Medio Ambiente Microfluidic controlada de Investigación Dinámica de agregación de glóbulos rojos
4 de junio de 2015
El protocolo describe los detalles de un procedimiento experimental para cuantificar de glóbulos rojos (RBC) agregados bajo un régimen de cizalladura controlada y constante, basado en técnicas de procesamiento de imágenes. El objetivo de este protocolo es relacionar tamaños de agregados de glóbulos rojos a la velocidad de cizallamiento correspondiente en un entorno controlado de microfluidos.
El objetivo general de este procedimiento es cuantificar directamente los agregados de glóbulos rojos en la microcirculación, dinámicamente bajo tasas de cizallamiento controladas y constantes. Esto se logra mediante el primero en el entrenamiento, suspensiones de glóbulos rojos y un microcanal doble Y con una solución salina tampón de fosfato, creando una alegría constante en la capa de sangre. El segundo paso es visualizar y registrar el flujo con una cámara de alta velocidad.
A continuación, utilice técnicas de procesamiento de imágenes para procesar la grabación y obtener un tamaño agregado promedio y la distribución del tamaño agregado en el microcanal. El paso final es determinar la velocidad de la sangre siguiendo el desplazamiento de las partículas fluorescentes inyectadas en el microcanal entre dos fotogramas consecutivos. En última instancia, la velocidad de cizallamiento en el microcanal se calcula en función de la velocidad de la sangre y el grosor de la capa de sangre para relacionar los tamaños de los agregados con la tasa de cizallamiento local correspondiente.
La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el método de transmisión de luz, es que los agregados de glóbulos rojos se analizan dinámicamente en el flujo de acciones microscópico a diferencia de lo estadístico con otras técnicas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo hemorrradiológico, como la comprensión de las condiciones de la formación de agregados de glóbulos rojos y la búsqueda del comportamiento radiológico de la sangre en la microcirculación. Para empezar, fabricamos microcanales, de 120 micras de ancho, 60 micras de alto y siete milímetros de longitud, de acuerdo con los métodos fotolitográficos estándar.
A continuación, recoja glóbulos rojos de donantes voluntarios sanos y prepare suspensiones de glóbulos rojos con niveles de hematocrito del 5, 10 y 15% como se describe en el protocolo de texto adjunto, combine un mililitro de cada suspensión de glóbulos rojos con 60 microlitros de una solución al 1% que contenga partículas trazadoras fluorescentes. Agite suavemente el tubo para mezclar la solución. También combine el mismo volumen de partículas trazadoras con un mililitro de PBS a un pH de 7,4.
Cargue una jeringa de vidrio de 25 microlitros con la solución trazadora que contiene glóbulos rojos y una jeringa de vidrio de 100 microlitros. Con la solución trazadora en PBS, asegúrese de que no haya burbujas presentes en el sistema. A continuación, coloque el microcanal en una platina de microscopio invertido conectada a una cámara de alta velocidad capaz de grabar 18 fotogramas por segundo o más, y a un sistema de velocimetría de imágenes de micropartículas.
Conecte cada jeringa a través de un tubo a uno de los puertos de entrada del canal microfluídico y luego cárguelos en el soporte de la misma bomba de jeringa. Programe la bomba de jeringa para dispensar la jeringa de 25 microlitros a una velocidad de dos microlitros por hora. Esto también dispensará la jeringa de 100 microlitros a cuatro veces esa velocidad debido a su diferencia de tamaño.
Cambie el caudal entre experimentos para probar diferentes velocidades de cizallamiento. Utilice un ridículo de calibración con la lente 20 x en su lugar para calibrar la cámara de alta velocidad. A continuación, ponga en marcha la bomba para comenzar a dispensar las dos soluciones en el microcanal.
Determine una exposición óptima de la cámara. Tiempo para obtener imágenes claras de los agregados. Es importante esperar a que el flujo alcance el estado estacionario antes de adquirir cualquier medición.
Si el estado estacionario es ahora, alcance dentro de tres a cinco minutos. Vuelva a llenar la jeringa para educar la mezcla y mantener los glóbulos rojos en suspensión. Una vez que se alcanza el flujo de estado estacionario, comience a registrar el movimiento de los glóbulos rojos.
Registre el flujo durante siete segundos. Utilizando un programa capaz de procesar imágenes, mejore el contraste de cada imagen en escala de grises tomada con el método del ecualizador de histograma. A continuación, convierta las imágenes en escala de grises en imágenes binarias.
Establezca cuidadosamente el valor de umbral probando varios valores y eligiendo el valor para el que se detectan correctamente todos los agregados. Si es necesario, rellene los agujeros correspondientes a los huecos dentro de un agregado. A continuación, detecte las celdas determinando los píxeles blancos vecinos en la imagen binaria para que las celdas adyacentes se contabilicen como agregados.
Etiquete los diferentes agregados de glóbulos rojos detectados y, a continuación, convierta la imagen binaria en una imagen roja, verde y azul para una mejor visualización. Finalmente, superponga la imagen roja, verde y azul sobre la imagen original. Para verificar la eficiencia del procesamiento de la imagen, calcule el área de cada agregado detectado en el fotograma en función del número de píxeles detectados.
Procese todos los fotogramas de la misma manera. A continuación, promedie los tamaños agregados detectados en cada fotograma y, a continuación, los resultados de todos los fotogramas. Para obtener el tamaño agregado promedio para cada registro de los motores de suspensión de glóbulos rojos, convierta los resultados a micrómetros cuadrados utilizando la imagen de ridículo.
A continuación, calcule el área de un glóbulo rojo para determinar un representante. Número estimado de glóbulos rojos dentro de cada agregado detectado una vez que se adquieren los datos. Usando la cámara de alta velocidad, cambie a la cámara de doble pulso utilizada para el sistema de velocimetría de imágenes de micropartículas.
Utilice un software de imágenes como el que se muestra aquí para la adquisición de imágenes del flujo y el procesamiento de imágenes para la determinación del campo de velocidad. Asegúrese de ponerse gafas protectoras y luego encienda el sistema láser y la cámara. Coloque un micrómetro debajo del microscopio y utilice la imagen resultante para calibrar el sistema.
A continuación, inicie el flujo de fluido y visualice las partículas en ambos fluidos. Encuentre el plano medio del microcanal enfocándose en las partículas más rápidas y brillantes del flujo. A continuación, establezca el intervalo de tiempo entre fotogramas en aproximadamente dos milisegundos para que las partículas más rápidas se muevan de cinco a 10 píxeles entre ambas imágenes y comiencen a registrar el flujo O.Configure el software para adquirir 100 pares de imágenes para todas las diferentes suspensiones de glóbulos rojos y para diferentes velocidades de cizallamiento.
Después del preprocesamiento de la imagen. Elija el tamaño y la forma de la ventana de correlación, así como el porcentaje de imágenes superpuestas. Exprese los resultados como un campo de velocidad promedio calculado a partir de los 100 pares de imágenes y el error cuadrático medio en la velocidad.
Apague la cámara láser y la computadora. Una vez que se hayan realizado todas las mediciones y el procesamiento de imágenes, calcule la tasa pura detectando y estimando primero el espesor de la sangre en el microcanal en función de la grabación de la cámara de alta velocidad. Para ello, promedie todos los fotogramas de la grabación específica para obtener una imagen de fondo del vídeo.
Por último, defina la capa de sangre inspeccionando visualmente la imagen media de todos los fotogramas y detecte manualmente el borde de la capa de sangre. A continuación, obtenga el valor de velocidad para el espesor de la capa de sangre correspondiente manualmente a partir del perfil de velocidad extraído y calcule la velocidad de cizallamiento dividiendo el valor de la velocidad por la capa de sangre. El grosor que se muestra aquí son los movimientos netos de cuatro agregados de glóbulos rojos que se detectaron en tres fotogramas consecutivos.
Los agregados grandes de más de 30 celdas se muestran en rojo. Los agregados medianos entre nueve y 30 celdas se muestran en verde, y los agregados pequeños de menos de nueve celdas se muestran en azul. La velocidad de un agregado varía en función de su posición en el microcanal mostrado.
Estos son los perfiles de velocidad de los glóbulos rojos suspendidos al 5% de hematocrito, 10% de hematocrito y 15% de hematocrito a un caudal de 10 microlitros por hora. Puede ver que la velocidad se dirige hacia cero en ambos bordes como se esperaba, y el punto de inflexión entre las dos corrientes de flujo varía ligeramente entre los niveles de hematocrito a medida que aumenta la velocidad de cizallamiento general, el tamaño de los agregados en cada nivel de hematocrito disminuye. Esto se debe a que la fuerza en el microcanal excede la fuerza de agregación, lo que hace que los glóbulos rojos se disgreguen.
Al realizar este procedimiento, es importante recordar que debe garantizar una buena calidad de imagen del flujo en el microcanal y garantizar un contraste entre los glóbulos rojos que fluyen y el fondo de la imagen. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo analizar cualitativa y cuantitativamente los agregados de glóbulos rojos en condiciones de flujo controlado.
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Visión general
Este protocolo describe un método para cuantificar agregados de glóbulos rojos (GRU) bajo tasas de cizallamiento controladas utilizando técnicas de procesamiento de imágenes. El estudio tiene como objetivo correlacionar los tamaños de agregados de GRU con las tasas de cizallamiento en un entorno microfluídico.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Microfluidos
- Hematología
- Procesamiento de imágenes
Antecedentes
- Los agregados de glóbulos rojos juegan un papel crucial en la microcirculación.
- Entender las tasas de cizallamiento es esencial para estudiar la dinámica del flujo sanguíneo.
- Las técnicas de procesamiento de imágenes pueden mejorar el análisis de los agregados de GRU.
- Este estudio utiliza una configuración de microcanal para experimentos controlados.
Propósito del estudio
- Cuantificar los agregados de GRU en un entorno microfluídico.
- Relacionar los tamaños de agregados con las tasas de cizallamiento locales.
- Mejorar la comprensión del comportamiento del flujo sanguíneo en la microcirculación.
Métodos utilizados
- Preparación de suspensiones de GRU en una solución salina tamponada con fosfato.
- Visualización del flujo usando una cámara de alta velocidad.
- Procesamiento de imágenes para determinar el tamaño promedio de los agregados y su distribución.
- Cálculo de la tasa de cizallamiento basada en la velocidad de la sangre y el grosor de la capa.
Principales resultados
- Cuantificación exitosa de los tamaños de los agregados de GRU.
- Establecimiento de una relación entre los tamaños de los agregados y las tasas de cizallamiento.
- Demostración del uso efectivo de técnicas de procesamiento de imágenes.
- Perspectivas sobre la dinámica del comportamiento de los GRU en la microcirculación.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un método confiable para estudiar los agregados de GRU.
- Los hallazgos mejoran la comprensión del flujo sanguíneo en sistemas microfluídicos.
- Las aplicaciones futuras pueden incluir estudios sobre trastornos sanguíneos y terapias.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Understanding red blood cell aggregation dynamics under controlled shear rates provides critical insights into blood rheology relevant to microcirculation and vascular health. This microfluidic approach enables quantitative assessment of aggregate formation and disaggregation, supporting mechanistic studies in hematology and hemorheology. The method aids in de-risking target validation by linking biophysical parameters to functional outcomes in blood flow behavior.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to RBC aggregation pathways and modulators of hemorheological function.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct visualization and quantification of aggregate dynamics under physiologically relevant shear conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing reproducible aggregate size metrics under controlled flow.
- Operational Value: Enhances assay standardization and scalability through microfluidic platform reuse and quantitative image-based readouts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects discovery-phase mechanistic insights to preclinical continuity by modeling shear-dependent RBC behavior in microcirculation.
- Operational Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by correlating aggregate stability with hemodynamic conditions relevant to vascular function.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification by providing shear-dependent phenotypic readouts that inform mechanistic understanding of blood flow modifiers.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling dynamic observation of aggregate formation and dissociation under controlled shear rates.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized microfluidic environments and quantitative aggregate size distribution outputs.
- Analytics: Provides measurable readouts including average aggregate size, size distribution, and localized shear rate calculations derived from velocity fields and layer thickness.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling RBC behavior in microvascular environments relevant to disease states.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for evaluating compounds or conditions affecting hemorheological properties across multiple hematocrit levels and shear conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in RBC-plasma interactions under flow.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization through controlled shear rates, calibrated imaging, and automated image processing workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of hemorheological liabilities that could impact drug safety or efficacy.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying compounds that modulate aggregation propensity in a shear-dependent manner.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device handling, high-speed imaging, and image processing techniques for binary thresholding and particle labeling.
- Depends on microfluidic fabrication capabilities, high-speed cameras capable of ≥18 fps, and μPIV systems for velocity field determination.
- Necessitates cross-team standardization of hematocrit preparation, tracer particle concentration, and flow rate protocols to ensure comparability across experiments.
- Involves adaptation considerations when extending to diseased RBC samples or varying plasma conditions that may alter aggregation kinetics.
- Includes practical limitations such as the need for bubble-free systems, steady-state flow validation, and manual validation of blood layer thickness for shear rate calculation.
