Name: Aislamiento de células neurales madre / progenitoras de la región periventricular de la rata de Adultos y de la médula espinal humana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Aprenda a aislar células madre neurales de la región periventricular de la médula espinal de ratas y humanos adultos mediante disección enzimática. Este protocolo permite evaluar la formación de neuroesferas para investigación en neurociencia y medicina regenerativa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores desean agradecer el apoyo de Spinal Cord Injury Ontario, el Fondo de Investigación e Innovación de Ontario-China, la Fundación del Hospital General y Occidental de Toronto y la Fundación Physicians' Services Incorporated. Los autores agradecen al Dr. Tasneem Zahir por su asesoramiento experto en el cultivo de NSPC de la médula espinal humana, y a las Dras. Cindi Morshead e Iris Kulbatski por su asesoramiento experto en el aislamiento de NSPC de la médula espinal de rata.

Todos los animales procedimientos son aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad Health Network, Toronto ON Canadá, de acuerdo con las políticas establecidas en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales Experimentales preparados por el Consejo Canadiense de los Animales. Para la recolección de tejido de la médula espinal humana, la aprobación se obtuvo de la Junta Ética de la Investigación Red de Salud de la Universidad y de la Trillium-regalo de la Fundación Vida, que supervisa la donación de órganos en Ontario, Canadá. 1. Preparación de Disección Los tampones y medios de cultivo <ol><li> Para el aislamiento de médula espinal de ratas, preparar 100 ml de tampón de disección (1x PBS + 0,6% de glucosa + 2% de penicilina-estreptomicina) y refrigerar. Para la médula espinal humana preparar 100 ml de tampón de disección (1x HBSS + 0,6% de glucosa + 2% de penicilina-estreptomicina) y refrigerar. </li><li> Preparar medio 100 ml sin suero (SFM) y caliente a 37 ° C. Para preparar el MFS, agregue 2 mM L-glutamina, 100 g / ml de penicilina-estreptomicina, 2% B27, y 10% de la mezcla hormona para Neurobasal-A medio. Para preparar la mezcla de hormonas, hacer una 1: media / F12 1 DMEM que contenía 0,6% de glucosa, 3 mM NaHCO 3, 5 mM HEPES, 25 mg / ml de insulina, 100 g / ml apo-transferrina, 10 mM de putrescina, 30 nM selenio, y 20 nM de progesterona. </li><li> Preparar el factor enriquecido medios chapado crecimiento EFH (a SFM añadir 20 ng / ml de EGF, 20 ng / ml de bFGF, y 2 mg / ml de heparina) y caliente a 37 ° C. Asegúrese de que EFH humana contiene factores de crecimiento recombinantes humanos (véase la Tabla de Materiales). </li></ol> 2. Recolección y Disección de adulto Rata periventricular Tejido de la médula espinal <ol><li> Esterilizar los instrumentos de disección en etanol y enjuague con solución salina estéril, o instrumentos de autoclave con antelación. Dar de rata (6 - 8 semanas de edad) una inyección letal de pentobarbital de sodio (1 cc a 65 mg / ml) o sobredosis de anestésico (es decir, 4% isofluorano) según una de institución aprobó el protocolo animal. Douse la parte trasera de la rata con 70% de etanol y quitar la piel en la superficie dorsal con grandes tijeras de disección. </li><li> Sosteniendo las tijeras perpendiculares a la superficie dorsal, transversalmente cortar la columna vertebral por encima de las extremidades posteriores. Con unas tijeras pequeñas para cortar longitudinalmente el músculo dorsal que recubre la columna vertebral en una dirección rostral para exponer las apófisis espinosas. </li><li> Comenzando en el extremo caudal expuesta, inserte gubia o un instrumento pequeño hueso de corte romo extradurally en la cara lateral del canal espinal en el espacio entre la médula espinal y la columna vertebral. Hacer pequeños cortes en la lámina (arcos óseos izquierdo y derecho de las apófisis espinosas en cada lado de las vértebras) y cuidadosamente retire la lámina para exponer la médula espinal (Figura 1A-D). Asegúrese de que el ángulo de las palas es poco profunda y paralela a la cuerda de modo que la médula espinal subyacente no está dañado. </li><li> Continuar laminectomía en dirección rostral a expose la médula espinal torácica y cervical. </li><li> Escindir suavemente la espina dorsal de la columna vertebral con pinzas de tejido contundentes y uso microtijeras para cortar cuidadosamente las raíces para liberar el cable. Coloque la médula espinal extirpado en una placa de Petri que contiene 4 ° C tampón de disección estéril rata (descrito más arriba en 1.1). Enjuague el tejido en 4 ° C tampón de disección recién preparados y con unas tijeras cortar la médula espinal transversalmente en segmentos de 1 cm (Figura 1E). </li><li> Para cada segmento de tejido, utilice una mano para sujetar el tejido con unas pinzas finas. Con la otra mano, use microtijeras para eliminar cuidadosamente las meninges que recubren, la materia blanca, y la mayor parte de la materia gris, con la ayuda de un microscopio de disección. Alternativamente, utilizar unas pinzas finas (Dumont # 4) a despegarse la mayor parte de la materia gris y blanca, dejando sólo la región periventricular de la médula espinal que incluye el epéndimo y una pequeña cantidad de materia gris circundante (Figura 1F-H).</li><li> En común el tejido periventricular diseccionado en una placa de Petri de 10 cm estéril que contiene tampón de disección rata frío. </li></ol> 3. Recolección y Disección de adulto periventricular humano Tejido de la médula espinal Nota: el tejido de la médula espinal humana se cosecha de donantes de trasplante de órganos adultos (donantes con edades de 2 a 60 años de edad) después de que los otros órganos se han eliminado para el trasplante de órganos. El Trillium-Regalo del Programa Vida obtiene el consentimiento para la extracción de tejido con fines de investigación de la familia del paciente y notifica a nuestro equipo de recolección en el momento oportuno de tal manera que hemos sido capaces de cosechar las cuerdas dentro de 2 horas de pinzamiento aórtico. Se aceptan donantes adultos masculinos y femeninos con serología negativa y no hay infecciones. <ol><li> Tejido de cosecha de una manera estéril en el quirófano a través de un abordaje anterior usando la misma exposición anterior ya diseccionado para la extracción de órganos por el órgano Transpequipo de recolección lant. </li><li> Exponer la columna vertebral anterior a través de la retracción con grandes esparcidores de costillas y grandes retractores de pádel de los tejidos y órganos que quedan incluidos los grandes vasos sanguíneos. </li><li> Use una sierra esternal montado con una larga hoja para cortar a través de los discos intervertebrales en los extremos rostral y caudal de la longitud deseada de la columna vertebral a ser resecado. Ángulo de la sierra cerca de 45 ° en sentido medial para cortar un canal triangular de la parte lateral de los cuerpos vertebrales de detención justo en el canal espinal. </li><li> Eliminar en bloque los aspectos mediales de los cuerpos vertebrales de los segmentos deseados con la ayuda de osteotomos curvos y mazo teniendo cuidado de evitar el corte a través de la duramadre. A continuación, levante suavemente la dura cubierta de la médula espinal con pinzas dentadas y agudamente incidir los extremos rostral y caudal de la médula. Use las tijeras largas y fórceps para seccionar bilateralmente las raíces individuales. </li><li> Coloque el segmento escindido de la médula espinal en 4 °; C tampón estéril (1x HBSS + 0,6% de glucosa + 2% de penicilina-estreptomicina) en un tubo de ensayo grande para el transporte a la sala de cultivo de tejidos. </li> <li> Nota: Por lo general, un 3 - segmento de 6 cm de la médula espinal de la columna torácica superior y / o media-baja nivel torácico se retira de la sala de operaciones bajo condiciones estériles, tan pronto como sea posible después de la interrupción de la circulación y se colocaron en tampón estéril fría . El tiempo transcurrido entre el cese de la circulación y la eliminación de la médula espinal varía con el tiempo requerido para cosechar los órganos específicos para la donación y ha oscilado entre 45 min a 2 horas. Si también se han eliminado el corazón y los pulmones, la disección puede ser tomado lejos rostral para cosechar una porción de la médula cervical inferior, así. </li><li> Diseccionar el tejido de la médula espinal humana tan pronto como sea posible después de la cosecha, generalmente dentro de 3 hrs. Retire la duramadre y otros meninges con fórceps. Enjuague el tejido de la médula espinal en recién hecho 4 ° C y tampón de diseccióncortar transversalmente en segmentos de 1 cm. </li><li> Con la ayuda de un microscopio de disección, extirpar las meninges que recubren, la materia blanca, y la mayoría de la materia gris utilizando pinzas de tejido, unas pinzas finas y microtijeras para cada segmento de tejido. En común el tejido diseccionado periventricular, que incluye el epéndimo y una pequeña cantidad de materia gris circundante, en una placa de Petri de 10 cm estéril que contiene tampón de disección humana frío. </li></ol> 4. Aislamiento y cultivo de adulto Rata y NSPCs Médula Espinal Humanos <ol><li> Realice los siguientes pasos asépticamente en una campana de flujo laminar. <ol><li> Picar la rata disecada o tejido periventricular humano en 1 mm 3 piezas con micro tijeras. </li><li> Enzimáticamente disociar el tejido picado con enzimas proteolíticas utilizando el kit de la disociación de papaína como se indica en la tabla de materiales / reactivos. Nota: Los componentes reactivos incluyen 4 viales; Vial 1: solución salina equilibrada de Earle (EBSS), Vial 2: containin papaínag L-cisteína y EDTA, Vial 3: Deoxyribonuclease I (DNasa), Vial 4: inhibidor de la proteasa ovomucoide con albúmina de suero bovino (BSA). Nota: Nota: La papaína es una proteasa sulfhidrilo que tiene amplia especificidad de sustratos proteicos. La papaína en el presente documento se deriva a partir del látex de la planta de Carica papaya y degrada la mayoría de los sustratos de proteína más ampliamente que las proteasas pancreáticas. Durante el proceso de disociación hay algún daño celular causando ADN para ser liberado en el medio de disociación que aumentará la viscosidad y hacer pipeteando difícil. Por lo tanto, la ADNasa se incluye en el procedimiento de aislamiento de células para digerir el ADN sin dañar las células intactas. Ovomucoides se glicoproteína inhibidores de la proteasa utilizados para inhibir la actividad de papaína después de la etapa de disociación. </li></ol></li><li> En el primer uso, reconstituir la mezcla de inhibidor de ovomucoide albúmina (vial 4) con 32 ml de EBSS (vial 1), y luego almacenar a 4 ° C y el uso para aislamientos posteriores.Nota: Esto produce una solución a una concentración eficaz de 10 mg de inhibidor de ovomucoide y 10 mg de albúmina por ml. </li><li> Añadir 5 ml de EBSS (vial 1) a un vial de papaína (vial 2), produciendo una solución en 20 unidades de papaína / ml en 1 mM de L-cisteína con EDTA 0,5 mM. Compruebe que la solución de papaína parece claro cuando está completamente disuelto, si no colocar el frasco en un 37 ° C baño de agua durante diez minutos hasta que la papaína se disuelva por completo para garantizar la plena actividad de la enzima. </li><li> Añadir 500 l de EBSS (vial 1) a un vial de DNasa (vial 3) y mezclar suavemente como DNasa es sensible a la cizalla desnaturalización. Añadir 250 l de la solución de DNasa al vial que contiene la papaína, resultando en una concentración final de aproximadamente 20 unidades / ml de papaína y 0,005% de DNasa. Guardar el saldo de la DNasa vial para su uso posterior. </li><li> Coloque la rata picada o tejido humano en la solución de papaína como se ha preparado en el paso 4.4 anteriormente. Para el aislamiento de tejido humano, dividir el tejido picado por igual entre dosviales de papaína (aproximadamente 0,2 g / vial). </li><li> Incubar a 37 ° C con agitación constante en una plataforma basculante para disociar el tejido en la solución de papaína activada. Incubar el tejido de rata durante 45 min a 1 hr, y el tejido humano durante 1 a 2 horas, dependiendo de la cantidad de tejido picado, sobre desde 0,2 hasta 0,4 g respectivamente. </li><li> Se tritura la mezcla con una pipeta de 10 ml para disociar cualquier piezas de tejido restantes para producir una suspensión de células nublado. Transferir la suspensión celular (no incluyen piezas de tejido no disociado) en un tubo cónico de 15 ml estéril y se centrifuga a 300 g durante 5 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Resuspender las células sedimentadas en medio que contiene ovomucoide, un inhibidor de la papaína. <ol><li> Preparar la solución de ovomucoide mediante la mezcla de 2,7 ml EBSS (vial 1) con 300 l de la solución de inhibidor-albúmina ovomucoide reconstituido (vial 4) en un tubo cónico de 15 ml. Añadir 150 l de solución de DNasa (vial 3) guardados en el paso 4.4 anterior. </li><li> Descartar el sobrenadante delas células sedimentadas y de inmediato volver a suspender el sedimento celular en la mezcla de albúmina-inhibidor de ADNasa diluida. </li></ol></li><li> Células intactas separados de las membranas celulares por centrifugación a través de un gradiente de densidad discontinuo solo paso. <ol><li> Prepare el gradiente de densidad discontinuo mediante la adición de 5 ml de solución de albúmina-inhibidor (vial 4) a un tubo de 15 ml, y usando una pipeta de 5 ml, con suavidad y la capa lentamente la suspensión de células (preparado como se describe anteriormente en la etapa 4.8) en la parte superior de la solución de albúmina-inhibidor. </li><li> Centrifugar a 70 xg durante 6 min a TA. </li><li> Nota: La interfaz entre las dos capas de la gradiente debe ser claramente visible, aunque mezcla mínima en este límite no afecta el resultado. Fragmentos de membrana permanecen en la interfase y células disociadas de pellets en la parte inferior del tubo. </li></ol></li><li> Para células de rata, descartar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células en 1 ml de rata medio EFH (pre-calentado a 37 ° C).Contar densidad de células vivas con un hemocitómetro y la placa de las células en un matraz de cultivo T25 a una densidad de 10 células / l en EFH. El rendimiento típico de las células a partir de tejido de rata es de aproximadamente 2 x 10 6 células con aproximadamente el 80% viability.If cultivos clonales se desea, las células de semillas a una densidad de menos de 10 células / mL. Incubar los matraces a 37 ° C en 5% de CO 2 y permiten que los cultivos crezcan en reposo durante 1 semana para evitar la agregación de las esferas. </li><li> Para células humanas, desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 10 ml de medio de EFH humano (pre-calentado a 37 ° C). Se filtra la suspensión celular a través de un filtro de células de 40 micras nylon siguió con 30 ml de EFH para eliminar los fragmentos de mielina y de la membrana celular. Centrifugar a 300 xg durante 5 minutos y resuspender el sedimento celular en 1 ml de medio de EFH. </li><li> Contar densidad de células vivas con un hemocitómetro y la placa de las células humanas en placas de cultivo de 6 pocillos a una densidad de 10 5 células / pocillo en un volumen totalde 5 ml EFH / pocillo. El rendimiento típico de las células de tejido humano es de aproximadamente 1 x 10 6 células con aproximadamente el 70% de viabilidad. Pozos pre-capa con un sustrato adherente como Matrigel (ver nota abajo). Diluir en una proporción de 40 l Matrigel: 1 ml SFM. </li><li> Nota: Como alternativa, se pueden utilizar otros sustratos adherentes tales como poli-D-lisina / laminina, fibronectina, o colágeno. </li><li> Incubar las placas a 37 ° C en 5% de CO 2 y permitir que los cultivos crezcan en reposo durante 1 semana. </li></ol> 5. pases de rata adulta y NSPCs médula espinal humanos <ol><li> NSPCs Rat formarán pequeños neuroesferas aproximadamente 70 micras de diámetro dentro de 1 semana de siembra inicial; NSPCs rata pasaje semanales mediante la recopilación de la suspensión celular, centrifugación a 300 xg durante 5 min, y triturando mecánicamente el sedimento de células para disociar las neuroesferas. </li><li> Semilla las células disociadas en matraces T25 que contienen rata fresca medio EFH. Alternativamente,utilizar 50% de medio acondicionado de rata para los pases. El rendimiento típico de NSPCs rata en pases es de unos 5 x 10 6 células que aumenta exponencialmente con el número de pases. </li><li> Para los cultivos humanos, una semana después del recubrimiento inicial, reemplace la mitad del medio de cultivo fresco con EFH dos veces por semana para permitir que las células se adhieran al sustrato. Generalmente, 1 - 2 semanas más tarde una vez que las células se han unido al sustrato, reemplazar todo el volumen de medio de cultivo dos veces a la semana con EFH fresco. </li><li> Células subcultura antes de llegar a la confluencia entre 4-8 semanas. <ol><li> Células de subcultivo separando las células del sustrato enzimáticamente (véase la Tabla de Materiales) con 2 ml de enzima por pocillo se incubó durante aproximadamente 10 min a 37 ° C. Recoger suspensión de células, centrifugar a 300 xg durante 5 min, y resuspender suavemente el sedimento celular en 1 ml de medio de EFH recién hecho. </li><li> Contar las células vivas con un hemocitómetro y placa las células en placas de cultivo de 6 pocillos (pre-coado como anteriormente en la etapa 4.12) a una densidad de 10 5 células / pocillo en un volumen total de 5 ml de HEP / pocillo. El rendimiento típico de NSPCs humanos en pases es de aproximadamente 2 x 10 6 células y en general este será el doble con el pasaje. En general, mantener los cultivos con 50% de medio acondicionado EFH 2 - 3 veces por semana entre pases. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mammalian neural stem cells.</a> Science. 287, 1433-1438 (2000).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Gritti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotential+stem+cells+from+the+adult+mouse+brain+proliferate+and+self-renew+in+response+to+basic+fibroblast+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor.</a> J Neurosci. 16, 1091-1100 (1996).</li>
<li>Morshead, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+in+the+adult+mammalian+forebrain%3A+a+relatively+quiescent+subpopulation+of+subependymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells.</a> Neuron. 13, 1071-1082 (1994).</li>
<li>Weiss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+CNS+stem+cells+are+present+in+the+adult+mammalian+spinal+cord+and+ventricular+neuroaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Multipotent CNS stem cells are present in the adult mammalian spinal cord and ventricular neuroaxis.</a> J Neurosci. 16, 7599-7609 (1996).</li>
<li>Martens, D. J., Seaberg, R. M., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+infusions+of+exogenous+growth+factors+into+the+fourth+ventricle+of+the+adult+mouse+brain+increase+the+proliferation+of+neural+progenitors+around+the+fourth+ventricle+and+the+central+canal+of+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo infusions of exogenous growth factors into the fourth ventricle of the adult mouse brain increase the proliferation of neural progenitors around the fourth ventricle and the central canal of the spinal cord.</a> Eur J Neurosci. 16, 1045-1057 (2002).</li>
<li>Kulbatski, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocytes+and+radial+glia+derived+from+adult+rat+spinal+cord+progenitors%3A+morphological+and+immunocytochemical+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocytes and radial glia derived from adult rat spinal cord progenitors: morphological and immunocytochemical characterization.</a> J Histochem Cytochem. 55, 209-222 (2007).</li>
<li>Akesson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+and+neuronal+survival+after+intraspinal+transplantation+of+human+spinal+cord-derived+neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Behav%22%5BJournal%5D)">Long-term culture and neuronal survival after intraspinal transplantation of human spinal cord-derived neurospheres.</a> Physiol Behav. 92, 60-66 (2007).</li>
<li>Dromard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+human+spinal+cord+harbors+neural+precursor+cells+that+generate+neurons+and+glial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Adult human spinal cord harbors neural precursor cells that generate neurons and glial cells in vitro.</a> J Neurosci Res. 86, 1916-1926 (2008).</li>
<li>Mothe, A. J., Zahir, T., Santaguida, C., Cook, D., Tator, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem%2Fprogenitor+cells+from+the+adult+human+spinal+cord+are+multipotent+and+self-renewing+and+differentiate+after+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neural stem/progenitor cells from the adult human spinal cord are multipotent and self-renewing and differentiate after transplantation.</a> PLoS One. 6, e27079(2011).</li>
<li>Huettner, J. E., Baughman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+identified+neurons+from+the+visual+cortex+of+postnatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats.</a> J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).</li>
<li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+the+adult+mouse+neural+stem+cells+using+the+neurosphere+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+and+neurospheres--re-evaluating+the+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship.</a> Nat Methods. 2, 333-336 (2005).</li>
<li>Singec, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+actual+sensitivity+and+specificity+of+the+neurosphere+assay+in+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology.</a> Nat Methods. 3, 801-806 (2006).</li>
<li>Louis, S. A., Azari, H., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural-colony+forming+cell+assay%3A+an+assay+to+discriminate+bona+fide+neural+stem+cells+from+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Neural-colony forming cell assay: an assay to discriminate bona fide neural stem cells from neural progenitor cells.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Louis, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+neural+stem+and+progenitor+cells+in+the+neural+colony-forming+cell+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay.</a> Stem Cells. 26, 988-996 (2008).</li>
<li>Conti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-independent+symmetrical+self-renewal+of+a+mammalian+tissue+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell.</a> PLoS Biol. 3, e10(2005).</li>
<li>Pollard, S. M., Conti, L., Sun, Y., Goffredo, D., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adherent+neural+stem+%28NS%29+cells+from+fetal+and+adult+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Adherent neural stem (NS) cells from fetal and adult forebrain.</a> Cereb Cortex. 16, Suppl 1. i112-i120 (2006).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Durante la disección de la médula espinal de ratas cuidado el tejido se debe tomar para no dañar la médula espinal en el desempeño de la laminectomía. Es más fácil de aislar el tejido periventricular cuando los segmentos de la médula espinal están intactos. Los segmentos de tejido deben sumergirse plenamente en el tampón de disección y las meninges que recubren y la materia blanca se pueden cortar a medida que tiras longitudinales con micro tijeras. Alternativamente, fórceps de tejidos finos se pueden utilizar para pela...

NSPCs son células multipotentes comprometidas con el linaje neuronal que puede auto renovar y ampliar fácilmente in vitro. Nos referimos a estas células como una población mixta de células madre / progenitoras neurales ya que presentan propiedades de las células madre multipotentes auto-renovación y progenitores más restringidas. NSPCs se encuentran tanto en el cerebro fetal y adulto y la médula espinal 1,2. En el adulto, NSPCs son normalmente quiescente y residen en nichos específicos, incluyendo la zona subventricular recubre los ventrículos laterales 2-4, y la región periventricular que rodea el canal central de la médula espinal 5,6. Típicamente, NSPCs se cultivan como neuroesferas flotantes o monocapas como adherentes en medio libre de suero suplementado con EGF y bFGF, mitógenos que seleccionan para las poblaciones de células madre / progenitoras. El ensayo neuroesfera desarrollado originalmente por Reynolds y Weiss 2, se usa más comúnmente para la cultura y laexpandir las células madre neurales. NSPCs muestran multipotencia cuando se sembraron en medio que contiene suero factor libre crecimiento, diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. Multipotentes, NSPCs auto-renovación pueden ser aisladas y cultivadas a partir de la roedor adulto de la médula espinal cuando el tejido cultivado incluye regiones del canal central 6,7. Una ventaja potencial en el uso de NSPCs generados a partir de la médula espinal adulta en oposición a la generación de células de otras regiones es que estas células específicas de tejido se asemejan más estrechamente células en la médula espinal que se pierde o se daña después de una lesión o enfermedad. Trabajo previo mostró que neuroesferas derivadas de la médula espinal adulta humana no podrían ser propagadas a largo plazo o pases para generar un número suficiente de células 8,9. Sin embargo, con modificaciones en las condiciones de cultivo, se informó de la expansión y el trasplante de médula NSPCs derivadas de la médula humanos adultos, lo que demuestra que la auto-renovacióny NSPCs multipotentes se pueden aislar de la médula espinal adulto humano de donantes de trasplante de órganos 10. En primer lugar, la eliminación de la mayor parte de la materia blanca durante la disección y el cultivo de estas células sobre un sustrato adherente en un medio enriquecido con factor de crecimiento seleccionado para la proliferación de la médula espinal NSPCs adultos humanos. En este protocolo se describe la recolección de la médula espinal de rata adulta y de donantes humanos de trasplante de órganos, la disección del tejido periventricular, y el aislamiento, cultivo y expansión de NSPCs.

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>Life Technologies</td><td>#10010023</td><td>Tampón de disección</td></tr><tr><td>1x HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>#14175095</td><td>Tampón de disección</td></tr><tr><td>D-glucosa</td><td>Sigma</td><td># G-6152</td><td>Prepare una solución madre de glucosa al 30% para tampón de disección y mezcla de hormonas</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>#15140-148</td><td>Tampón de disección y medio de cultivo</td></tr><tr><td>Neurobasal-A&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>#10888-022 Medio de</td><td>cultivo</td></tr><tr><td>L-glutamina, 200 mM</td><td>Life Technologies</td><td>#25030-081 Medio de</td><td>cultivo</td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>#12587010</td><td>Medio de cultivo</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>#11885084</td><td>Mezcla de hormonas</td></tr><tr><td>F12</td><td>Life Technologies</td><td>#21700-075 Mezcla de</td><td>hormonas</td></tr><tr><td>NaHCO 3</td><td>Sigma</td><td># S-5761</td><td>Prepare una solución madre de NaHCO<3/sub> al 7,5% para la mezcla de hormonas</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>#H9136</td><td>Prepare 1M de solución madre HEPES para mezcla de hormonas</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>#I-5500</td><td>Mezcla de hormonas</td></tr><tr><td>Apo-transferrina</td><td>Sigma</td><td>#T-2252</td><td>Mezcla de hormonas</td></tr><tr><td>Putrescina</td><td>Sigma</td><td># P7505</td><td>Hormona </td></tr><tr><td>mix Selenio</td><td>Sigma</td><td>#S-9133 Mezcla de</td><td>hormonas</td></tr><tr><td>Progesterona</td><td>Sigma</td><td>#P-6149 Mezcla de</td><td>hormonas</td></tr><tr><td>EGF, Sigma de ratón#E4127</td><td></td><td></td> <td>Prepare 100 &mu; existencias de g/ml en B27 y alícuotas; Medio EFH</td></tr><tr><td>EGF, Sigma recombinante humano#E9644</td><td></td><td></td> <td>Prepare 100 &mu; existencias de g/ml en B27 y alícuotas; Medio EFH</td></tr><tr><td>bFGF, Sigma recombinante humano#F0291</td><td></td><td></td> <td>Prepare 100 &mu; existencias de g/ml en B27 y alícuotas; Medio EFH&nbsp;</td></tr><tr><td>Heparina, 10.000 U</td><td>Sigma</td><td>#H3149</td><td>Preparar existencias de 27,3 mg/ml en mezcla de hormonas y alícuota; </td></tr><tr><td>Kit de disociación de papaína</td> medio EFH <td>Worthington Biochemicals</td><td>#LK003150</td><td>Contiene EBSS, papaína, DNasa, inhibidor de la proteasa ovomucoide con BSA</td></tr><tr><td>Pentobarbital sódico</td><td>Bimeda &ndash; Pinzas</td> de tejido <td>DIN 00141704</td><td></td>DIN de MTC</tr><tr>Animal<td>HealthInc: Addisons</td><td>Fine Science Tools</td><td>#11006-12&nbsp;</td><td>Punta estándar dentada; micropunta también disponible</td></tr><tr><td>Pinzas finas: Dumont #4</td><td>Fine Science Tools</td><td>#11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Microtijeras</td><td>Fine Science Tools</td><td>#15024-10</td><td>Vannas</td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Bausch & Mango redondo Lomb</td><td>N1430</td><td></td></tr><tr><td>10 mm Placas de Petri&nbsp;</td><td>Nunc</td><td>1501</td><td></td></tr><tr><td>T25 Matraces de cultivo</td><td>Nunc</td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m filtro de células de nylon</td><td>VWR</td><td>CA21008-949</td><td></td></tr><tr><td>6 placas de pocillos</td><td>Nunc</td><td>CA73520-906</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, factor de crecimiento reducido (100x)</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Descongele según las instrucciones y congele las alícuotas; use diluido en una proporción de 40 &mu; l Matrigel: 1 ml SFM</td></tr></tbody></table>

aislamiento de células neurales madre / progenitoras de la región periventricular de la rata de adultos y de la médula espinal humana

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Rata adulta y células humanas de la médula espinal neurales madre / progenitoras (NSPCs) cultivadas en medio enriquecido factor de crecimiento permite la proliferación de, y células madre neurales expandibles auto-renovación multipotentes. En condiciones de suero, estas NSPCs multipotentes se diferenciarán, generar neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. El tejido recogido se disocia enzimáticamente en una solución de papaína-EDTA y luego disociado mecánicamente y se separa a través de un gradiente de densidad discontinuo para producir una única suspensión celular que se sembró en medio neurobasal suplementado con factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF ), y heparina. Rata adulta NSPCs médula espinal se cultivan como neuroesferas que flotan libremente y adultos NSPCs médula espinal humanos se cultivan como cultivos adherentes. En estas condiciones, NSPCs de la médula espinal del adulto proliferan, marcadores expresas de células precursoras, y se pueden ampliar de forma continua durante el paso. Estas células pueden abe estudió in vitro en respuesta a diversos estímulos, y los factores exógenos puede ser utilizado para promover restricción linaje neural para examinar la diferenciación de células madre. Multipotentes NSPCs o su progenie también pueden ser trasplantadas en diversos modelos animales para evaluar la reparación regenerativa.

Las células de la médula espinal de ratas adultas cultivadas en cultivo en suspensión en un medio EFH formarán pequeños neuroesferas (colonias de células indiferenciadas) dentro de 1 semana de chapado inicial. En cultivos primarios, la mayoría de las células sembradas morirán y las células madre de factor de respuesta de crecimiento se proliferan y se seleccionan en el medio EFH. Por el paso 3, habrá numerosos neuroesferas que flotan libremente alrededor de 100 micras de diámetro (Figura 2A). Neuroesfer...

La médula espinal de los mamíferos adultos contiene células madre/progenitoras neurales (NSPCs) que pueden ser aisladas y expandidas en cultivo. Este protocolo describe la recolección, el aislamiento, el cultivo y el paso de NSPC generados a partir de la región periventricular de la médula espinal adulta de la rata y de donantes de trasplante de órganos humanos.

Aislamiento de células neurales madre / progenitoras de la región periventricular de la rata de Adultos y de la médula espinal humana

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar células madre neurales de la región paraventricular de la médula espinal de rata adulta o humana. Esto se logra primero mediante la extracción de la médula espinal mediante laminectomía. El segundo paso consiste en cortar transversalmente la médula espinal en segmentos de un centímetro y diseccionar la región paraventricular de cada segmento de la médula espinal.A continuación, el tejido picado se corta en trozos de un milímetro y luego se disocia enzimáticamente. El paso final consiste en separar las células intactas mediante centrifugación a través de un gradiente de densidad discontinuo y sembrar la suspensión celular. En última instancia, la formación de neuroesferas y el crecimiento de células madre neurales pueden evaluarse mediante microscopía de inmunofluorescencia.Hoy voy a demostrar cómo aislar células madre neurales de la región paraventricular de la médula espinal de rata adulta. Estas células pueden utilizarse luego para ayudar a responder preguntas clave en el campo de las células madre neurales, como qué factores exógenos promueven la restricción de linaje o cómo responden estas células a diversos estímulos o estrés. Para comenzar, prepare el cultivo, los medios y los tampones de disección según se describe en el protocolo de texto adjunto.A continuación, tras una sobredosis de anestésico, esterilice la piel de la rata y use tijeras grandes de disección para retirar la superficie dorsal, exponiendo la columna vertebral. Sostenga las tijeras de disección perpendicularmente a la superficie dorsal y en sentido transversal. Corte la columna vertebral por encima de las extremidades posteriores.Luego, utilice tijeras más pequeñas para cortar longitudinalmente el músculo dorsal que recubre la columna vertebral en dirección rostral, con el fin de exponer los procesos espinosos, comenzando por el extremo codal expuesto. Introduzca un pequeño instrumento romo para corte óseo por vía extraoral en la cara lateral del canal espinal, en el espacio entre la médula espinal y la columna vertebral. Coloque la hoja superficial y paralela a la médula.Luego, realice cortes pequeños en la lámina y retire cuidadosamente la lámina para exponer la médula espinal. Este ángulo evita dañar la médula espinal subyacente. Continúe eliminando la lámina en dirección rostral.Para exponer la médula espinal torácica y cervical utilizando fórceps de tejido romo, levante suavemente la médula espinal de la columna vertebral y corte las raíces con tijeras microquirúrgicas. Para liberar la médula, coloque la médula espinal extirpada en una placa de Petri que contenga tampón de disección para rata estéril y frío con hielo. Enjuague el tejido con el tampón de disección frío con hielo y use tijeras para cortar transversalmente la médula espinal en segmentos de un centímetro. Para cada segmento de tejido, use fórceps finos para sostener el tejido con una mano, y con la otra mano use tijeras microquirúrgicas para retirar cuidadosamente la sustancia blanca junto con la mayor parte de la sustancia gris, dejando únicamente la región periventricular de la médula espinal.Introduzca el tejido periventricular diseccionado en una placa de Petri estéril de 10 centímetros que contenga tampón de disección para rata frío con hielo. Para comenzar el aislamiento de células madre neurales de rata, utilice tijeras microquirúrgicas para trocear el tejido periventricular diseccionado en fragmentos de un milímetro cúbico. A continuación, prepare el tampón de disociación enzimática añadiendo primero cinco mililitros de solución salina equilibrada de Earl a un vial de papaina proveniente de un kit de disociación con papaina.Coloque el vial a 37 grados Celsius durante 10 minutos para que la papaina se disuelva completamente y la solución aparezca clara. A continuación, agregue 500 microlitros de solución salina equilibrada de Earl al vial de ADN del kit de disociación. Y tras mezclar suavemente, agregue 250 microlitros de la solución de ADN al vial que contiene papaina y mezcle suavemente.A continuación, agregue aproximadamente 0,2 gramos del tejido picado en el vial y coloque el vial en una plataforma agitadora a 37 grados Celsius durante 45 minutos a una hora. Después de la incubación, pase la mezcla con una pipeta de 10 mililitros para disociar cualquier resto de fragmentos de tejido y obtener una suspensión celular turbia. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico estéril de 15 mililitros y centrifugue a 300 Gs durante cinco minutos.A temperatura ambiente durante la centrifugación, prepare la solución de OVO moid mezclando 2,7 mililitros de solución salina balanceada de Earl con 300 microlitros de la solución reconstituida del inhibidor de albúmina OVO MOID. En un tubo cónico de 15 mililitros, agregue 150 microlitros de la solución de ADN previamente preparada a la solución de oval moid y mezcle invirtiendo el tubo, deseche el sobrenadante de las células sedimentadas e inmediatamente resuspenda el sedimento celular en la mezcla diluida de inhibidor de albúmina con ADN. A continuación, prepare un gradiente de densidad discontinuo añadiendo cinco mililitros de solución de inhibidor de albúmina a un tubo de 15 mililitros y utilizando una pipeta de cinco mililitros, superponga suavemente y lentamente la suspensión celular sobre la solución de inhibidor de albúmina.Centrifugar la muestra a 70 gs durante seis minutos a temperatura ambiente. Una vez finalizado, desechar el sobrenadante y resuspender el botón celular en un mililitro de medio EFH para ratas precalentado, preparado según se describe en el protocolo de texto adjunto. Contar la densidad de células viables con un citómetro de hemocitómetro e inocular las células en un frasco de cultivo T 25 a una densidad de 10 células por microlitro en EFH.Incubar los matraces a 37 grados Celsius en un 5% de dióxido de carbono y permitir que los cultivos crezcan sin perturbaciones durante una semana para evitar la agregación de esferas. Aquí se muestra una sección transversal de la médula espinal de rata teñida con azul rápido de luxol, así como con hematina y eosina para mostrar los límites entre la sustancia blanca y la sustancia gris. El contorno punteado designa el tejido periventricular restante diseccionado que se aisló en este protocolo a partir de esta región.Neurosferas como las que se muestran aquí crecerán flotando libremente en cultivo de suspensión a alta magnificación. Se pueden observar microespículas protruyendo de las neurosferas, las cuales proliferan, como se muestra mediante tinción positiva para KI 67, en la que las neurosferas se disociaron y sembraron en pozos recubiertos con matrigel. Además, expresarán principalmente nestina, que es un marcador de células precursoras neuronales.Tras seguir este procedimiento, pueden añadirse factores exógenos a las células cultivadas para promover la diferenciación. Las células madre neurales adultas o sus progenias también pueden trasplantarse en diversos modelos animales para evaluar su capacidad de reparación regenerativa. Espero que este video sea útil y le deseo buena suerte en sus experimentos.

isolation-neural-stemprogenitor-cells-from-periventricular-region

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Este video presenta un método para aislar células madre/progenitoras neurales del tejido periventricular de la médula espinal en ratas adultas. La técnica incluye la incubación de los fragmentos de tejido en una solución que contiene enzimas proteolíticas para alterar la matriz extracelular y liberar las células. Posteriormente, las células liberadas se colocan en un medio que contiene factores de crecimiento específicos que mejoran la proliferación de troncos y progenitores neurales y...

Aislamiento de células progenitoras madre neurales de la región periventricular de la médula espinal de una rata adulta

Matrices de fibrina que contienen factores de crecimiento se utilizaron para conservar las células madre neurales injertadas en los sitios de la transección completa de la médula espinal. Células injertadas llenaron completamente la cavidad de la lesión y diferenciarse en múltiples tipos de células neuronales, incluyendo las neuronas que se extendían axones en la médula espinal de acogida a través de largas distancias.

Promoción de la supervivencia y la diferenciación de células madre neurales con fibrina y factor de crecimiento cócteles después de la médula espinal severa lesión

Las células madre neurales cosechadas desde el cerebro adulto están aumentando utilizan en aplicaciones que van desde la investigación básica del desarrollo del sistema nervioso para la exploración de potenciales aplicaciones clínicas en medicina regenerativa. Esto hace que el control riguroso de las condiciones de aislamiento y cultivo utilizadas para cultivar estas células críticas para sonar los resultados experimentales.

Cultivo de células madre neurales de Regiones convencionales y no convencionales del cerebro adulto de roedores

Este protocolo describe un nuevo método de cortar mecánico que permite la expansión de la madre y de células progenitoras neurales agregados esféricos sin disociación a una única suspensión de células. Mantener el contacto célula / célula permite un crecimiento rápido y estable durante más de 40 pasajes.

Un método de expansión de GMPc aplicable para agregados de Neural humano madre y células progenitoras derivadas de células madre pluripotentes o tejido cerebral fetal

Aquí se describe un protocolo detallado para la generación simultánea de cultivos de células precursoras neurales, ya sea como monocapas o neuroesferas adherentes, de la zona subventricular y giro dentado de ratones adultos individuales.

Un ratón, dos culturas: Aislamiento y cultivo de adultos Neural las células madre de las dos zonas neurogénicos de ratones individuales

Lesión de la médula espinal es una condición traumática que causa morbilidad severa y alta mortalidad. En este trabajo se describe en detalle un modelo contusión de lesión de la médula espinal en ratones seguido de un trasplante de células madre neurales.

Neural Trasplante de células madre en Experimental contuso Modelo de Lesión de la Médula Espinal

El establecimiento de sistemas de cultivo para la expansión de células madre neurales adultas (aNSCs) permite el examen y la aplicación de aNSCs para la terapia. La zona subcallosa (SCZ) ha sido reconocida recientemente como una nueva región formadora de neuroblastos en ratones adultos. Aquí, se describen los métodos para el aislamiento, la expansión y la diferenciación de las SCZ-aNSC.

Aislamiento y cultivo de células madre adultas neural de la Zona subcallosal Ratón

Existen células del estroma de la médula (MSC) con potencial neural dentro de la médula ósea. Nuestro protocolo enriquece esta población de células a través de un preacondicionamiento hipóxico y luego las dirige a convertirse en células maduras de Schwann.

Precondicionamiento hipóxico de las células progenitoras derivadas de la médula como fuente para la generación de células maduras de Schwann

Aquí, demostramos el funcionamiento de un modelo de lesión mínima de la médula espinal de un ratón adulto que repuestos el nicho central canal vivienda endógeno las células madre neurales (NSC). Mostramos cómo se puede utilizar el ensayo desarrolló para cuantificar la activación y migración de NSCs definitivos y primitivo después de lesión.

Un ensayo desarrolló para evaluar la activación de células neuronales endógenos en un modelo murino de lesión medular mínima

Aquí, presentamos una nueva técnica microquirúrgica para el aislamiento de las células madre neurales de la eminencia gangliónica E13 ratón embrión.

Aislamiento y cultivo de las células madre neurales embrionarias de ratón

Aquí se presenta un método para el aislamiento de células madre neurales y células progenitoras de oligodendrocitos del cerebro de ratas vivas en detalle experimental. Permite múltiples colecciones de estas células de los mismos animales sin comprometer su bienestar.

El método de "ordeño cerebral" para el aislamiento de células madre neurales y células progenitoras de oligodendrocitos de ratas vivas

Aprenda a aislar células madre neurales de la región periventricular de la médula espinal de ratas y humanos adultos mediante disección enzimática. Este protocolo permite evaluar la formación de neuroesferas para investigación en neurociencia y medicina regenerativa.

Aislamiento de células neurales madre / progenitoras de la región periventricular de la rata de Adultos y de la médula espinal humana (Video) | JoVE Journal

Aislamiento de células neurales madre / progenitoras de la región periventricular de la rata de Adultos y de la médula espinal humana

Explorar más videos