Name: El aislamiento y criopreservación de rata neonatal cardiomiocitos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Aprende a aislar y criopreservar cardiomiocitos de rata neonatal para estudios in vitro. Este método permite usar células descongeladas en ensayos como inmunofluorescencia sin necesidad de aislamientos repetidos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabajo fue financiado por la Asociación Americana del Corazón 12BGIA12040477, el Programa de Excelencia del Profesorado del Rector de la Universidad Estatal de Carolina del Norte y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China H020381370216.

El siguiente protocolo está diseñado para el aislamiento de cardiomiocitos de una camada de cachorros de rata neonatal (10-14 PUP). Si el tamaño de camada es significativamente diferente, el procedimiento puede tener que ser reducido para compensar. Los cachorros deben ser alrededor de 48 ± 6 horas de edad. Todos los procedimientos en este documento han sido aprobados por la Universidad de Carolina del Norte Estado Institucional Cuidado de Animales y el Comité de Uso (IACUC). 1. Preparación celda de aislamiento NOTA: Realice los siguientes pasos el día antes del aislamiento. <ol><li> Autoclave los siguientes: grandes tijeras, tijeras pequeñas, pequeñas pinzas cortantes, grandes pinzas. Use un ciclo de la gravedad durante 60 minutos a un mínimo de 121 ° C y un tiempo de secado de 30 min. </li><li> Colocar 40 ml de solución de tripsina 0,1% en el refrigerador para descongelar O / N. Refrigere de Hank sales equilibradas Solution (HBSS) si no está ya frío. Preparar una solución madre de los medios de comunicación 20% de suero bovino fetal (FBS). <ol><li> En 400 ml de Iscmedios modificado de Dulbecco de OVE (IMDM) añadir 100 ml de FBS, 5 ml L-glutamina (200 mM), 2,5 ml de gentamicina (10 mg ml -1), y 0,9 ml de 2-mercaptoetanol. Esterilizar mediante filtro de vacío. De la tienda a 4 ° C durante un máximo de 3 semanas y esto es escalable para volúmenes más pequeños o más grandes. Diluir 20% de FBS Stock medios de comunicación 1: 1 con IMDM para producir 10% de FBS NRCM medios de comunicación. Sólo hacer en lotes pequeños para evitar el calentamiento y enfriamiento de los medios de comunicación repetida. </li></ol></li></ol> 2. celda de aislamiento Día 1 <ol><li> Realice el siguiente trabajo en una campana de cultivo para evitar la contaminación de las muestras. Para mejor momento comenzar este trabajo de la tarde ya que hay un / incubación O N. </li><li> Preparar espacio de trabajo dentro de una campana de cultivo estéril. Coloque la almohadilla de banco en campana de cultivo. Llene dos vasos de precipitados de 250 ml con 70% de etanol y colocar herramientas quirúrgicas en ellos. Coloque pequeño cubo de hielo en la campana. Asegúrese de que sea lo suficientemente grande como para contener varios tubos y un plato de 150 mm. UV esterilizar el capó for 10 min. Colocar 40 ml de 0,1% de tripsina en hielo. </li><li> Recuperar crías de ratas neonatales de la madre. Para mantener a los animales caliente hasta su uso, colocarlos en un recipiente aislado, como un cubo de hielo envuelto en una plataforma de banca para mantenerlos calientes. </li><li> Llenar una placa de cultivo de 150 mm con 25 ml de HBSS y colocar en hielo. Separar 2-3 gasas y lugar en el área de trabajo. Sosteniendo cachorro por la piel en la parte posterior del cuello, rociar con etanol al 70% y el lugar en el capó. NOTA: Para mantener mejor la esterilidad, esto se puede hacer por otra persona que luego coloca el cachorro limpiado en el capó. </li><li> Mantenga el cachorro por la piel en la parte posterior del cuello. Luego, utilizando las tijeras grandes, en un rápido corte fuerte, la eutanasia por decapitación. Seque la sangre con una gasa. NOTA: Debido a las variaciones en los requerimientos IACUC, puede ser más apropiado para limpiar el cachorro con una mezcla de etanol en lugar de limpiar rociándolo. Asegúrese de consultar con la universidad IACUC como a sus directrices para este paso. </li><li> Continuar reduciendo cara anterior del chest a través de la caja torácica. Apriete la piel en el cuello para ayudar a abrir la caja torácica hasta que el corazón es visible. Usando las tijeras pequeñas, retire el corazón y colocar en la placa de cultivo HBSS en hielo. Repita el procedimiento para los otros cachorros. </li><li> Retire cualquier tejido no corazón de las muestras y haga girar la HBSS suavemente para limpiar los corazones. Transferir el tejido del corazón a otra placa de cultivo que contiene frescos HBSS y lavar aún más el tejido. Cortar el tejido más hasta que las piezas son de 1-3 mm 3, y luego traslado a la solución de tripsina. Coloque solución de tripsina en eje de balancín en 4 ° C refrigerador O / N. </li></ol> Aislamiento de células Día 2 NOTA: mientras se aspira en los pasos siguientes, utilizar una pipeta en lugar de una línea de vacío. El tejido se mueve con facilidad, y una línea de vacío va a obstruir o remover el tejido todavía contiene células. Lo mejor es usar una pipeta de aspiración en su lugar. Si el tejido entra en la pipeta, pipetas atrás para extraerla. <ol><li> Haga talícuotas res de 10% NRCM Medios: una con 25 ml y dos con 15 ml. Coloque un tubo de 25 ml de medios de comunicación en 37 ° C baño de agua. Añadir 4 ml de HBSS a 5 diferentes 15 ml tubos cónicos y colocar todo en hielo. Etiqueta de cada 15 ml tubo # 1-5. </li><li> Añadir 40 ml de HBSS a un tubo cónico de 50 ml. Añadir 10 ml de HBSS a la colagenasa, una pipeta de suspender, y combinan las soluciones para crear 50 ml de 1 mg ml -1 solución de colagenasa. Esterilizar usando 0,22 micras filtro de vacío, y almacenar a temperatura ambiente. </li><li> Recuperar tubo de tejido / tripsina corazón. Asegúrese de que la tripsina es clara, y el tejido parece esponjoso. Deje que el tejido se deposite en la esquina de tubo y aspirar todo el líquido posible. </li><li> Añadir 25 ml tibia 10% de FBS NRCM medios de comunicación para el tubo y agitar a mano. Cap y girar en 37 ° C baño de agua durante 2 min. Aspirar el líquido de nuevo. El tejido debe flotar en este paso; Si es así, aspirado desde el fondo del tubo. </li><li> Añadir 10 ml de colagenasa. Gire en baño de agua durante 2 minutos o hasta que la solución está turbia. Quickly aspirar el líquido. Añadir 10 ml de colagenasa reciente al tubo que contiene el tejido y girar en baño de agua durante 2 min. Pipeta para mezclar, solución de transferencia de tubo # 1, y el lugar en el hielo. Puede que no sea posible eliminar todo el líquido. Repetir los pasos 3.2 a 3.6 para los otros tres tubos de 15 ml cónicos. Transferir el líquido restante en el tubo # 5. </li><li> Centrífuga de tubos de 15 ml a 410 rcf durante 8 min. Mientras centrifugación, colocar 15 ml de 10% de tubo medios FBS NRCM en baño de agua. Coloque 40 micras filtro de células en la parte superior de un tubo cónico de 50 ml y mojado con 2 ml de HBSS frío. </li><li> Aspirar el sobrenadante de las células centrifugadas. Añadir 6 ml de HBSS fría a cada tubo y resuspender. Suspensiones de células de la pipeta a través del filtro en 50 ml cónica para retirar cualquier tejido. Enjuague lados de cada tubo de 15 ml con 3 ml de HBSS frío y añadir al colador. Centrifugar las células a 410 rcf durante 10 min. Aspirar el sobrenadante. Resuspender pellet de células en 10 ml 10% de FBS NRCM medios de comunicación y la transferencia de T-75 matraz. Enjuague cónica con medios de 5 ml y añadir a flpreguntar. </li><li> Incubar durante 1 h a 37 ° C y 5% de CO 2. Coloque el pasado 15 ml 10% de tubo medios FBS NRCM en baño de agua. Transferir contenido del T-75 a un nuevo matraz T-175, enjuague T-75 con 15 ml de medio y añadir a T-175. Incubar durante 1 hora. </li></ol> 4. Criopreservación <ol><li> Coloca medio de congelación en el hielo. Traslado medio celular de T-175 a 50 ml tubo cónico, y recoger 10 l de suspensión celular para celular recuento usando azul tripán. Centrifugar a 410 rcf durante 5 min. Mientras centrifugación, contar las células utilizando un contador de células. </li><li> Aspirar los medios de cultivo y las células volver a suspender en medio de congelación a una concentración de 2 a 4.000.000 de células por ml. Colocar 1 ml de suspensión celular en vial criogénico, luego ubicar los viales una velocidad controlada de refrigeración congelación contenedor, y el lugar en el congelador a -80ºC O / N. Dentro de 1-2 días, transferir viales en nitrógeno líquido. </li></ol> 5. Las células de descongelación <ol><li> Escudo plato en la fibronectina mediante la disolución de 250 l60; de la fibronectina (concentración madre de 1 mg ml -1) en 9,75 ml de agua (concentración final 0,025 mg ml -1). Agregue suficiente solución para cubrir la placa de cultivo y se incuba a 37 ° C durante al menos 30 minutos. <ol><li> En cuatro de 15 ml tubos cónicos, hacer las mezclas DMSO / medios de la siguiente añadiendo DMSO al 20% de Medios. Añadir (5%) 9,5 ml de medio con 500 l de DMSO. Añadir (2,5%) 9,75 ml de medio con 250 l de DMSO. Añadir 10 ml de medio (hacer dos de ellos). </li></ol></li><li> Calentar las mezclas de los medios mencionados en baño a 37 ° C. Eliminar las células de nitrógeno líquido y colocar en hielo seco. Cuando mezclas de medios de comunicación son cálidos, descongelar las células en 37 ° C baño de agua hasta que estén descongelados. No deje las células en un baño de agua durante demasiado tiempo, ya que puede causar daño a las células. </li><li> Transferir contenido del vial criogénico al 5% tubo DMSO / media. Centrifugar a 410 rcf durante 8 min. Aspirar el sobrenadante dejando sedimento celular. Añadir el contenido de 2,5% tubo DMSO / media a teléfonos de pellets y resuspend. Centrifugar a 410 rcf durante 8 min. Aspirar el sobrenadante dejando sedimento celular. </li><li> Añadir el contenido de un 0% tubo DMSO / media a la celda de pellets y resuspender. Centrifugar a 410 rcf durante 8 min. Aspirar el sobrenadante dejando sedimento celular. </li><li> Añadir el contenido de segunda 0% DMSO / medios de comunicación para sedimento celular y resuspender. Tome pequeña muestra para el recuento celular. Centrifugar a 410 rcf durante 8 min. Mientras centrifugación células recuento en un hemocitómetro usando azul tripán para marcar las células muertas. Cantidad de células Record, así como la viabilidad. </li><li> Aspirar el sobrenadante dejando sedimento celular. Resuspender en 10% NRCM medios (opcional: añadir 100 mM bromodesoxiuridina (BrdU)) y células de la placa en placas recubiertas de fibronectina. </li></ol> 6. Cultivo Celular <ol><li> Células de la placa en unos 100 mil células por cm 2. Ajustar la densidad de placas basado en el uso previsto de la cultura. Preparar 2% NRCM medios de comunicación mediante la dilución de 20% de medios en IMDM en una proporción de 1:10. El siguiente es un resumen de una cultura típica. &lt;/ Li&gt; <li> El día 1, enjuagar las células muertas de distancia con IMDM tibia, agregue 10% NRCM (opcional 100 mM BrdU). El día 2, enjuagar las células muertas de distancia con IMDM tibia, agregue 10% NRCM. Día 3-añadir 2% NRCM. El día 4 añadir 2% NRCM. El día 5 aseguran que las células son confluentes y paliza. Mantener las células en cultivo por alrededor de una semana. En ese momento, los fibroblastos pueden comenzar a superar significativamente los NRMCR. </li></ol>

<ol><li>Louch, W. E., Sheehan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+cardiomyocyte+isolation%2C+culture%2C+and+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).</li>
<li>Miragoli, M., Salvarani, N., Rohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofibroblasts+Induce+Ectopic+Activity+in+Cardiac+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Myofibroblasts Induce Ectopic Activity in Cardiac Tissue.</a> Circulation Research. 101, 755-758 (2007).</li>
<li>Simpson, P., Savion, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+rat+myocytes+in+single+cell+cultures+with+and+without+proliferating+nonmyocardial+cells.+Cross-striations%2C+ultrastructure%2C+and+chronotropic+response+to+isoproterenol%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiation of rat myocytes in single cell cultures with and without proliferating nonmyocardial cells. Cross-striations, ultrastructure, and chronotropic response to isoproterenol.</a> Circulation Research. 50 (1), 101-116 (1982).</li>
<li>Simpson, P., McGrath, a, Savion, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocyte+hypertrophy+in+neonatal+rat+heart+cultures+and+its+regulation+by+serum+and+by+catecholamines%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and by catecholamines.</a> Circulation Research. 51 (6), 787-801 (1982).</li>
<li>Rohr, S., Flückiger-Labrada, R., Kucera, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolithographically+defined+deposition+of+attachment+factors+as+a+versatile+method+for+patterning+the+growth+of+different+cell+types+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archive+%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Photolithographically defined deposition of attachment factors as a versatile method for patterning the growth of different cell types in culture.</a> Pflügers Archive : European Journal of Physiology. 446 (1), 125-132 (2003).</li>
<li>Zhang, B., Green, J. V., Murthy, S. K., Radisic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+enrichment+of+functional+cardiomyocytes+using+microfluidic+deterministic+lateral+flow+displacement%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Label-free enrichment of functional cardiomyocytes using microfluidic deterministic lateral flow displacement.</a> PloS One. 7 (5), e37619(2012).</li>
<li>Boateng, S. Y., Hartman, T. J., Ahluwalia, N., Vidula, H., Desai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+fibroblast+proliferation+in+cardiac+myocyte+cultures+by+surface+microtopography%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of fibroblast proliferation in cardiac myocyte cultures by surface microtopography.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 285 (1), C171-C182 (2003).</li>
<li>Fu, J. -D., Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+of+the+sarcoplasmic+reticulum+in+the+developmental+regulation+of+Ca2%2B+transients+and+contraction+in+cardiomyocytes+derived+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%3A+Official+Publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Crucial role of the sarcoplasmic reticulum in the developmental regulation of Ca2+ transients and contraction in cardiomyocytes derived from embryonic stem cells.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 20 (1), 181-183 (2006).</li>
<li>Liu, J., Fu, J. D., Siu, C. W., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Functional+sarcoplasmic+reticulum+for+calcium+handling+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes%3A+insights+for+driven+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">a Functional sarcoplasmic reticulum for calcium handling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: insights for driven maturation.</a> Stem Cells. 25 (12), 3038-3044 (2007).</li>
<li>Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%3A+boutique+science+or+valuable+arrhythmia+model%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model.</a> Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).</li>
<li>Uchida, T., Nagayama, M., Taira, T., Shimizu, K., Sakai, M., Gohara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+temperature+range+for+low-temperature+preservation+of+dissociated+neonatal+rat+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Optimal temperature range for low-temperature preservation of dissociated neonatal rat cardiomyocytes.</a> Cryobiology. 63 (3), 279-284 (2011).</li>
<li>Miyamura, K., Nagayama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+viability+of+cryopreserved+rat+cardiac+myocytes+and+effects+of+dimethyl+sulfoxide+concentration+on+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of viability of cryopreserved rat cardiac myocytes and effects of dimethyl sulfoxide concentration on cryopreservation.</a> Cryobiology. 59 (3), 375(2010).</li>
<li>Rana, P., Anson, B., Engle, S., Will, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%3A+bioenergetics+and+utilization+in+safety+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%3A+An+Official+Journal+of+the+Society+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: bioenergetics and utilization in safety screening.</a> Toxicological Sciences: An Official Journal of the Society of Toxicology. 130 (1), 117-131 (2012).</li>
<li>Yokomuro, H., Mickle, D. aG., Weisel, R. D., Li, R. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+conditions+for+heart+cell+cryopreservation+for+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Optimal conditions for heart cell cryopreservation for transplantation.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 242 (1-2), 109-114 (2003).</li>
<li>Simpson, P., McGrath, a, Savion, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocyte+hypertrophy+in+neonatal+rat+heart+cultures+and+its+regulation+by+serum+and+by+catecholamines%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and by catecholamines.</a> Circulation Research. 51 (6), 787-801 (1982).</li>
<li>Evans, H. J., Western Goodwin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((array+analysis+of+cell+cycle+protein+changes+during+the+hyperplastic+to+hypertrophic+transition+in+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">array analysis of cell cycle protein changes during the hyperplastic to hypertrophic transition in heart development.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 303 (1-2), 189-199 (2007).</li>
<li>Golden, H. B., Gollapudi, D., et al. Methods in Molecular Biology. , 205-214 (2012).</li>
<li>Zlochiver, S., Muñoz, V., Vikstrom, K. L., Taffet, S. M., Berenfeld, O., Jalife, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotonic+myofibroblast-to-myocyte+coupling+increases+propensity+to+reentrant+arrhythmias+in+two-dimensional+cardiac+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Electrotonic myofibroblast-to-myocyte coupling increases propensity to reentrant arrhythmias in two-dimensional cardiac monolayers.</a> Biophysical Journal. 95 (9), 4469-4480 (2008).</li>
<li>Chang, M. G., Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiral+waves+and+reentry+dynamics+in+an+in+vitro+model+of+the+healed+infarct+border+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Spiral waves and reentry dynamics in an in vitro model of the healed infarct border zone.</a> Circulation Research. 105 (11), 1062-1071 (2009).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo permite a los NRMCR a ser aislados, criopreservadas y descongeladas. Descongelación de las células es una parte crucial del procedimiento. Una serie de diluciones de DMSO se utiliza para eliminar lentamente DMSO de las células 14. Es importante que la extracción de DMSO realizarse rápidamente ya que las células son particularmente sensibles a morir inmediatamente después de la descongelación. Si se requieren células más o menos para la descongelación, los volúmenes de las soluciones de DMSO que...

El cultivo celular de los cardiomiocitos es una herramienta fundamental en la investigación cardiaca moderna. Cardiomiocitos de rata neonatal (NRMCR) son de uso general ya que el aislamiento y la cultura es más fácil que la de los cardiomiocitos de rata adulta 1. El método NRCM todavía tiene varias limitaciones, incluyendo un procedimiento de aislamiento de largo y la proliferación celular limitado en el plato. Hay numerosos protocolos para el aislamiento de NRMCR con la mayoría requiriendo generalmente 4-48 hr de trabajo 2-6. Además, las células se aíslan con frecuencia de 1 a cachorros de 2 días de edad de rata 2,4-7; el momento del nacimiento puede ser impredecible y el conflicto con otros trabajos en el laboratorio. Los aislamientos pueden ser ineficiente y derrochador si se necesita sólo una pequeña cantidad de células para los experimentos. La mayoría de los esfuerzos en mejorar el enfoque del flujo de trabajo en la reducción del tiempo de aislamiento, sin embargo, esto no resuelve el problema de medir el tiempo del nacimiento de las crías. Como alternativas, muchos laboratorios utilizancardiomiocitos derivados de células madre embrionarias (CES) o las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs). Sin embargo, el proceso de reprogramación y / o diferenciación puede ser muy lento y costoso también. No puede haber otros problemas al utilizar estas células como modelos miocitos in vitro. Ambos cardiomiocitos derivados Esc- y iPSC- han demostrado que presentan diferencias en la electrofisiología de cardiomiocitos primarios 8-10. NRMCR disociadas son capaces de ser almacenado durante varios días utilizando refrigeración 11, sin embargo, esto no permiten el almacenamiento a largo plazo. El nitrógeno líquido se utiliza típicamente para preservar las células de un mayor período de tiempo, sino que requiere un crioprotector tal como sulfóxido de dimetilo (DMSO). Investigaciones anteriores han demostrado que la concentración ideal entre 5-10% de DMSO en los medios de congelación permite la criopreservación de NRMCR, pero aun así la viabilidad sigue siendo baja 12. Aunque DMSO ayuda a proteger las células durante gratuitazing, puede ser tóxico para las células a concentraciones por encima de 1,5% 13. Estudios anteriores han demostrado que la eliminación lentamente DMSO de las células, puede mejorar la viabilidad celular 14. Hemos tratado de mejorar la eficiencia de los ensayos basados ​​en células NRCM por criopreservar las células después del aislamiento. Esto permite que las células se descongelaron y se utilizan cuando sea necesario, reduciendo la frecuencia de aislamientos y el consumo de los animales. Usando este método, se muestra que es posible criopreservar NRMCR y descongelar para su uso en un momento posterior. Después de descongelar las células mantienen una viabilidad aceptable y producen culturas NRCM que son positivas para α-actinina sarcomérica (α-SA) y el contrato de forma espontánea.

<table><tbody><tr><td>IMDM (+25 mM HEPES +L-glutamina)</td><td>Gibco</td><td>12440-046</td><td>Con 25 mM HEPES y L-glutamina</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>añadidos Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (+Ca +Mg)</td><td>Corning</td><td>21-020-CV</td><td>Con calcio y magnesio añadidos, pH 7.1-7.4</td></tr><tr><td>Tripsina 0.25%</td><td>Gibco</td><td>25300-056</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina 0.05%</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS5</td><td>BioLife Soluciones</td><td>205102</td><td>Medios de congelación</td></tr><tr><td>Vial criogénico</td><td>Corning</td><td>430659</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa</td><td>Sigma</td><td>C1889-50MG</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m Filtro</td><td>de células Greiner Bio-One</td><td>542040</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de vacío esterilizante (0.22&mu; m)</td><td>Corning</td><td>431118</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Cónico</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>15 ml</td><td>Cónico Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>Azul Tripán</td><td>Cellgro</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>Mr Frosty Contenedor de congelación</td><td>ThermoScientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Millicell EZ&nbsp; DIAPOSITIVAS</td><td>Millipore</td><td>PEZGS0416</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-anticuerpo de actinina sarcomérica</td><td>Sigma</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Corning</td><td>356008</td><td></td></tr><tr><td>Bromodeoxyuridina</td><td>BD Biosciences</td><td>51-7581KZ</td><td></td></tr></tbody></table>

el aislamiento y criopreservación de rata neonatal cardiomiocitos

Isolation and Cryopreservation of Neonatal Rat Cardiomyocytes

El cultivo celular se ha vuelto cada vez más importante en la investigación cardíaca, pero debido a la proliferación limitada de cardiomiocitos, el cultivo de cardiomiocitos es difícil y requiere mucho tiempo. Las células más utilizadas son los cardiomiocitos de ratas neonatales (NRCM), que requieren aislamiento cada vez que se necesitan células. El nacimiento de las ratas puede ser impredecible. Se propone la criopreservación para permitir que las células se almacenen hasta que se necesiten, sin embargo, los métodos de congelación/descongelación para los cardiomiocitos primarios son desafiantes debido a la sensibilidad de las células. Utilizando el crioprotector adecuado, el dimetilsulfóxido (DMSO), se logró la criopreservación. Mediante la extracción lenta del DMSO mientras se descongelaban las células, se obtuvieron cultivos con NRCMs viables. El fenotipo de NRCM se verificó mediante tinción inmunocitoquímica para actina α-sarcomérica. Además, las células también mostraron una contracción espontánea después de varios días en cultivo. La viabilidad celular después de la descongelación fue aceptable en un 40-60%. A pesar de esto, los métodos descritos permiten criopreservar y descongelar fácilmente los NRCM. Esto proporciona a los investigadores una mayor flexibilidad en la planificación de experimentos, así como a la reducción del uso de animales.

Después del aislamiento de los cardiomiocitos de rata neonatal, las células se congelaron en nitrógeno líquido, y se pueden almacenar durante al menos varios meses. Típicamente después de la descongelación, la viabilidad se determinó por análisis de azul de tripano será de entre 40-60%. Aunque esto es más bajo que otros tipos de células, con la siembra y la cultura propia de las células se proliferan (figura 1). Con el fin de verificar la contractilidad, las células pueden ser imágenes utilizando un mic...

El aislamiento de cardiomiocitos de rata neonata es un procedimiento lento e impredecible. Este estudio describe métodos para la criopreservación y descongelación de cardiomiocitos de ratas neonatas que permiten un uso más eficiente de las células. Los NRCM descongelados se pueden utilizar para varios experimentos sin necesidad de realizar aislamientos cada vez.

El aislamiento y criopreservación de rata neonatal cardiomiocitos

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is ...

El objetivo general de este procedimiento es criopreservar cardiomiocitos de rata neonatal y posteriormente descongelar las células para su uso en estudios in vitro. Esto se logra cortando el corazón neonatal en pequeños fragmentos. Los cardiomiocitos se disocian entonces enzimáticamente del tejido cardíaco, se criopreservan y finalmente se descongelan para su posterior cultivo celular.Finalmente, las células descongeladas pueden utilizarse para diversos ensayos in vitro, incluyendo el análisis inmunofluorescente de los marcadores cardíacos de interés. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que ahorra tiempo, ya que no requiere realizar un aislamiento completo de cardiomiocitos cuando se necesitan células para un ensayo. La demostración visual de este método es fundamental, ya que las sutilezas relacionadas con el tamaño y la consistencia adecuados de las muestras durante los pasos de aislamiento y procesamiento son difíciles de aprender sin una demostración directa.Después de haber recolectado todos los corazones neonatales, retire cualquier tejido que no sea cardíaco de las muestras y lave los corazones con HBSS mediante agitación suave. Tras un s

isolation-and-cryopreservation-of-neonatal-rat-cardiomyocytes

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Se describe un método rápido para aislar y cultivar las neuronas del hipocampo y la corteza a partir de embriones de roedores. Este protocolo nos permite realizar experimentos en los que los cultivos neuronales casi puros son necesarios.

Aislamiento y cultivo de células neuronales de ratas embrionarias: un protocolo rápido

Los cultivos primarios de cardiomiocitos de ratón son una de las herramientas fundamentales para la investigación de la organización miofibrilar y la función. El siguiente protocolo describe el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos primarios de corazones de ratón neonatales. Los cultivos de cardiomiocitos resultantes pueden usarse posteriormente para una variedad de ensayos biomecánicos, bioquímicos y de células biológica.

Aislamiento y cultivo de cardiomiocitos neonatales Ratón

Este protocolo describe un método de obtención de imágenes de células vivas utilizando cardiomiocitos neonatales primarios de rata después de la transducción lentiviral y adenoviral utilizando microscopía de disco giratorio confocal. Esto permite observaciones detalladas de los procesos celulares en cardiomiocitos vivos.

Imágenes de células vivas de primarias de rata neonatal cardiomiocitos Siguiendo Adenoviral y lentiviral transducción Usando Confocal Spinning disco Microscopía

Se han desarrollado y descrito varios protocolos para el aislamiento de diferentes tipos de células cardíacas de un corazón de rata. Aquí se describe un protocolo optimizado que permite el aislamiento de los principales tipos de células cardíacas de alta calidad (cardiomiocitos, células endoteliales y fibroblastos) de una sola preparación, reduciendo los costos experimentales.

Aislamiento simultáneo de cardiomiocitos de alta calidad, células endoteliales y fibroblastos de un corazón de rata adulto

Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos ventriculares de rata adulta (ARVC). ARVC aislada puede utilizarse para el cultivo de corto y largo plazo. El aislamiento y cultivo de ARVC pueden desempeñar un papel clave en el desarrollo de nuevos regímenes de tratamiento para enfermedades cardíacas.

Aislamiento y cultivo de cardiomiocitos de rata adulta

Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento, la transfección y el cultivo a largo plazo de los cardiomiocitos adultos de ratón y rata.

Aislamiento, Transfección y Cultura a Largo Plazo de Cardiomiocitos adultos de ratón y rata

El estándar de oro en cardiología para experimentos funcionales celulares y moleculares son los cardiomiocitos. Este artículo describe adaptaciones a la técnica no Langendorff para aislar cardiomiocitos de ratón.

Un método simple y efectivo para aislar consistentemente cardiomiocitos de ratón

Este método elimina cualquier invasión importante durante las inyecciones celulares causada por la solución de suspensión celular.

Un nuevo método de inyección celular con una invasión mínima

La médula espinal de los mamíferos adultos contiene células madre/progenitoras neurales (NSPCs) que pueden ser aisladas y expandidas en cultivo. Este protocolo describe la recolección, el aislamiento, el cultivo y el paso de NSPC generados a partir de la región periventricular de la médula espinal adulta de la rata y de donantes de trasplante de órganos humanos.

Aislamiento de células neurales madre / progenitoras de la región periventricular de la rata de Adultos y de la médula espinal humana

Este protocolo describe el aislamiento de las células satélite de músculos de la cabeza branchiomeric de una rata 9 semanas de edad. Los músculos se originan a partir de diferentes arcos branquiales. Posteriormente, las células satélite son cultivadas en un recubrimiento de punto de tamaño de milímetro para estudiar su diferenciación. Este enfoque evita la expansión y pases de las células satélite.

Aislamiento y caracterización de las células satélite de Músculos Rata Head Branchiomeric

Aprende a aislar y criopreservar cardiomiocitos de rata neonatal para estudios in vitro. Este método permite usar células descongeladas en ensayos como inmunofluorescencia sin necesidad de aislamientos repetidos.

El aislamiento y criopreservación de rata neonatal cardiomiocitos

Explorar más videos