Name: Imágenes en vivo de nicotina señalización de calcio inducido y neurotransmisor lanzamiento Junto ventrales hipocampo axones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Aprende a generar preparaciones quiméricas del circuito hipocampo ventral-núcleo accumbens para imagen en vivo de señalización de calcio inducida por nicotina y liberación de neurotransmisores.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a Yehui Qin y Mallory Myers por su soporte técnico. También agradecemos al Dr. Sigismund Huck por proporcionarnos el anticuerpo anti-α4-ECD. Este trabajo cuenta con el apoyo de la subvención de los Institutos Nacionales de Salud NS22061 a L. W. R.

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (NIH Publicaciones Nº 80-23, revisado 2012) y los estudios fueron aprobados por Institucional Cuidado de Animales y el uso de los Comités de Investigación en Stony Brook University (# 1618 y # 1792). 1. vHipp-NACC sinápticas Co-culturas <ol><li> Ratones Sacrificio (día postnatal 0-3, de tipo salvaje (WT) o nAChR α7 línea de ratón transgénico) con CO 2. Decapitar a cada cachorro y guardar la cola en un tubo de 1,5 ml de centrífuga para el genotipado post facto. Realice los siguientes pasos en una campana esterilizada. </li><li> Retire la parte superior del cráneo con tijeras y pinzas para exponer todo el cerebro. A partir de la coyuntura en la que las cortezas cerebrales parte el uno del otro en sentido caudal, obtienen una sección coronal que contiene las cortezas posteriores incluyendo el vHipp 5,21 con un microscopio de disección. </li><li> Diseccionar vTiras de tejido Hipp contienen la región CA1-subiculum a cabo de acuerdo con un desarrollo de atlas de cerebro de ratón 22 (Figura 1A). Transferir a una placa de cultivo de 35 mm que contiene medio de cultivo frío (4 ° C), cortado en pequeñas rodajas finas (alrededor de 100 micras x 100 micras microslices). </li><li> Pre-incubar 12 mm poli-D-lisina / laminina cubreobjetos de vidrio recubiertos dentro de 24 placas de cultivo de tejido bien con medios de cultivo (~ 500 l) durante al menos 30 min en la incubadora a 37 ° C. Retire los medios de comunicación antes de chapado microslices. </li><li> Placa con una pipeta Pasteur pulida al fuego en el centro del cubreobjetos con cantidad mínima de medios de comunicación (~ 50 l, que contiene ~ 20 piezas de microslices) para facilitar la unión de los explantes. Placa microslices vHipp procedentes de un solo animal (ya sea el + / + o el - / - genotipo de la línea transgénica α7) en cada cubreobjetos. </li><li> Después de los explantes se asientan en el cubreobjetos, añadir con cuidado los medios de comunicación adicional (~ 100 l) por The pared de manera que el nivel de los medios de comunicación es lo suficientemente alto para cubrir completamente los explantes en la periferia, pero no los que están en el centro del cubreobjetos. </li><li> Después de un / N incubación O en 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora, dispersar neuronas NACC de días embrionarios 18 de postnatal día 1 ratones WT y añadir a los explantes. <ol><li> Diseccionar tejidos NACC de acuerdo con un desarrollo de atlas de cerebro de ratón 20 (Figura 1B). </li><li> Cortar en trozos pequeños (alrededor de 500 m × 500 m microslices) y transferir a un tubo de 15 ml. </li><li> Tratar con tripsina al 0,25% (2 ml) durante 15 min a 37 ° C. Wash trozos de tejido tres veces con medios de lavado en frío (5 ml, 4 ° C) seguido de un lavado en medio de cultivo frío (5 ml, 4 ° C). Deje reposar la suspensión durante 5 minutos en cada etapa de lavado, y luego verter el sobrenadante con cuidado. </li><li> Disociar las células por trituración suave en 2 ml de medio de cultivo con una pipeta Pasteur pulida al fuego ligeramente. </li><li> Transfer suspensión celular a otro tubo de 15 ml y centrifugar a 2000 x rpm durante 5 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en medios de cultivo en 1 ml por 6 cachorros. Dispersar las células pipeteando suavemente en medios varias veces con una pipeta Pasteur pulida al fuego. </li><li> Añadir 0,25 ml de células NACC dispersas a cada cubreobjetos con explantes vHipp. </li><li> Mantener las culturas en un humidificado 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. Coloque las placas de cultivo en gasas estériles humedecidas para estabilizar mecánicamente y mantener la humedad, lo que facilita la formación de sinapsis. </li></ol></li></ol> 2. La inmunocitoquímica <ol><li> Fijar culturas (5-7 días in vitro) en paraformaldehído al 4% / 4% de sacarosa / PBS (~ 500 l por cubreobjetos, 20 min, RT). </li><li> Culturas permeabilizar con 0,25% de Triton X-100 / PBS (~ 500 l por cubreobjetos, 5 min, RT). </li><li> Culturas bloque con 10% de suero normal de burro en PBS (~ 500 l por cubreobjetos, 30 min, RT) antes de la antibodtinción y. Incubar con anticuerpos primarios O / N a 4 ° C. Usa los siguientes anticuerpos primarios: anti-nAChR (α 4 -ECD 1: 500; anti-α 5 subunidades, 1: 500), anti-transportador vesicular de glutamato 1 (1: 250), anti-GAD65 (1: 100). </li><li> Lavar anticuerpos primarios a cabo con PBS (3 veces / ~ 500 l por cubreobjetos, 5 min) y luego incubar culturas en anticuerpos secundarios conjugados con Alexa 488 (~ 500 l por cubreobjetos, 1: 500) o Alexa 594 (~ 500 l por cubreobjetos , 1: 500) durante 1 hora a 37 ° C. </li><li> Incubar culturas en αBgTx conjugados con Alexa 594 (~ 500 l por cubreobjetos, 1: 1000 en medios de cultivo) durante 45 min a 37 ° C antes de la fijación para el etiquetado α7 superficie * nAChR. </li><li> Montaje y sello cubreobjetos. </li><li> Captura de imágenes con un microscopio de fluorescencia equipado con los objetivos del Plan-apocromáticos (20X con 0,8 NA o 63X aceite con 1,4 NA) y una cámara CCD. </li></ol> 3. FM1-43 Based vesicular Fusión <ol><li> Mantener culturas (5-7 días in vitro) en una cámara de imágenes, montar la cámara en el hilado disco microscopio confocal. Continuamente perfundir (1 ml / min) con cóctel de HBS a temperatura ambiente. </li><li> Detener culturas de perfusión y de carga con 10 M FM1-43 en 56 mM K + ACSF (~ 500 l) durante 90 segundos (tinción), lavar colorante externo de distancia durante 15 minutos con Ca 2+ HBS que contenía ADVASEP-7 (0,1 mM) para secuestrar FM1-43 unida a la membrana. </li><li> Estimular las culturas con 56 mM de K + ACSF (~ 500 l) sin FM1-43 durante 120 segundos (decoloración), vuelva a cargar las culturas con FM1-43 utilizando las mismas condiciones, y lavar de nuevo con Ca 2+ HBS que contenía ADVASEP-7 para 15 min. </li><li> Adquirir FM1-43 imágenes de fluorescencia con disco giratorio microscopio confocal equipado con un objetivo Plan-Apochromat (60X agua con 1,4 NA, de excitación 488 nm, emisión 530 nm) y capturar imágenes con una cámara CCD. </li><li> Recoge imágenes de fluorescencia FM1-43 basales (cada 2 s durante 1 min) Como control pre-nicotina; aplicar la nicotina (1 mM) por perfusión rápida (2 ml / min) durante 1 min, y luego lavar la nicotina a cabo con el coctel HBS. Mantenga imágenes con lapso de tiempo de captura antes, durante y después de la aplicación de nicotina cada 2 s durante 5 min. </li><li> Cuantificar la intensidad de fluorescencia antes de FM1-43 (tinción F) y después (F destaining) aplicación de nicotina en cada botón sináptico. </li><li> Calcular la cantidad total de liberables fluorescencia FM1-43 largo de los axones vHipp cuantificando la diferencia de intensidad de fluorescencia FM1-43 antes y después de la aplicación de la nicotina (Df = tinción F -F decoloración). Analizar fracción de disminución de intensidad de fluorescencia después de la nicotina con la siguiente ecuación: F =% de disminución Delta F / F de tinción. </li></ol> Imagen 4. Calcio <ol><li> Enjuague culturas (5-7 días in vitro) rápidamente con HBS normal, entonces cargar las culturas con 5 M Fluo-4 Ca 2+ indicador (AM éster) y 0,02% de Pluronic F-127 en HBS (2 ml) durante 30 min a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Lave Fluo-4 solución con HBS (3 veces / 5 min). Culturas Regreso a la incubadora (37 ° C / 5% de CO 2) por lo menos durante 30 minutos. </li><li> Mantener culturas en la misma cámara de imágenes y las mismas condiciones que se describen en la sección FM1-43 fusión vesicular en base (consulte el paso 3.1). </li><li> Recoge imágenes Fluo-4 de fluorescencia de proyecciones axonales de las vHipp micro-rebanadas con un objetivo Plan-Apochromat (60X agua con 1,4 NA, de excitación 488 nm, emisión 530 nm) y una cámara CCD. </li><li> Suma de línea de base Fluo-4 imágenes de fluorescencia (cada 10 seg durante 2 min) como control pre-nicotina, aplicar la nicotina (1 mM) por perfusión rápida (2 ml / min) durante 1 min, y luego lavar la nicotina a cabo con cóctel de HBS. Mantenga imágenes con lapso de tiempo de captura antes, durante y después de la aplicación de nicotina cada 10 segundos durante 30 minutos. </li><li> Guarde todos los marcos de las fluo-4 imágenes de fluorescencia primas, la exportación como una serie deImágenes en formato TIFF para su posterior análisis. </li><li> Recoge la intensidad integrada de fluo-4 de fluorescencia a lo largo de los axones vHipp antes y después de la aplicación de la nicotina. </li><li> Normalizar la intensidad de fluorescencia integrada con la siguiente ecuación: Delta F / F = 0 (0 FF) / F 0, donde F 0 es el pre-nicotina intensidad de fondo con corrección de fluorescencia integrado y F es la intensidad de fluorescencia integrada a lo largo de los axones vHipp en cada punto temporal después de la aplicación de nicotina. Analizar y trazar la intensidad de fluorescencia integrado normalizado. </li></ol>

<ol><li>Changeux, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+nicotinic+receptors%3A+structure+and+regulation%2C+role+in+learning+and+reinforcement%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Brain nicotinic receptors: structure and regulation, role in learning and reinforcement.</a> Brain Res Brain Res Rev. 26 (2-3), 198-216 (1998).</li>
<li>Levin, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinic+receptor+subtypes+and+cognitive+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Nicotinic receptor subtypes and cognitive function.</a> J Neurobiol. 53 (4), 633-640 (2002).</li>
<li>Dani, J. A., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinic+acetylcholine+receptors+and+nicotinic+cholinergic+mechanisms+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Nicotinic acetylcholine receptors and nicotinic cholinergic mechanisms of the central nervous system.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 699-729 (2007).</li>
<li>Mineur, Y. S., Picciotto, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+receptors+and+depression%3A+revisiting+and+revising+the+cholinergic+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Nicotine receptors and depression: revisiting and revising the cholinergic hypothesis.</a> Trends Pharmacol Sci. 31 (12), 580-586 (2010).</li>
<li>Zhong, C., Talmage, D. A., Role, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+elicits+prolonged+calcium+signaling+along+ventral+hippocampal+axons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Nicotine elicits prolonged calcium signaling along ventral hippocampal axons.</a> PloS one. 8 (12), e82719(2013).</li>
<li>McGehee, D. S., Heath, M. J., Gelber, S., Devay, P., Role, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+enhancement+of+fast+excitatory+synaptic+transmission+in+CNS+by+presynaptic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nicotine enhancement of fast excitatory synaptic transmission in CNS by presynaptic receptors.</a> Science. 269 (5231), 1692-1696 (1995).</li>
<li>Gray, R., Rajan, A. S., Radcliffe, K. A., Yakehiro, M., Dani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+synaptic+transmission+enhanced+by+low+concentrations+of+nicotine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hippocampal synaptic transmission enhanced by low concentrations of nicotine.</a> Nature. 383 (6602), 713-716 (1996).</li>
<li>Dickinson, J. A., Kew, J. N., Wonnacott, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+alpha+7-+and+beta+2-containing+nicotinic+acetylcholine+receptors+modulate+excitatory+amino+acid+release+from+rat+prefrontal+cortex+nerve+terminals+via+distinct+cellular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Presynaptic alpha 7- and beta 2-containing nicotinic acetylcholine receptors modulate excitatory amino acid release from rat prefrontal cortex nerve terminals via distinct cellular mechanisms.</a> Mol Pharmacol. 74 (2), 348-359 (2008).</li>
<li>Zappettini, S., Grilli, M., Salamone, A., Fedele, E., Marchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-synaptic+nicotinic+receptors+evoke+endogenous+glutamate+and+aspartate+release+from+hippocampal+synaptosomes+by+way+of+distinct+coupling+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Pre-synaptic nicotinic receptors evoke endogenous glutamate and aspartate release from hippocampal synaptosomes by way of distinct coupling mechanisms.</a> Br J Pharmacol. 161 (5), 1161-1171 (2010).</li>
<li>Zappettini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+nicotinic+alpha7+and+non-alpha7+receptors+stimulate+endogenous+GABA+release+from+rat+hippocampal+synaptosomes+through+two+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Presynaptic nicotinic alpha7 and non-alpha7 receptors stimulate endogenous GABA release from rat hippocampal synaptosomes through two mechanisms of action.</a> PloS one. 6 (2), e16911(2011).</li>
<li>Fabian-Fine, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+distribution+of+the+alpha7+nicotinic+acetylcholine+receptor+subunit+in+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural distribution of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor subunit in rat hippocampus.</a> J Neurosci. 21 (20), 7993-8003 (2001).</li>
<li>Jones, I. W., Barik, J., O'Neill, M. J., Wonnacott, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha+bungarotoxin-1.4+nm+gold%3A+a+novel+conjugate+for+visualising+the+precise+subcellular+distribution+of+alpha+7%2A+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Alpha bungarotoxin-1.4 nm gold: a novel conjugate for visualising the precise subcellular distribution of alpha 7* nicotinic acetylcholine receptors.</a> J Neurosci Methods. 134 (1), 65-74 (2004).</li>
<li>Nashmi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+alpha4beta2+nicotinic+acetylcholine+receptors+assessed+with+functional+fluorescently+labeled+subunits%3A+effects+of+localization%2C+trafficking%2C+and+nicotine-induced+upregulation+in+clonal+mammalian+cells+and+in+cultured+midbrain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Assembly of alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors assessed with functional fluorescently labeled subunits: effects of localization, trafficking, and nicotine-induced upregulation in clonal mammalian cells and in cultured midbrain neurons.</a> J Neurosci. 23 (37), 11554-11567 (2003).</li>
<li>Drenan, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+trafficking%2C+pentameric+assembly%2C+and+subunit+stoichiometry+of+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors+containing+fluorescently+labeled+alpha6+and+beta3+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits.</a> Mol Pharmacol. 73 (1), 27-41 (2008).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological%2C+pharmacological%2C+and+molecular+evidence+for+alpha7-nicotinic+acetylcholine+receptors+in+rat+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological, pharmacological, and molecular evidence for alpha7-nicotinic acetylcholine receptors in rat midbrain dopamine neurons.</a> J Pharmacol Exp Ther. 311 (1), 80-91 (2004).</li>
<li>Parikh, V., Ji, J., Decker, M. W., Sarter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+beta2+subunit-containing+and+alpha7+nicotinic+acetylcholine+receptors+differentially+control+glutamatergic+and+cholinergic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prefrontal beta2 subunit-containing and alpha7 nicotinic acetylcholine receptors differentially control glutamatergic and cholinergic signaling.</a> J Neurosci. 30 (9), 3518-3530 (2010).</li>
<li>Nayak, S. V., Dougherty, J. J., McIntosh, J. M., Nichols, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+changes+induced+by+different+presynaptic+nicotinic+receptors+in+separate+populations+of+individual+striatal+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) changes induced by different presynaptic nicotinic receptors in separate populations of individual striatal nerve terminals.</a> J Neurochem. 76 (6), 1860-1870 (2001).</li>
<li>Richards, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+alpha4%2A+nicotinic+receptors+revealed+by+superecliptic+phluorin%3A+effects+of+a+beta4+amyotrophic+lateral+sclerosis-associated+mutation+and+chronic+exposure+to+nicotine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Trafficking of alpha4* nicotinic receptors revealed by superecliptic phluorin: effects of a beta4 amyotrophic lateral sclerosis-associated mutation and chronic exposure to nicotine.</a> J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).</li>
<li>Colombo, S. F., Mazzo, F., Pistillo, F., Gotti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+trafficking+and+up-regulation+of+nicotinic+ACh+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, trafficking and up-regulation of nicotinic ACh receptors.</a> Biochem Pharmacol. 86 (8), 1063-1073 (2013).</li>
<li>St John, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+trafficking+of+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacol+Sin%22%5BJournal%5D)">Cellular trafficking of nicotinic acetylcholine receptors.</a> Acta Pharmacol Sin. 30 (6), 656-662 (2009).</li>
<li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+type+III+neuregulin+1+is+required+for+sustained+enhancement+of+hippocampal+transmission+by+nicotine+and+for+axonal+targeting+of+alpha7+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Presynaptic type III neuregulin 1 is required for sustained enhancement of hippocampal transmission by nicotine and for axonal targeting of alpha7 nicotinic acetylcholine receptors.</a> J Neurosci. 28 (37), 9111-9116 (2008).</li>
<li>Jacobowitz, D. M., Abbott, L. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJacobowitz%2C+DM+%22Chemoarchitectonic+Atlas+of+the+Developing+Mouse+Brain%22">Chemoarchitectonic Atlas of the Developing Mouse Brain</a>. , CRC Press. New York. (1998).</li>
<li>Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+fluorescent+staining+and+destaining+of+living+vertebrate+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals.</a> J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).</li>
<li>Amaral, E., Guatimosim, S., Guatimosim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+fluorescent+styryl+dye+FM1-43+to+visualize+synaptic+vesicles+exocytosis+and+endocytosis+in+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using the fluorescent styryl dye FM1-43 to visualize synaptic vesicles exocytosis and endocytosis in motor nerve terminals.</a> Methods Mol Biol. 689, 137-148 (2011).</li>
<li>Garduno, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+alpha4beta2+nicotinic+acetylcholine+receptors+increase+glutamate+release+and+serotonin+neuron+excitability+in+the+dorsal+raphe+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Presynaptic alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors increase glutamate release and serotonin neuron excitability in the dorsal raphe nucleus.</a> J Neurosci. 32 (43), 15148-15157 (2012).</li>
<li>Guo, J. Z., Liu, Y., Sorenson, E. M., Chiappinelli, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+released+and+exogenous+ACh+activates+different+nicotinic+receptors+to+enhance+evoked+glutamatergic+transmission+in+the+lateral+geniculate+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Synaptically released and exogenous ACh activates different nicotinic receptors to enhance evoked glutamatergic transmission in the lateral geniculate nucleus.</a> J Neurophysiol. 94 (4), 2549-2560 (2005).</li>
<li>Szabo, S. I., Zelles, T., Vizi, E. S., Lendvai, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+nicotine+on+spiking+activity+and+Ca2%2B+dynamics+of+dendritic+spines+in+rat+CA1+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">The effect of nicotine on spiking activity and Ca2+ dynamics of dendritic spines in rat CA1 pyramidal neurons.</a> Hippocampus. 18 (4), 376-385 (2008).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La preparación de co-cultivo describe re-capitula circuitos del hipocampo ventral-accumbens in vitro. Este examen permite la preparación relativamente sencillo y fiable de los perfiles espaciales y temporales por el cual la activación de nAChR pre-sinápticos obtener mejor transmisión glutamatérgica 5, 21. Co-culturas se definen como el crecimiento de diferentes tipos de células específicas en un plato que puede proporcionar condiciones fisiológicas in vitro para ...

Modulación de la excitabilidad colinérgica circuito contribuye a aspectos fundamentales de la cognición, y alterado modulación colinérgica es una característica de trastornos neurodegenerativos y neuropsiquiátricos incluyendo la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, la esquizofrenia y la adicción 1-4. Un mecanismo establecido de la facilitación de la transmisión sináptica colinérgica en el sistema nervioso central es a través de la activación directa de nAChR localizadas en los sitios pre-sinápticas. La activación de estos receptores presinápticos conduce a un aumento de Ca2 + intracelular ([Ca 2 +] i) en los terminales presinápticos - tanto de forma directa, debido a la relativamente alta conductancia de calcio de ciertos subtipos de nAChR, e indirectamente, a través de cascadas de señalización intracelular 5, mejorando de este modo la liberación de neurotransmisores. De hecho, la activación de nAChR pre-sinápticos se ha relacionado con los cambios en la liberación de una amplia variedad de neurotransmisores incluyendo glutamato, GABA, ACh, unand dopamina 6-10. Aunque este proceso se ha estudiado indirectamente usando métodos electrofisiológicos en varias sinapsis, los reporteros ópticas de [Ca2 +] i y el reciclado de vesículas sinápticas permiten una medición más directa y temporalmente precisa de los fenómenos pre-sinápticos. Localización presináptica de nAChR se ha demostrado de forma convincente con el etiquetado inmuno-oro directa de nAChR en el microscopio electrónico (EM) nivel de 11,12. Varias otras técnicas también se han utilizado para tratar la localización nAChR indirectamente, incluyendo la detección de lugares de nAChRs subunit- quimeras de proteínas fluorescentes en neuronas cultivadas 13,14, registro electrofisiológico de las corrientes de nAChR en las terminales sinápticas 15,16, seguimiento de los cambios inducidos por la nicotina en [Ca 2 +] i en las terminales nerviosas sinápticas de imágenes en vivo de células 17, y la supervisión indirecta de la liberación de neurotransmisores en la terminal sináptica portécnicas de imagen de células vivas con indicadores fluorescentes, incluyendo exocitosis de vesículas sinápticas vistos por estirilo tintes anfipáticas FM (FM1-43 y FM4-64) y / o synapto-pHluorin y por los reporteros fluorescentes neurotransmisores específicos, como CNiFERs de ACh y iGluSnFr para el glutamato 18-20. En general, estos enfoques actuales para la identificación de la localización presináptica de nAChR son complicados y requieren sistemas y técnicas especiales para permitir la identificación fiable y monitorización fisiológica de la actividad presináptica. Aquí se describen los protocolos y equipos para un sistema de co-cultivo in vitro de un hipocampo ventral (vHipp) - núcleo accumbens (NACC) de circuito que proporciona acceso directo a identificar y analizar los dos componentes pre y post-sinápticos de la transmisión sináptica. Mostramos ejemplos de localización presináptica de nAChR y la imagen de células vivas de nAChR mediada por Ca 2 + de señalización y la liberación de neurotransmisores aloaxones ng vHipp. Una extensión natural (y sencillo) del protocolo que se presenta aquí es la preparación de los contactos pre y post-sináptica compuestos por neuronas de diferentes genotipos. De esta manera la contribución de un producto génico particular, a la pre y / o post-sinápticas mecanismos de modulación se puede evaluar directamente.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Medios de cultivo (50 ml)</td></tr><tr><td>Neurobasal&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>10888022</td><td>48 ml</td></tr><tr><td>B-27 Suplementos</td><td>GIBCO</td><td>0080085-SA</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>GIBCO</td><td>10908-010</td><td>0,5 ml</td></tr><tr><td>GlutaMAX Suplemento</td><td>GIBCO</td><td>35050-061</td><td>0,5 ml</td></tr><tr><td>Factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF)</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td colspan="4">2. medios de lavado (HBSS, 100 ml)</td></tr><tr><td>HBSS, sin calcio, sin magnesio, sin rojo de fenol&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>14175-095</td><td>99 ml</td></tr><tr><td>HEPES ( 1M)</td><td>GIBCO</td><td>15630-130</td><td>1 ml</td></tr><tr><td colspan="4">3. solución salina tamponada HEPES&nbsp; (HBS)&nbsp; &nbsp; pH=7.3</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888&nbsp;</td><td>135 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333&nbsp;</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266&nbsp;</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>CaCl2,</td> <td>Sigma</td><td>C1016 y nbsp;</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma</td><td>G0350500&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td colspan="4">4. Cóctel HBS para imágenes en vivo pH=7.3</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888&nbsp;</td><td>135 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333&nbsp;</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266&nbsp;</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>CaCl2,</td> <td>Sigma</td><td>C1016 y nbsp;</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma</td><td>G0350500&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>tetrodotoxina&nbsp;</td><td>Tocris</td><td>1078</td><td>2 y micro; M</td></tr><tr><td>bicucullina</td><td>Tocris</td><td>131</td><td>10 &micro; M</td></tr><tr><td>D-AP-5</td><td>Tocris</td><td>105</td><td>50 y micro; M</td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Tocris</td><td>1045</td><td>20 &micro; M</td></tr><tr><td>LY341495</td><td>Tocris</td><td>1209</td><td>10 &micro; M</td></tr><tr><td colspan="4">5. Sin calcio&nbsp; HBS&nbsp; &nbsp; pH=7.3</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888&nbsp;</td><td>135 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333&nbsp;</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266&nbsp;</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma</td><td>G0350500&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td colspan="4">6. 56 mM Potasio ACSF pH=7.4</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>119 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td>56 mM</td></tr><tr><td>MgSO4.7H</td><td>Sigma</td><td>M1880</td><td>1.3 mM</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td>2.5 mM</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>26.2 mM</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma</td><td>G0350500&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr></tbody></table>

imágenes en vivo de nicotina señalización de calcio inducido y neurotransmisor lanzamiento junto ventrales hipocampo axones

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

La mejora sostenida de la señalización axonal y el aumento de la liberación de neurotransmisores mediante la activación de los receptores nicotínicos de acetilcolina presinápticos (nAChRs) es un mecanismo importante para la neuromodulación por acetilcolina (ACh). La dificultad para acceder al sondeo de los mecanismos de señalización dentro de los axones intactos y en las terminales nerviosas, tanto in vitro como in vivo, ha limitado el progreso en el estudio de los componentes presinápticos de la plasticidad sináptica. Aquí presentamos una preparación génica-quimérica del circuito ventral del hipocampo (vHipp)-accumbens (nAcc) in vitro que permite obtener imágenes directas en vivo para analizar los componentes pre y postsinápticos de la transmisión, al tiempo que varía selectivamente el perfil genético de las neuronas pre y postsinápticas. Demostramos que las proyecciones de los microcortes de vHipp, como entrada axonal presináptica, forman múltiples sinapsis glutamatérgicas confiables con objetivos postsinápticos, las neuronas dispersas de nAcc. Se detecta la localización presináptica de varios subtipos de nAChRs y se monitoriza la transmisión sináptica mediada por señalización nicotínica presináptica mediante registro electrofisiológico concurrente e imágenes de células vivas. Esta preparación también proporciona un enfoque informativo para estudiar los mecanismos pre y postsinápticos de la plasticidad sináptica glutamatérgica in vitro.

La preparación empleada consiste en genes quiméricos co-cultivos de circuitos vHipp-NACC in vitro. Las proyecciones que emanan de microslices vHipp, como entrada axonal presináptica, pueden hacer contactos sinápticos con las metas post-sinápticas, las neuronas dispersas de NACC. Indujo un (≥ 30 min) la facilitación sostenida de la transmisión glutamatérgica de las neuronas NACC inervados por vHipp nicotina axones 21 y prolongada de calcio de señalización a lo largo de los axones vHipp 5 tr...

Desarrollamos una preparación génica-quimérica del circuito ventral hipocampo-accumbens in vitro que permite obtener imágenes directas en vivo para analizar los mecanismos presinápticos de la transmisión sináptica mediada por los receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs). Esta preparación también proporciona un enfoque informativo para estudiar los mecanismos pre y postsinápticos de la plasticidad sináptica.

Imágenes en vivo de nicotina señalización de calcio inducido y neurotransmisor lanzamiento Junto ventrales hipocampo axones

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

El objetivo general de este procedimiento es generar una preparación quimérica génica del circuito ventral del hipocampo-accumbens in vitro que permita la obtención directa de imágenes en vivo para identificar y analizar tanto los componentes presinápticos como postsinápticos de la transmisión sináptica. Esto se logra primero mediante la disección de tiras de tejido del hipocampo ventral que contienen la región CA1 CIC. El segundo paso consiste en cortar las tiras del hipocampo ventral en pequeñas láminas delgadas y luego sembrar estas microláminas en el centro del cubreobjetos dentro de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos durante la noche.A continuación, diseccionar el núcleo accumbens a partir de los tejidos cerebrales. El paso final consiste en disociar las franjas del núcleo accumbens en neuronas dispersas mediante tripsina y añadir las neuronas del núcleo accumbens sobre el cubreobjetos previamente sembrado con implantes del hipocampo ventral e incubar durante cinco a siete días. Finalmente, localización presináptica de los receptores de acetilcolina nicotínicos y la señalización de calcio mediada por receptores de acetilcolina nicotínicos, así como la liberación de neurotransmisores.A lo largo de los axones del hipocampo ventral se pueden identificar y monitorear mediante imágenes confocales de disco giratorio en células vivas. La principal ventaja de esta técnica es que la preparación de microtrozos con cultivo celular disociado permite un reconocimiento sencillo de sus exones presinápticos y de sus objetivos postsinápticos. In vitro, la preparación de cultivo conjunto recrea el circuito del hipocampo ventral al accumbens in vitro.Esto permite la obtención directa de imágenes en vivo de los compartimentos presináptico y postsináptico, ya sea uno u otro o ambos. Esta preparación sináptica in vitro permite obtener imágenes de alta resolución de los efectos espaciales y temporales de la activación de receptores presinápticos sobre la transmisión sináptica glutamatérgica. Como resultado, se puede obtener información sobre los mecanismos presinápticos y postsinápticos que contribuyen a la plasticidad sináptica glutamatérgica antes de la recolección del tejido.Incube previamente cubreobjetos de vidrio de 12 milímetros recubiertos con poli-L-lisina laminada en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos con 500 microlitros de medio de cultivo a 37 grados Celsius durante al menos 30 minutos. Luego, retire el medio antes de sembrar las microrebanadas para recolectar el tejido para cultivo. Retire la parte superior del cráneo para exponer todo el cerebro de cada cría sacrificada bajo un microscopio estereoscópico.Comenzando en la unión donde los cortices cerebrales se separan entre sí, obtenga una sección coronal que contenga los cortices posteriores, incluyendo los hipocampos ventrales. A continuación, diseque los tejidos del hipocampo ventral que contienen las regiones del cuerpo caudado. Después, transfiera los tejidos a una placa de cultivo de 35 milímetros que contenga medio de cultivo frío.Posteriormente, corte los tejidos en rebanadas delgadas más pequeñas. Coloque las rebanadas en el centro del cubreobjetos con una pipeta Pasteur pulida con fuego. Añada 50 microlitros de medio para facilitar la fijación de los explantes x.Luego, plaque los microtrozos del hipocampo ventral sobre el cubreobjetos; después de que los explantes X se hayan asentado suavemente sobre el cubreobjetos, agregue 100 microlitros adicionales de medio por la pared del recipiente, de modo que el nivel del medio sea suficientemente alto para cubrir completamente los explantes en la periferia, pero no los del centro del cubreobjetos. A continuación, incube los explantes durante la noche en un ambiente con 5% CO₂ a 37 grados Celsius antes de la dispersión de las neuronas del núcleo accumbens. Ahora obtenga los tejidos del núcleo accumbens desde el día embrionario 18 hasta el día posnatal uno de ratones tipo, córtelos en trozos pequeños y luego transfiéralos a un tubo de 15 mililitros.Trate los tejidos con dos mililitros de tripsina al punto 25 % durante 15 minutos a 37 grados Celsius. Posteriormente, lave los tejidos tres veces con cinco mililitros de medio de lavado a cuatro grados Celsius y deje reposar la suspensión durante cinco minutos en cada paso de lavado. A continuación, lave los tejidos en cinco mililitros de medio de cultivo a cuatro grados Celsius.A continuación, disocie las células mediante agitación suave en dos mililitros de medio de cultivo con una pipeta Pasteur ligeramente pulida con llama. Posteriormente, transfiera la suspensión celular a otro tubo de 15 mililitros y centrifugue a 2000 RPM durante cinco minutos. Tras cinco minutos, retire el sobrenadante S y resuspenda las células en medio de cultivo a un mililitro por cada seis crías, luego disperse las células pipeteando suavemente el medio varias veces con una pipeta Pasteur pulida con llama.Al final, agregue 25 mililitros de las células dispersas del núcleo accumbens a cada cubreobjetos con los explantes del hipocampo ventral. Coloque las placas de cultivo sobre gasas estériles humedecidas para estabilizar mecánicamente y mantener la humedad, con el fin de facilitar la formación de sinapsis. A continuación, incube las placas a 5%CO2 a 37 grados Celsius.En este procedimiento, transfiera los cultivos a una cámara de imagen, uno a la vez. Monte la cámara en el microscopio confocal de disco giratorio. Perfunda continuamente la muestra con cóctel HBS a un mililitro por minuto a temperatura ambiente.A continuación, detenga la perfusión y tiña el cultivo con 10 micromolar de FM 1-43 en A CSF con 56 milimolar de potasio durante 90 segundos. Luego, lave el colorante externo durante 15 minutos con HBS sin calcio que contenga 0,1 milimolar de A-D-V-A-S-E-P siete. Después de eso, desestimule el cultivo con A CSF con 56 milimolar de potasio sin FM 1-43 durante 120 segundos.Para la retención. Recargue la cultura con FM 1-43 en las mismas condiciones y lave nuevamente con HBS sin calcio que contenga A-D-V-A-S-E-P siete durante 15 minutos. Ahora adquiera las imágenes fluorescentes de FM 1-43 con un microscopio confocal de disco giratorio equipado con un objetivo plan apocromático y capture las imágenes con una cámara CCD.Recolecte imágenes fluorescentes de FM 1-43 de línea base cada dos segundos durante un minuto como control previo a la nicotina. Luego, aplique un micromolar de nicotina mediante perfusión rápida a dos mililitros por minuto durante un minuto, antes de lavar la nicotina con el cóctel HBS. Continúe capturando las imágenes de lapso de tiempo antes, durante y después de la aplicación de nicotina cada dos segundos durante cinco minutos.En este paso, enjuague rápidamente los cultivos con HBS normal. Luego cargue los cultivos con indicador de calcio flu oh cuatro de cinco micromolar y 0,02% de F1 27 en dos mililitros de HBS durante 30 minutos a 37 grados Celsius y 5% de CO2. Posteriormente, lave la solución de flu oh cuatro con HB S tres veces, cada lavado durante cinco minutos.Devuelva las cultivos al incubador durante al menos 30 minutos. Luego transfiera los cultivos uno a la vez a la cámara de imagen. En las mismas condiciones que se describieron en los procedimientos de fusión vesicular basados en FM 1-43.Recolecte las imágenes fluorescentes de referencia de las proyecciones axónicas provenientes de los microcortes del hipocampo ventral como control previo a la nicotina. A continuación, aplique un micromolar de nicotina mediante perfusión rápida a dos mililitros por minuto durante un minuto, y luego elimine la nicotina con el cóctel HBS. Continúe capturando imágenes de lapso de tiempo antes, durante y después de la aplicación de nicotina cada 10 segundos durante 30 minutos.Esta figura demuestra directamente que las proyecciones provenientes de microcortes del hipocampo ventral son glutamatérgicas y que los contactos se establecen con neuronas GABAérgicas dispersas. Se encontraron tanto receptores nicotínicos de acetilcolina alfa siete como no alfa siete en los axones del hipocampo ventral, específicamente en los sitios donde las proyecciones del hipocampo ventral contactan con neuronas del núcleo accumbens. Cabe destacar que las neuronas dispersas del núcleo accumbens no expresan receptores nicotínicos de acetilcolina alfa siete, lo que indica que los grupos de receptores en los contactos son estrictamente presinápticos.Las imágenes de lapso de tiempo de la fluorescencia de calcio con flu oh cuatro a lo largo de los axones hipocampales ventrales se adquirieron con un objetivo acuático de 60 x cada 10 segundos durante 30 minutos mediante un microscopio confocal de disco giratorio. Las imágenes adquiridas se indicaron en una escala de pseudocolores y se reprodujeron como un video a dos cuadros por segundo. Este video muestra que la aplicación de nicotina indujo una actividad sostenida de fluorescencia de calcio con flu oh cuatro a lo largo de axones hipocampales ventrales vivos de tipo silvestre.Al realizar este procedimiento, es importante recordar sembrar los microtrozos del hipocampo ventral en un volumen mínimo de medio y mantener las placas de cultivo sobre caminos de crecimiento estéreo humedecidos. Estos pasos son fundamentales para la adhesión de los microtrozos, la emisión de proyecciones y la formación de sinapsis. De este modo, este cultivo conjunto permite variar los genotipos de las entradas presinápticas independientemente de sus objetivos postsinápticos.Además, permite la expresión selectiva de genes exógenos en cada compartimento de forma independiente. Esto tiene un gran potencial para analizar los mecanismos pre y post-sinápticos de la plasticidad sináptica. Después de ver este video, debería comprender cómo generar cultivos sinápticos co-culturales quiméricos para genes que recapitulan el circuito del hipocampo ventral hacia el núcleo accumbens.Entonces debería poder utilizar técnicas de imagen en vivo para analizar neuronas pre y posinápticas.

live-imaging-nicotine-induced-calcium-signaling-neurotransmitter

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Hemos desarrollado una nueva técnica para cuantificar los cambios de los receptores nicotínicos de acetilcolina en las regiones subcelulares de los subtipos específicos de neuronas del sistema nervioso central para comprender mejor los mecanismos de la adicción a la nicotina mediante el uso de una combinación de enfoques que incluyen el etiquetado proteína fluorescente del receptor con el golpe-en el enfoque y espectral imagen confocal.

Imagen confocal espectral de marcado con fluorescencia receptores nicotínicos en Knock-en ratones con administración crónica de nicotina

Este video demuestra el proceso de preparación de tejidos del hipocampo ventral y del núcleo accumbens de cerebros de ratón para el co-cultivo. Las neuronas extienden proyecciones para formar conexiones sinápticas entre los tejidos ventral, del hipocampo y del núcleo accumbens. Este método permite estudiar las interacciones neuronales entre estas dos regiones cerebrales, ofreciendo información sobre la cognición, el comportamiento y los trastornos neurológicos.

Co-cultivo de Hipocampo Ventral y Núcleo Accumbens

Este video demuestra cómo la activación mediada por nicotina de los receptores nicotínicos de acetilcolina en el hipocampo ventral del ratón da como resultado una señalización sostenida de calcio a lo largo de los axones.

Imágenes de la señalización de calcio inducida por nicotina a lo largo de los axones del hipocampo ventral en cocultivos sinápticos

Source: Bancroft, E. A., et al. Cuantificación Espontánea Ca2+ Flujos y sus efectos posteriores en las neuronas primarias del mesencéfalo de ratón. J. Vis. Exp. (2020) &lt;p style='line-height:1.2;margin-bottom:0pt;margin-top:0pt;' dir='ltr'&gt;Este video demuestra la visualización en tiempo real de la afluencia de calcio en las neuronas ventrales del mesencéfalo derivadas de embriones de ratón. Utilizando un vector viral para expresar un indicador de calcio, las neuronas se visualizan bajo un...

Visualización de la afluencia de calcio en las neuronas ventrales del mesencéfalo derivadas de embriones de ratón

Source: Lark, A. R., et. al., enfoque de imágenes cerebrales funcionales in vivo basado en el indicador de calcio bioluminiscente GFP-aequorin. J. Vis. Exp. (2016)Este video demuestra imágenes en tiempo real de la dinámica del calcio utilizando la bioluminiscencia de proteína fluorescente verde-aequorina en Drosophila's estructuras cerebrales profundas.

Imágenes de bioluminiscencia para el estudio de transitorios de calcio en estructuras cerebrales de Drosophila

Este artículo presenta un método para el estudio de los receptores acetilcolina nicotínicos (nAChRs) en rebanadas de cerebro de ratón por uncaging de nicotina. Cuando se combina con revisión simultánea abrazadera grabación y láser de 2 fotones microscopía, nicotina uncaging conecta función del receptor nicotínico con morfología celular, proporcionando una comprensión más profunda de la neurobiología colinérgico.

Sondeo de la función de Receptor nicotínico de la acetilcolina en rebanadas de cerebro de ratón mediante fotólisis de destello láser de la nicotina Photoactivatable

Este método describe una preparación crónica que permite el acceso óptico al hipocampo de ratones vivos. Esta preparación se puede utilizar para realizar imágenes ópticas longitudinales de plasticidad estructural neuronal y plasticidad celular evocada por la actividad durante un período de varias semanas.

Imágenes longitudinales de dos fotones del hipocampo dorsal CA1 en ratones vivos

Aquí presentamos un protocolo con el que el calcio pre y/o postsináptico se puede visualizar en el contexto del aprendizaje y la memoria de Drosophila. La imagen de calcio in vivo utilizando sensores de calcio localizados sinaptically se combina con un paradigma de acondicionamiento olfativo clásico de tal manera que se puede determinar la plasticidad sináptica subyacente a este tipo de aprendizaje asociativo.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

El protocolo actual demuestra un método simple para el rastreo de las proyecciones de glutamato del área tegmental ventral (VTA) al hipocampo. La fotoestimulación de las neuronas de glutamato VTA se combinó con el registro de CA1 para demostrar cómo los terminales de glutamato VTA modulan la tasa de disparo piramidal putativa CA1 in vivo.

Trazado anatómico y funcional combinado in vivo de terminales de glutamato del área tegmental ventral en el hipocampo

Este artículo demuestra la preparación de una ventana de encargo de la proyección de imagen complementada con la cánula de la infusión y su implantación sobre la región CA1 del hipocampo en ratones.

Procedimiento De Craneotomía Para La Visualización De Las Actividades Neuronales En El Hipocampo De Comportarse Ratones

Este protocolo describe imágenes de calcio GCaMP in vivo de neuronas intactas del ganglio trigémino (TG). Esta descripción incluye cirugía de exposición TG, imágenes de microscopía confocal in vivo de neuronas TG, aplicación de estímulos somáticos durante imágenes microscópicas de neuronas TG y análisis de datos de imágenes de calcio GCaMP in vivo .

In vivo Imágenes de calcio de conjuntos neuronales en redes de neuronas sensoriales primarias en ganglios del trigémino intactos

Aprende a generar preparaciones quiméricas del circuito hipocampo ventral-núcleo accumbens para imagen en vivo de señalización de calcio inducida por nicotina y liberación de neurotransmisores.

Imágenes en vivo de nicotina señalización de calcio inducido y neurotransmisor lanzamiento Junto ventrales hipocampo axones

Explorar más videos