Aislamiento de células neurales madre / progenitoras de la región periventricular de la rata de Adultos y de la médula espinal humana

El objetivo general de este procedimiento es aislar células madre neurales de la región paraventricular de la médula espinal de rata adulta o humana. Esto se logra primero mediante la extracción de la médula espinal mediante laminectomía. El segundo paso consiste en cortar transversalmente la médula espinal en segmentos de un centímetro y diseccionar la región paraventricular de cada segmento de la médula espinal.

A continuación, el tejido picado se corta en trozos de un milímetro y luego se disocia enzimáticamente. El paso final consiste en separar las células intactas mediante centrifugación a través de un gradiente de densidad discontinuo y sembrar la suspensión celular. En última instancia, la formación de neuroesferas y el crecimiento de células madre neurales pueden evaluarse mediante microscopía de inmunofluorescencia.

Hoy voy a demostrar cómo aislar células madre neurales de la región paraventricular de la médula espinal de rata adulta. Estas células pueden utilizarse luego para ayudar a responder preguntas clave en el campo de las células madre neurales, como qué factores exógenos promueven la restricción de linaje o cómo responden estas células a diversos estímulos o estrés. Para comenzar, prepare el cultivo, los medios y los tampones de disección según se describe en el protocolo de texto adjunto.

A continuación, tras una sobredosis de anestésico, esterilice la piel de la rata y use tijeras grandes de disección para retirar la superficie dorsal, exponiendo la columna vertebral. Sostenga las tijeras de disección perpendicularmente a la superficie dorsal y en sentido transversal. Corte la columna vertebral por encima de las extremidades posteriores.

Luego, utilice tijeras más pequeñas para cortar longitudinalmente el músculo dorsal que recubre la columna vertebral en dirección rostral, con el fin de exponer los procesos espinosos, comenzando por el extremo codal expuesto. Introduzca un pequeño instrumento romo para corte óseo por vía extraoral en la cara lateral del canal espinal, en el espacio entre la médula espinal y la columna vertebral. Coloque la hoja superficial y paralela a la médula.

Luego, realice cortes pequeños en la lámina y retire cuidadosamente la lámina para exponer la médula espinal. Este ángulo evita dañar la médula espinal subyacente. Continúe eliminando la lámina en dirección rostral.

Para exponer la médula espinal torácica y cervical utilizando fórceps de tejido romo, levante suavemente la médula espinal de la columna vertebral y corte las raíces con tijeras microquirúrgicas. Para liberar la médula, coloque la médula espinal extirpada en una placa de Petri que contenga tampón de disección para rata estéril y frío con hielo. Enjuague el tejido con el tampón de disección frío con hielo y use tijeras para cortar transversalmente la médula espinal en segmentos de un centímetro. Para cada segmento de tejido, use fórceps finos para sostener el tejido con una mano, y con la otra mano use tijeras microquirúrgicas para retirar cuidadosamente la sustancia blanca junto con la mayor parte de la sustancia gris, dejando únicamente la región periventricular de la médula espinal.

Introduzca el tejido periventricular diseccionado en una placa de Petri estéril de 10 centímetros que contenga tampón de disección para rata frío con hielo. Para comenzar el aislamiento de células madre neurales de rata, utilice tijeras microquirúrgicas para trocear el tejido periventricular diseccionado en fragmentos de un milímetro cúbico. A continuación, prepare el tampón de disociación enzimática añadiendo primero cinco mililitros de solución salina equilibrada de Earl a un vial de papaina proveniente de un kit de disociación con papaina.

Coloque el vial a 37 grados Celsius durante 10 minutos para que la papaina se disuelva completamente y la solución aparezca clara. A continuación, agregue 500 microlitros de solución salina equilibrada de Earl al vial de ADN del kit de disociación. Y tras mezclar suavemente, agregue 250 microlitros de la solución de ADN al vial que contiene papaina y mezcle suavemente.

A continuación, agregue aproximadamente 0,2 gramos del tejido picado en el vial y coloque el vial en una plataforma agitadora a 37 grados Celsius durante 45 minutos a una hora. Después de la incubación, pase la mezcla con una pipeta de 10 mililitros para disociar cualquier resto de fragmentos de tejido y obtener una suspensión celular turbia. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico estéril de 15 mililitros y centrifugue a 300 Gs durante cinco minutos.

A temperatura ambiente durante la centrifugación, prepare la solución de OVO moid mezclando 2,7 mililitros de solución salina balanceada de Earl con 300 microlitros de la solución reconstituida del inhibidor de albúmina OVO MOID. En un tubo cónico de 15 mililitros, agregue 150 microlitros de la solución de ADN previamente preparada a la solución de oval moid y mezcle invirtiendo el tubo, deseche el sobrenadante de las células sedimentadas e inmediatamente resuspenda el sedimento celular en la mezcla diluida de inhibidor de albúmina con ADN. A continuación, prepare un gradiente de densidad discontinuo añadiendo cinco mililitros de solución de inhibidor de albúmina a un tubo de 15 mililitros y utilizando una pipeta de cinco mililitros, superponga suavemente y lentamente la suspensión celular sobre la solución de inhibidor de albúmina.

Centrifugar la muestra a 70 gs durante seis minutos a temperatura ambiente. Una vez finalizado, desechar el sobrenadante y resuspender el botón celular en un mililitro de medio EFH para ratas precalentado, preparado según se describe en el protocolo de texto adjunto. Contar la densidad de células viables con un citómetro de hemocitómetro e inocular las células en un frasco de cultivo T 25 a una densidad de 10 células por microlitro en EFH.

Incubar los matraces a 37 grados Celsius en un 5% de dióxido de carbono y permitir que los cultivos crezcan sin perturbaciones durante una semana para evitar la agregación de esferas. Aquí se muestra una sección transversal de la médula espinal de rata teñida con azul rápido de luxol, así como con hematina y eosina para mostrar los límites entre la sustancia blanca y la sustancia gris. El contorno punteado designa el tejido periventricular restante diseccionado que se aisló en este protocolo a partir de esta región.

Neurosferas como las que se muestran aquí crecerán flotando libremente en cultivo de suspensión a alta magnificación. Se pueden observar microespículas protruyendo de las neurosferas, las cuales proliferan, como se muestra mediante tinción positiva para KI 67, en la que las neurosferas se disociaron y sembraron en pozos recubiertos con matrigel. Además, expresarán principalmente nestina, que es un marcador de células precursoras neuronales.

Tras seguir este procedimiento, pueden añadirse factores exógenos a las células cultivadas para promover la diferenciación. Las células madre neurales adultas o sus progenias también pueden trasplantarse en diversos modelos animales para evaluar su capacidad de reparación regenerativa. Espero que este video sea útil y le deseo buena suerte en sus experimentos.