Imágenes de células vivas durante el estiramiento mecánico

El objetivo general del siguiente experimento es observar el papel de la tensión mecánica en la mecanobiología celular en un tiempo casi real. Esto se logra primero construyendo un sistema con membranas flexibles sobre las cuales se cultivan y estiran células. Como segundo paso, se estira la membrana para calibrar los conteos del motor con la deformación de la membrana.

A continuación, se estiran células epiteliales pulmonares de ratón y se obtienen imágenes de los núcleos. Con el fin de demostrar que la tensión de la membrana se transmite a las células, los estiradores se incorporaron luego en un microscopio de fuerza atómica (AFM) para realizar nanoindentación y medir la rigidez de las células individuales antes y después del estiramiento. Los resultados muestran daño directo en las células debido al estiramiento aplicado.

También basado en imágenes de fluorescencia, se muestra que la producción de especies reactivas de oxígeno aumenta con la tracción. Este método puede responder preguntas clave en el campo de la biología mecánica pulmonar, como si las células epiteliales pueden lesionarse o no con la ventilación mecánica. Este método puede proporcionar información sobre la biología mecánica de las células pulmonares y también puede aplicarse a otros tejidos blandos, como cortes de hígado o de la placa de crecimiento.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la combinación poco convencional de herramientas utilizadas en estos experimentos, como el microscopio de fuerza atómica. Para comenzar, prepare una membrana de PDMS recubierta con colágeno modificada para su uso en cultivo celular, tal como se describe en el protocolo de texto adjunto. A continuación, siembre células epiteliales pulmonares de ratón a una densidad de 2,5 millones de células por pocillo sobre una membrana flexible recubierta con colágeno y estéril.

Incube las células a 37 grados Celsius y 5%CO2 durante dos días hasta que las células alcancen confluencia. Luego, utilice un punzón de biopsia de 1,5 milímetros para hacer dos agujeros en cada una de las seis lengüetas del sujetador, a 20,5 milímetros del centro del constructo si no se desea pretensión. Y retire el medio de cultivo celular.

Asegúrese de que el actuador mecánico esté en una posición de deformación cero y coloque la membrana en el estirador de modo que los orificios coincidan con los pasadores y las abrazaderas. Coloque las abrazaderas superiores y luego apriete los tornillos uno por uno, alternando entre los lados. Añada un mililitro de medio de cultivo celular antes de colocar el dispositivo en la platina del microscopio.

Coloque el dispositivo en el centro del trayecto de luz. A continuación, sujete el dispositivo al portaobjetos. Enfóquese en la membrana ajustando las posiciones en el plano y vertical del dispositivo mecánico mediante el controlador del portaobjetos del microscopio en el bloque de entrada de destino.

Introduzca un valor de conteo motor, que corresponde al nivel de deformación deseado que se aplicará. A continuación, establezca el valor en el bloque de entrada de velocidad en 10 RPM o menos para observar el mismo campo antes y después del estiramiento, ya que el campo puede desplazarse con respecto al objetivo del microscopio, y puede ser necesario ajustar la platina del microscopio durante el estiramiento. Una vez que todo esté configurado, haga clic en iniciar.

Comience realizando ajustes en el microscopio de fuerza atómica. Aumente la altura de la cabeza FM a su posición máxima en la dirección Z. Luego, coloque extensiones en las patas para elevar el plano en el que la palanca FM contacta con la muestra.

A continuación, retire la placa del escáner A FM y el objetivo deseado del microscopio. Añada un espaciador al objetivo y luego vuelva a montarlo en el microscopio. A continuación, coloque la placa del escáner nuevamente en el A FM. La altura del espaciador dependerá del objetivo y de la configuración específica del A FM, pero es necesario utilizar el espaciador si se desea realizar imágenes ópticas, ya que el plano de observación se desplazará en la dirección Z.

A continuación, inicie el software del microscopio de fuerza atómica (A FM), el software del microscopio óptico y todas las fuentes de luz necesarias, incluida la fuente de luz para mediciones de fluorescencia. Monte un chip con una viga en voladizo que tenga una rigidez de 200 piconewtons por nanómetro o menos para medir el módulo elástico de células vivas en el A FM. Luego, alinee el láser; a continuación, monte una cubreobjetos de vidrio en el dispositivo y úsela para calibrar la rigidez del voladizo según las recomendaciones del fabricante. Inmediatamente antes de montar la membrana en el dispositivo de estiramiento, corte las paredes a una altura de aproximadamente un milímetro.

Esto reduce la interferencia experimentada entre las paredes de la membrana y la celda de carga. Luego, retire los medios de cultivo celular y monte la membrana en el dispositivo mecánico. Coloque el dispositivo mecánico con el adaptador en el escáner utilizando el software.

Estire la membrana hasta el nivel deseado de deformación tensil antes de la nanoindentación. Añada 0,5 mililitros o menos de medio sobre las células para mantenerlas hidratadas, pero tenga cuidado de evitar derrames que puedan dañar el escáner de FM o el microscopio. Luego, acople la viga en voladizo con la membrana.

Siga el protocolo del dispositivo de microscopía de fuerza atómica (AFM) específico para escanear las áreas de interés. Cuando se aplicó una deformación del 20 % a células sembradas sobre la membrana, las células se desplazaron un 20 %, como se indica aquí; el impacto de las células sobre la producción de especies reactivas de oxígeno se midió en células epiteliales bronquiales utilizando un sensor acumulativo de superóxido mitocondrial, tal como se describe en el protocolo de texto adjunto. En ausencia de estiramiento mecánico, la producción de ERO no aumentó significativamente durante 60 minutos cuando se aplicó y mantuvo un único estiramiento del 17 %.

Hubo un aumento en las ERO mitocondriales que persistió durante otros 60 minutos con la incorporación del estirador mecánico en el microscopio de fuerza atómica. Se obtuvieron el módulo elástico y mapas de células epiteliales pulmonares de ratón antes y después de una deformación tensil del 10 % a partir de las regiones delimitadas aquí. Se registraron 300 curvas individuales de desviación forzada en un área de 40 por 40 micrómetros, mostrando un cambio en la localización de las regiones de alto módulo con la aplicación de la deformación.

Una vez dominada, la elongación celular puede realizarse en 15 minutos. Mientras que una nanoindentación con microscopio de fuerza puede consumir dos horas para llevarse a cabo adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar manipular las células con cuidado pero con rapidez, ya que los resultados pueden verse afectados negativamente por la agitación y la exposición prolongada al aire ambiente antes de informar los datos. No olvide que trabajar con un microscopio de fuerza puede ser extremadamente desafiante.

Se deben tomar precauciones, como mantener todos los líquidos alejados del escáner, mientras se realiza este procedimiento.