entrada de microcanal. Esta relación es muy importante para obtener un espesor de capa de sangre óptimo donde el perfil de velocidad es casi lineal 19. Otro factor clave para la prueba c...

An erratum was issue for <a href="http://www.jove.com/video/52719">Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation</a>. The introduction section was updated.

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Erratum: Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Glóbulos rojos (GR) juegan un papel crucial en la determinación del comportamiento reológico de la sangre. Son casi singularmente responsable de las propiedades particulares de la sangre in vitro e in vivo. En condiciones fisiológicas, los glóbulos rojos ocupan 40% a 45% del volumen de sangre. En la microcirculación, los glóbulos rojos solamente ocupar hasta el 20% del volumen de la sangre debido a diámetros de los vasos más pequeños y el efecto plasma 1 descremado. Este fenómeno de reducción de plasma en la microcirculación se conoce como el efecto Fåhraeus. A bajas velocidades de cizalla, los glóbulos rojos son capaces de tender un puente juntos y formar uno dimensional o estructuras tridimensionales denominadas &quot;rouleaux&quot; o agregados, por lo tanto, contribuir al comportamiento no newtoniano de la sangre. Sin embargo, el mecanismo de la agregación de RBC no se entiende completamente. Existen dos teorías para modelar la agregación de glóbulos rojos: el puente de la teoría de las células debido a la reticulación de las macromoléculas 2 y la fuerza attracla teoría de la causada por el agotamiento de las moléculas debido al gradiente osmótico 3. Típicamente, para la sangre humana, los agregados forman a velocidades de cizallamiento muy bajas 4 que van de 1 a 10 seg -1. Por encima de este rango, los glóbulos rojos tienden a desagregar y fluir por separado dentro del recipiente. La comprensión de las condiciones de la formación de agregados es de una gran importancia para el campo Hemorreología en términos de definir el comportamiento reológico de la sangre. Estos agregados se ven a menudo en el nivel macrocirculation (&gt; 300 m de diámetro) 5. A esta escala, la sangre se considera como un fluido newtoniano y una mezcla homogénea. Sin embargo, estos agregados se ven raramente en el nivel capilar (4-10 micras de diámetro) y son por lo general una indicación de condiciones patológicas tales como la diabetes y la obesidad 6. Otras condiciones patológicas que podrían cambiar la agregación de glóbulos rojos incluyen condiciones inflamatorias o infecciosas,enfermedades cardiovasculares tales como hipertensión o aterosclerosis, trastornos genéticos y las enfermedades crónicas 7. Por lo tanto, la comprensión del mecanismo de agregación de RBC y análisis de estas entidades (mediante la definición de una relación entre el tamaño de estos agregados y las condiciones de flujo) podría conducir a la comprensión del comportamiento microrheological de la sangre y por lo tanto relacionarlo con aplicaciones clínicas. Agregados de glóbulos rojos pueden ser alterados por diversos factores tales como el hematocrito (volumen de glóbulos rojos en la sangre), la velocidad de cizallamiento, el diámetro del vaso, la rigidez de la membrana RBC y la composición de medio de suspensión 8-10. Por lo tanto, se requieren condiciones controladas con el fin de analizar de forma eficaz los agregados de glóbulos rojos. Varios métodos son capaces de analizar la formación de agregados al proporcionar mediciones de agregación estáticos (índice de agregación) que ofrece información relevante sobre el comportamiento de la sangre. Estos métodos incluyen, entre otras cosas, la velocidad de sedimentación globularmétodo 11, el método de transmisión de la luz 12, el método de reflexión de la luz 13 y el método de la viscosidad de baja cizalladura 14. Pocos estudios han tratado de estudiar la agregación de glóbulos rojos y determinar el grado de agregación en condiciones de flujo controladas 15-17. Sin embargo, estos estudios investigan indirectamente RBC tamaños de agregados mediante la determinación de la proporción de espacio ocupado en un sistema de cizallamiento medido basado en imágenes microscópicas de sangre que proporcionan información sobre el grado de agregación, así como la viscosidad local. Por lo tanto, presentamos un nuevo procedimiento para cuantificar directamente RBC agregados en la microcirculación, de forma dinámica, bajo velocidades de cizallamiento controladas y constantes. RBC-suspensiones son arrastradas, en una doble Y-microcanal (como se ilustra en la Figura 1), con una solución tampón fosfato salino (PBS) por lo tanto la creación de un flujo de cizallamiento en la capa de sangre. Dentro de esta sangre capa un karité constantetasa r puede ser obtenida. Los RBC-suspensiones se ensayaron a diferente hematocrito (H) niveles (5%, 10% y 15%) y bajo diferentes velocidades de cizallamiento (2-11 seg -1). La velocidad de la sangre y la velocidad de cizallamiento se determinan mediante un sistema de micro Velocimetría imágenes de partículas (μPIV), mientras que el flujo se visualizaron utilizando una cámara de alta velocidad. Los resultados obtenidos se procesan entonces con un código MATLAB basado en las intensidades de imagen con el fin de detectar los glóbulos rojos y determinar tamaños de agregados.

<table><tbody><tr><td>SU8-50 negativo a base de epoxi Foto-resistente</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desarrollador de SU8-50</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poli(dimetilsiloxano) (PDMS) Sylgard-184</td><td>Dow-Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>PE-50 series Sistema de plasma&nbsp;</td><td>Grabado por plasma</td><td>serie</td><td></td>PE-50</tr><tr><td>Tubos de extracción de sangre con K2-EDTA (ácido etilendiaminotetraacético)</td><td>Centrífuga B367861</td><td></td><td></td>FisherSci</tr>, <tr><td>i.e. Thermo Scientific CL2</td><td>Thermo Scientific</td><td>004260F</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada Poshpate (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Tracer fluorescente solución de partículas (15 ml)</td><td>FisherSci</td><td>R800</td><td></td></tr><tr><td>Aggregometer</td><td>RheoMeditech</td><td>Rheo Scan AnD300</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas de vidrio (50 y micro; l)</td> <td>Hamilton</td><td>80965</td><td></td></tr><tr><td>Tubing (Tygon)</td><td>FisherSci</td><td>AAA00001</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de alta velocidad (Basler)</td><td>Graftek Imaging Inc.</td><td>basler acA2000-340km</td><td>Se podría utilizar una cámara capaz de grabar 18 fotogramas por segundo.</td></tr><tr><td>Cámara de doble pulso&nbsp;</td><td>LaVision</td><td>Imager Microscopio Intenso</td><td></td></tr><tr><td>MITAS</td><td>LaVision</td><td>MITAS</td><td></td></tr><tr><td>Láser Nd:YAG</td><td>New Wave Research</td><td>Solo-II</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de jeringa (Nexus3000 y PicoPlus)</td><td>Chemyx Inc. y Harvard Apparatus</td><td>Nexus3000 y PicoPlus</td><td></td></tr><tr><td>DaVis software</td><td>LaVision</td><td>Davis</td><td></td></tr></tbody></table>

medio ambiente microfluidic controlada de investigación dinámica de agregación de glóbulos rojos

Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

La sangre, como biofluido no newtoniano, representa el foco de numerosos estudios en el campo Hemorreología. Constituyentes de la sangre incluyen glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas que se encuentran suspendidas en el plasma sanguíneo. Debido a la abundancia de los glóbulos rojos (40% a 45% del volumen de sangre), su comportamiento dicta el comportamiento reológico de la sangre especialmente en la microcirculación. A velocidades de cizallamiento muy bajas, los glóbulos rojos se ven de montar y entidades forma llamada agregados, lo que provoca el comportamiento no newtoniano de la sangre. Es importante entender las condiciones de la formación de agregados de comprender la reología de la sangre en la microcirculación. El protocolo descrito aquí detalla el procedimiento experimental para determinar cuantitativamente los agregados de glóbulos rojos en la microcirculación bajo velocidad de cizallamiento constante, basado en procesamiento de imágenes. Para este propósito, RBC-suspensiones se prueban y se analizaron en microcanales 120 x 60 micras de poli-dimetil-siloxano (PDMS). Los RBC-suspensiones son entllovió usando un segundo fluido con el fin de obtener un perfil de velocidad lineal dentro de la capa de sangre y así lograr una amplia gama de velocidades de cizalladura constantes. La velocidad de cizallamiento se determina usando un sistema de micro velocimetría por imágenes de partículas (μPIV), mientras que los agregados de glóbulos rojos se visualizaron utilizando una cámara de alta velocidad. Los vídeos capturados de los agregados de glóbulos rojos se analizaron utilizando técnicas de procesamiento de imágenes con el fin de determinar los tamaños de los agregados basados ​​en las imágenes de intensidades.

Un ejemplo del flujo de dos fluidos en la doble Y-microcanal se muestra en la Figura 2 para los glóbulos rojos humanos en suspensión en 5%, 10% y 15% de hematocrito y que fluye a 10 l / hr. La Figura 3 muestra la diferencia en tamaños de agregados cuando el flujo en el canal se reduce de 10 l / hr a 5 l / h para un hematocrito de 10%. Esto da una idea cualitativa de los tamaños de los agregados cuando se varía el hematocrito y la velocidad de cizallamiento. La figura 5 ...

El protocolo describe los detalles de un procedimiento experimental para cuantificar de glóbulos rojos (RBC) agregados bajo un régimen de cizalladura controlada y constante, basado en técnicas de procesamiento de imágenes. El objetivo de este protocolo es relacionar tamaños de agregados de glóbulos rojos a la velocidad de cizallamiento correspondiente en un entorno controlado de microfluidos.

Medio Ambiente Microfluidic controlada de Investigación Dinámica de agregación de glóbulos rojos

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar directamente los agregados de glóbulos rojos en la microcirculación, de forma dinámica y bajo tasas de cizallamiento controladas y constantes. Esto se logra primero entrenando suspensiones de glóbulos rojos y un microcanal doble en Y con una solución de tampón salino fosfato, creando una cizalladura constante en la capa sanguínea. El segundo paso consiste en visualizar y grabar el flujo mediante una cámara de alta velocidad.A continuación, utilice técnicas de procesamiento de imágenes para procesar la grabación y obtener un tamaño promedio de agregado y la distribución del tamaño de los agregados en el microcanal. El paso final consiste en determinar la velocidad sanguínea siguiendo el desplazamiento de partículas fluorescentes inyectadas en el microcanal entre dos cuadros consecutivos. En última instancia, la tasa de cizalladura en el microcanal se calcula a partir de la velocidad sanguínea y el grosor de la capa sanguínea, con el fin de relacionar los tamaños de los agregados con la tasa de cizalladura local correspondiente.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el método de transmisión de luz es que los agregados de glóbulos rojos se analizan dinámicamente en el flujo de cizallamiento microscópico, a diferencia del análisis estadístico con otras técnicas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo hemorradiológico, como comprender las condiciones de formación de agregados de glóbulos rojos y determinar el comportamiento radiológico de la sangre en la microcirculación. Para comenzar, fabrique canales microscópicos de 120 micrones de ancho, 60 micrones de alto y siete milímetros de longitud, según los métodos estándar de fotolitografía.A continuación, recolecte células sanguíneas de donantes voluntarios sanos y prepare suspensiones de glóbulos rojos con niveles de hematocrito del 5, 10 y 15 % como se describe en el protocolo de texto adjunto; combine un mililitro de cada suspensión de glóbulos rojos con 60 microlitros de una solución al 1 % que contiene partículas trazadoras fluorescentes. Agite suavemente el tubo para mezclar la solución. También combine el mismo volumen de partículas trazadoras con un mililitro de PBS a un pH de 7,4.Cargue una jeringa de vidrio de 25 microlitros con la solución trazadora que contiene glóbulos rojos y una jeringa de vidrio de 100 microlitros. Con la solución trazadora en PBS, asegúrese de que no haya burbujas presentes en el sistema. A continuación, coloque el microcanal sobre la platina de un microscopio invertido conectado a una cámara de alta velocidad capaz de grabar 18 cuadros por segundo o más, y a un sistema de velocimetría por imágenes de micropartículas.Conecte cada jeringa mediante un tubo a uno de los puertos de entrada del canal microfluídico y luego colóquelas en el soporte de la misma bomba de jeringas. Programar la bomba de jeringas para dispensar la jeringa de 25 microlitros a una velocidad de dos microlitros por hora. Esto también dispensará la jeringa de 100 microlitros a cuatro veces esa velocidad debido a la diferencia de tamaño.Cambie el caudal entre experimentos para probar diferentes tasas de cizallamiento. Utilice una rejilla de calibración con el objetivo de 20 x colocado para calibrar la cámara de alta velocidad. Luego, encienda la bomba para comenzar a dispensar las dos soluciones en el microcanal.Determine una exposición óptima de la cámara. Tiempo necesario para obtener imágenes nítidas de los agregados. Es importante esperar a que el flujo alcance el estado estacionario antes de realizar cualquier medición.Si se alcanza el estado estacionario ahora dentro de los tres a cinco minutos, rellene la jeringa para agitar la mezcla y mantener los glóbulos rojos en suspensión. Una vez alcanzado el flujo en estado estacionario, comience a registrar el movimiento de los glóbulos rojos.Registre el flujo durante siete segundos. Mediante un programa capaz de procesamiento de imágenes, mejore el contraste de cada imagen en escala de grises tomada utilizando el método de ecualización de histograma. A continuación, convierta las imágenes en escala de grises en imágenes binarias.Establezca cuidadosamente el valor umbral probando varios valores y eligiendo aquel para el cual todos los agregados se detecten adecuadamente. Si es necesario, rellene los huecos correspondientes a las brechas dentro de un agregado. Luego, detecte las células determinando los píxeles blancos vecinos en la imagen binaria, de modo que las células adyacentes se consideren como agregados.Etiquete los diferentes agregados de glóbulos rojos detectados y luego convierta la imagen binaria en una imagen en rojo, verde y azul para una mejor visualización. Finalmente, superponga la imagen en rojo, verde y azul sobre la imagen original. Con el fin de verificar la eficiencia del procesamiento de imágenes, calcule el área de cada agregado detectado en el cuadro en función del número de píxeles detectados.Procese todos los fotogramas de la misma manera. A continuación, promedie los tamaños de los agregados detectados en cada fotograma y luego los resultados de todos los fotogramas. Para obtener el tamaño promedio de los agregados para cada grabación de los motores de suspensiones de glóbulos rojos, convierta los resultados a micrómetros cuadrados utilizando la imagen de referencia.Luego, calcule el área de un glóbulo rojo para determinar un valor representativo. Número estimado de glóbulos rojos dentro de cada agregado detectado una vez que se han obtenido los datos. Utilizando la cámara de alta velocidad, cambie a la cámara de doble pulso empleada para el sistema de velocimetría por imágenes de micropartículas.Utilice un software de imagen como el que se muestra aquí para la adquisición de imágenes del flujo y el procesamiento de imágenes para la determinación del campo de velocidades. Asegúrese de colocarse gafas de protección y luego encienda el sistema láser y la cámara. Coloque un micrómetro bajo el microscopio y utilice la imagen resultante para calibrar el sistema.Luego, inicie el flujo de fluido y visualice las partículas en ambos fluidos. Encuentre el plano medio del microcanal enfocando las partículas más rápidas y brillantes en el flujo. A continuación, establezca el intervalo de tiempo entre cuadros en aproximadamente dos milisegundos, de modo que las partículas más rápidas se desplacen entre cinco y diez píxeles entre ambas imágenes, y comience a grabar el flujo O. Configure el software para adquirir 100 pares de imágenes para todas las diferentes suspensiones de glóbulos rojos y para distintas tasas de cizalladura.Tras el preprocesamiento de la imagen. Elija el tamaño y la forma de la ventana de correlación, así como el porcentaje de superposición de las imágenes. Exprese los resultados como un campo de velocidad promedio calculado a partir de los 100 pares de imágenes y el error cuadrático medio en la velocidad.Apague la cámara láser y la computadora. Una vez que se hayan realizado todas las mediciones y el procesamiento de imágenes, calcule la tasa de cizallamiento detectando y estimando primero el grosor de la sangre en el microcanal en función de la grabación de la cámara de alta velocidad. Para este propósito, promedie todos los fotogramas de la grabación específica para obtener una imagen de fondo del video.Finalmente, delimite la capa de sangre inspeccionando visualmente la imagen promedio de todos los fotogramas y detecte manualmente el borde de la capa de sangre. Luego, obtenga el valor de velocidad para el grosor correspondiente de la capa de sangre manualmente a partir del perfil de velocidad extraído, y calcule la velocidad de cizalladura dividiendo el valor de velocidad por el grosor de la capa de sangre. Los grosores mostrados aquí corresponden a los movimientos netos de cuatro agregados de glóbulos rojos que fueron detectados en tres fotogramas consecutivos.Los grandes agregados de más de 30 células se muestran en rojo. Los agregados medianos de entre nueve y 30 células se muestran en verde, y los agregados pequeños de menos de nueve células se muestran en azul. La velocidad de un agregado varía según su posición en el microcanal mostrado.A continuación se muestran los perfiles de velocidad de los glóbulos rojos suspendidos al 5 % de hematocrito, al 10 % de hematocrito y al 15 % de hematocrito, a un caudal de 10 microlitros por hora. Puede observarse que la velocidad tiende a cero en ambos bordes, tal como se esperaba, y que el punto de inflexión entre los dos flujos varía ligeramente entre los niveles de hematocrito a medida que la velocidad de cizallamiento general aumenta, ya que el tamaño de los agregados en cada nivel de hematocrito disminuye. Esto se debe a que la fuerza de cizallamiento en el microcanal supera la fuerza de agregación, provocando la desagregación de los glóbulos rojos.Al seguir este procedimiento, es importante recordar garantizar una buena calidad de imagen del flujo en el microcanal y asegurar un contraste entre los glóbulos rojos en movimiento y el fondo de la imagen. Tras ver este video, debería tener una comprensión clara de cómo analizar cualitativa y cuantitativamente los agregados de glóbulos rojos bajo condiciones de flujo controladas.

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