Medio Ambiente Microfluidic controlada de Investigación Dinámica de agregación de glóbulos rojos

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar directamente los agregados de glóbulos rojos en la microcirculación, de forma dinámica y bajo tasas de cizallamiento controladas y constantes. Esto se logra primero entrenando suspensiones de glóbulos rojos y un microcanal doble en Y con una solución de tampón salino fosfato, creando una cizalladura constante en la capa sanguínea. El segundo paso consiste en visualizar y grabar el flujo mediante una cámara de alta velocidad.

A continuación, utilice técnicas de procesamiento de imágenes para procesar la grabación y obtener un tamaño promedio de agregado y la distribución del tamaño de los agregados en el microcanal. El paso final consiste en determinar la velocidad sanguínea siguiendo el desplazamiento de partículas fluorescentes inyectadas en el microcanal entre dos cuadros consecutivos. En última instancia, la tasa de cizalladura en el microcanal se calcula a partir de la velocidad sanguínea y el grosor de la capa sanguínea, con el fin de relacionar los tamaños de los agregados con la tasa de cizalladura local correspondiente.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el método de transmisión de luz es que los agregados de glóbulos rojos se analizan dinámicamente en el flujo de cizallamiento microscópico, a diferencia del análisis estadístico con otras técnicas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo hemorradiológico, como comprender las condiciones de formación de agregados de glóbulos rojos y determinar el comportamiento radiológico de la sangre en la microcirculación. Para comenzar, fabrique canales microscópicos de 120 micrones de ancho, 60 micrones de alto y siete milímetros de longitud, según los métodos estándar de fotolitografía.

A continuación, recolecte células sanguíneas de donantes voluntarios sanos y prepare suspensiones de glóbulos rojos con niveles de hematocrito del 5, 10 y 15 % como se describe en el protocolo de texto adjunto; combine un mililitro de cada suspensión de glóbulos rojos con 60 microlitros de una solución al 1 % que contiene partículas trazadoras fluorescentes. Agite suavemente el tubo para mezclar la solución. También combine el mismo volumen de partículas trazadoras con un mililitro de PBS a un pH de 7,4.

Cargue una jeringa de vidrio de 25 microlitros con la solución trazadora que contiene glóbulos rojos y una jeringa de vidrio de 100 microlitros. Con la solución trazadora en PBS, asegúrese de que no haya burbujas presentes en el sistema. A continuación, coloque el microcanal sobre la platina de un microscopio invertido conectado a una cámara de alta velocidad capaz de grabar 18 cuadros por segundo o más, y a un sistema de velocimetría por imágenes de micropartículas.

Conecte cada jeringa mediante un tubo a uno de los puertos de entrada del canal microfluídico y luego colóquelas en el soporte de la misma bomba de jeringas. Programar la bomba de jeringas para dispensar la jeringa de 25 microlitros a una velocidad de dos microlitros por hora. Esto también dispensará la jeringa de 100 microlitros a cuatro veces esa velocidad debido a la diferencia de tamaño.

Cambie el caudal entre experimentos para probar diferentes tasas de cizallamiento. Utilice una rejilla de calibración con el objetivo de 20 x colocado para calibrar la cámara de alta velocidad. Luego, encienda la bomba para comenzar a dispensar las dos soluciones en el microcanal.

Determine una exposición óptima de la cámara. Tiempo necesario para obtener imágenes nítidas de los agregados. Es importante esperar a que el flujo alcance el estado estacionario antes de realizar cualquier medición.

Si se alcanza el estado estacionario ahora dentro de los tres a cinco minutos, rellene la jeringa para agitar la mezcla y mantener los glóbulos rojos en suspensión. Una vez alcanzado el flujo en estado estacionario, comience a registrar el movimiento de los glóbulos rojos.

Registre el flujo durante siete segundos. Mediante un programa capaz de procesamiento de imágenes, mejore el contraste de cada imagen en escala de grises tomada utilizando el método de ecualización de histograma. A continuación, convierta las imágenes en escala de grises en imágenes binarias.

Establezca cuidadosamente el valor umbral probando varios valores y eligiendo aquel para el cual todos los agregados se detecten adecuadamente. Si es necesario, rellene los huecos correspondientes a las brechas dentro de un agregado. Luego, detecte las células determinando los píxeles blancos vecinos en la imagen binaria, de modo que las células adyacentes se consideren como agregados.

Etiquete los diferentes agregados de glóbulos rojos detectados y luego convierta la imagen binaria en una imagen en rojo, verde y azul para una mejor visualización. Finalmente, superponga la imagen en rojo, verde y azul sobre la imagen original. Con el fin de verificar la eficiencia del procesamiento de imágenes, calcule el área de cada agregado detectado en el cuadro en función del número de píxeles detectados.

Procese todos los fotogramas de la misma manera. A continuación, promedie los tamaños de los agregados detectados en cada fotograma y luego los resultados de todos los fotogramas. Para obtener el tamaño promedio de los agregados para cada grabación de los motores de suspensiones de glóbulos rojos, convierta los resultados a micrómetros cuadrados utilizando la imagen de referencia.

Luego, calcule el área de un glóbulo rojo para determinar un valor representativo. Número estimado de glóbulos rojos dentro de cada agregado detectado una vez que se han obtenido los datos. Utilizando la cámara de alta velocidad, cambie a la cámara de doble pulso empleada para el sistema de velocimetría por imágenes de micropartículas.

Utilice un software de imagen como el que se muestra aquí para la adquisición de imágenes del flujo y el procesamiento de imágenes para la determinación del campo de velocidades. Asegúrese de colocarse gafas de protección y luego encienda el sistema láser y la cámara. Coloque un micrómetro bajo el microscopio y utilice la imagen resultante para calibrar el sistema.

Luego, inicie el flujo de fluido y visualice las partículas en ambos fluidos. Encuentre el plano medio del microcanal enfocando las partículas más rápidas y brillantes en el flujo. A continuación, establezca el intervalo de tiempo entre cuadros en aproximadamente dos milisegundos, de modo que las partículas más rápidas se desplacen entre cinco y diez píxeles entre ambas imágenes, y comience a grabar el flujo O. Configure el software para adquirir 100 pares de imágenes para todas las diferentes suspensiones de glóbulos rojos y para distintas tasas de cizalladura.

Tras el preprocesamiento de la imagen. Elija el tamaño y la forma de la ventana de correlación, así como el porcentaje de superposición de las imágenes. Exprese los resultados como un campo de velocidad promedio calculado a partir de los 100 pares de imágenes y el error cuadrático medio en la velocidad.

Apague la cámara láser y la computadora. Una vez que se hayan realizado todas las mediciones y el procesamiento de imágenes, calcule la tasa de cizallamiento detectando y estimando primero el grosor de la sangre en el microcanal en función de la grabación de la cámara de alta velocidad. Para este propósito, promedie todos los fotogramas de la grabación específica para obtener una imagen de fondo del video.

Finalmente, delimite la capa de sangre inspeccionando visualmente la imagen promedio de todos los fotogramas y detecte manualmente el borde de la capa de sangre. Luego, obtenga el valor de velocidad para el grosor correspondiente de la capa de sangre manualmente a partir del perfil de velocidad extraído, y calcule la velocidad de cizalladura dividiendo el valor de velocidad por el grosor de la capa de sangre. Los grosores mostrados aquí corresponden a los movimientos netos de cuatro agregados de glóbulos rojos que fueron detectados en tres fotogramas consecutivos.

Los grandes agregados de más de 30 células se muestran en rojo. Los agregados medianos de entre nueve y 30 células se muestran en verde, y los agregados pequeños de menos de nueve células se muestran en azul. La velocidad de un agregado varía según su posición en el microcanal mostrado.

A continuación se muestran los perfiles de velocidad de los glóbulos rojos suspendidos al 5 % de hematocrito, al 10 % de hematocrito y al 15 % de hematocrito, a un caudal de 10 microlitros por hora. Puede observarse que la velocidad tiende a cero en ambos bordes, tal como se esperaba, y que el punto de inflexión entre los dos flujos varía ligeramente entre los niveles de hematocrito a medida que la velocidad de cizallamiento general aumenta, ya que el tamaño de los agregados en cada nivel de hematocrito disminuye. Esto se debe a que la fuerza de cizallamiento en el microcanal supera la fuerza de agregación, provocando la desagregación de los glóbulos rojos.

Al seguir este procedimiento, es importante recordar garantizar una buena calidad de imagen del flujo en el microcanal y asegurar un contraste entre los glóbulos rojos en movimiento y el fondo de la imagen. Tras ver este video, debería tener una comprensión clara de cómo analizar cualitativa y cuantitativamente los agregados de glóbulos rojos bajo condiciones de flujo controladas.