Gel System Concentric para estudiar el papel de Biofísica de Matrix Microambiente en la migración de células en 3D

El objetivo general de este procedimiento es estudiar las características de migración de las células en entornos 3D fisiológicamente relevantes. Esto se logra primero sembrando células en un gel de colágeno interno que luego se encierra en un gel de colágeno externo libre de células con las propiedades de matriz deseadas. A continuación, se permite que las células invadan y migren en el gel exterior, durante el cual pueden ser monitoreadas y analizadas cuantitativamente.

En última instancia, este ensayo de gel concéntrico se utiliza para mostrar cómo el comportamiento de la migración celular se ve afectado por las propiedades biofísicas de la matriz extracelular. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el ensayo de transferencia o el ensayo de arañazo, es que la migración de la célula se produce en un entorno fisiológico relevante cuyas propiedades estructurales y biofísicas son muy fáciles de controlar. La demostración visual de este método es bastante esencial porque la formación del sistema de gel de enrutador interno concentrado es bastante delicada.

Una interfaz de gel adecuada es muy importante para el éxito de este experimento, que a veces puede ser un poco difícil de lograr. Comience con un cultivo de MD MBA 2 31 células listas para cosechar de matraces T 25 con un 80% de fluidez. En primer lugar, la tripsina son las células que utilizan un mililitro de solución por matraz.

A continuación, recoja las células en forma de gránulos utilizando 200 Gs de fuerza durante cuatro minutos, deseche el snat y vuelva a suspender las células en cinco mililitros de cultivo. Medio. Ahora mida la densidad celular con un hemocímetro y determine el volumen necesario para 100 millones de células por mililitro. A continuación, gire las células a 200 g durante cuatro minutos.

Retire el sobrenadante y vuelva a suspender completamente el pellet en el volumen requerido de medio de cultivo libre de suero. Esta suspensión es 10 veces la concentración final del asiento. Para comenzar a reunir las soluciones madre necesarias en un cubo de hielo, incluyen 10 XPBS de agua milq e hidróxido de sodio 0,1 molar.

También enfríe varios tubos de micro centrífuga debajo de una campana, manteniendo la técnica estéril, alícuota la cantidad de colágeno deseada para 50 microlitros de 2,4 miligramos por mililitro de solución de gel interno. A continuación, añada lentamente cinco microlitros de 10 XPBS al colágeno medido. Agite el tubo a medida que se agrega el PBS, pero evite hacer burbujas.

A continuación, ajuste el pH de la mezcla a 7,4 con la solución base. Por lo general, cinco microlitros harán el trabajo. Se proporciona una guía de solución de problemas en el protocolo de texto.

Por último, aumente el volumen hasta 45 microlitros con un medio de cultivo libre de suero dejando espacio para la suspensión de 10 celdas. Para comenzar, agregue cinco microlitros de suspensión celular de 10 x a la solución de colágeno y resuspenda las células completamente en la solución sin formar burbujas de aire. Ahora, a una placa inferior precalentada a vidrio, agregue 20 microlitros de la suspensión al centro.

Bueno, formando una gota en forma de cúpula, si se forma una burbuja se rompe rápidamente o se aspira sin hacer un desastre. Lanzar el gel de la manera correcta puede ser muy complicado, especialmente con soluciones muy viscosas como el colágeno. Trate de evitar producir burbujas tanto como sea posible y no agite la solución una vez que esté lista para polimerizar, porque la hinchazón podría resultar en la alineación de fibras artificiales.

Ahora regrese el plato a la incubadora durante 45 minutos para dejar que la capa interna se polimerice 15 minutos antes de que finalice la incubación. Prepare 200 microlitros de solución exterior de gel de colágeno en hielo. En primer lugar, elimine alícuotas el volumen necesario de colágeno de reserva.

En segundo lugar, agregue lentamente 20 microlitros de 10 XPBS con un suave remolino. A continuación, ajuste el pH a 7,4 como antes, y lleve la solución hasta 200 microlitros con agua Milli Q. Ahora retire el plato de la incubadora y agregue suavemente 180 microlitros de la solución de gel exterior encima de la cúpula de gel interior.

Esto debería cubrir completamente la solución interna y llenar el pozo. No revuelva la solución y evite tocar la solución de gel interior. Si se forma una burbuja al expulsar la solución exterior, rompa rápidamente o vuelva a aspirar la pipeta.

Otro paso importante es asegurarse de obtener una interfaz de gel adecuada. La clave de este paso es añadir la solución de gel exterior. Cuando el gel interior aún no está certificado.

La cinética de gelificación puede variar según la condición de polimerización, y es esencial optimizar esta condición de antemano: para dejar que el gel exterior se polimerice, devuelva la placa a la incubadora durante 45 minutos. Después de 45 minutos, el gel debe estar bastante sólido, pero aún se puede desalojar, agregue con cuidado dos mililitros de medio tibio para sumergir completamente el gel. Esto completa el cultivo en gel concéntrico que se proporciona con un medio fresco cada dos o tres días.

En cuestión de días, las células comenzarán a migrar a la matriz exterior para observar su migración, teñir las células con un rastreador fluorescente. Reemplace los dos mililitros de medio con medio fresco que contenga cinco microlitros de tinte e incube durante 30 minutos después del período de incubación, lave el cultivo con un mililitro de PB S3 veces durante dos o tres minutos por lavado. Después de los lavados, vuelva a llenar el plato con medios normales.

A continuación, coloque la placa en un microscopio con control ambiental. Ahora use una configuración de volumen de uso para escanear las regiones de gel externas junto a la interfaz de gel. Por lo general, escanee en vistas cuadradas de 647 micras de 100 micras de grosor, utilizando intervalos de cinco micras en la pila ZS.

A continuación, escanee las regiones intermedias y finalmente escanee las afueras del gel. Excluya las regiones dentro de las 50 micras de las superficies inferior, superior o lateral para evitar células que puedan estar sufriendo un efecto de borde. Para analizar el movimiento de las celdas a partir de los datos recopilados, primero abra los archivos de imagen en el software de análisis de datos, como imas.

Comience seleccionando el comando surpass y, a continuación, la superficie del comando. Esto abre la opción de rastrear superficies. Con el tiempo, seleccione la región de interés dentro del conjunto de datos, es decir, las coordenadas cartesianas y el período de tiempo.

A continuación, reste el fondo de la región de interés. Para evitar perder una celda en la eliminación de fondo, seleccione la esfera más grande que quepa en el objeto. Ahora, divida los objetos conectados seleccionando el diámetro del punto de inicialización y proceda a clasificar todos los puntos de semilla.

El siguiente paso es clasificar la superficie ahora manualmente. Agrupe los puntos de inicialización que apuntan al mismo objeto. Haga esto entre todos los puntos de tiempo de la región de interés.

Por último, realice un seguimiento de los objetos una vez finalizado el seguimiento, clasifique las pistas de objetos y, a continuación, genere el conjunto de datos cuantitativos para analizar mediante una hoja de cálculo. Después de unos días de cultivos concéntricos en gel, las células rompieron la interfaz interna del gel externo y comenzaron a invadir el gel externo. La población celular se extiende hacia afuera en una dirección predominantemente radial.

Se comparó el movimiento de las células en el gel externo de varias densidades de colágeno. Las imágenes se realizaron durante un período de ocho horas y se calcularon alrededor de 200 trayectorias celulares a partir de cada muestra. Las células de la matriz más delgada fueron las que menos distancia se movieron.

Este cálculo tuvo en cuenta todas las células, no solo las células que migran radialmente hacia afuera. En todos los casos, la distancia total recorrida fue mayor que el desplazamiento neto. Como era de esperar, la persistencia se calculó como una relación entre el desplazamiento y la distancia.

El valor de persistencia de 0,4 sugiere que estas células tenían una migración direccional intrínsecamente débil. Los cálculos de la velocidad media mostraron que la densidad de colágeno no afectó la velocidad de las células. Es posible que el tamaño de los poros de la matriz y la densidad del colágeno, que están inversamente relacionados, tuvieran el efecto opuesto en la velocidad de migración y, por lo tanto, se compensaran entre sí.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo construir un sistema de gel concéntrico y cómo estudiar esta migración de células en un entorno 3D. Siguiendo este procedimiento, se pueden hacer muchas otras cosas como la extracción de células, el análisis de microarrays, donde se puede intentar responder a preguntas adicionales como cuánto se expresan ciertas proteínas durante diferentes puntos de tiempo en la migración.