Imágenes de células vivas durante el estiramiento mecánico

El objetivo general del siguiente experimento es observar el papel de la deformación mecánica en la mecanobiología celular casi en tiempo real. Esto se logra construyendo primero un sistema con membranas flexibles en las que se cultivan y estiran las células. Como segundo paso, estire la membrana para calibrar las cuentas motoras con tensión en la membrana.

A continuación, se estiran las células epiteliales pulmonares del ratón y se obtienen imágenes de los núcleos. Con el fin de mostrar que la tensión de la membrana se transmite a las células, los estiradores se incorporaron a la A FM para la nano indentación con el fin de medir la rigidez de las células individuales antes y después del estiramiento. Los resultados muestran daño directo en las células debido al estiramiento aplicado.

También sobre la base de imágenes de fluorescencia, se muestra que la producción de especies reactivas de oxígeno aumenta con el estiramiento. Pues bien, este método puede responder a preguntas clave en el campo de la biología mecánica pulmonar, como si las células epiteliales pueden dañarse con la ventilación mecánica. Este método puede proporcionar información sobre las células pulmonares, la biología mecánica y también se puede aplicar a otros tejidos blandos, como el hígado o los cortes de la placa de crecimiento.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la combinación poco convencional de herramientas utilizadas en estos experimentos, como el microscopio de fuerza atómica. Para comenzar, prepare una membrana de PDMS recubierta de colágeno modificada para su uso en cultivo celular como se describe en el protocolo de texto adjunto. A continuación, sembra células epiteliales pulmonares de ratón a 2,5 millones de células por pocillo en una membrana estéril y flexible recubierta de colágeno.

Incubar las células a 37 grados centígrados y 5% de CO2 durante dos días hasta que las células alcancen la convergencia. A continuación, utilice un punzón de biopsia de 1,5 milímetros para perforar dos agujeros en cada una de las seis lengüetas de sujeción, a 20,5 milímetros del centro de la construcción si no se desea pretensión. Y retire los medios de cultivo celular.

Asegúrese de que el actuador mecánico esté en una posición de deformación cero y coloque la membrana en la camilla de modo que los orificios de perforación se alineen con los pasadores y las abrazaderas. Coloque las abrazaderas superiores en su lugar y luego apriete los tornillos uno a la vez, alternando diferentes lados. Agregue un mililitro de medio de cultivo celular antes de colocar el dispositivo en la platina del microscopio.

Centre el dispositivo en la trayectoria de la luz. A continuación, fije el dispositivo a la etapa. Concéntrese en la membrana ajustando las posiciones en el plano y vertical del dispositivo mecánico con un controlador de etapa del microscopio en el bloque de entrada de destino.

Introduzca un valor de recuento de motores, que corresponda al nivel de deformación deseado que se aplicará. A continuación, establezca el valor en el bloque de entrada de velocidad a 10 RPM o menos para observar el mismo campo antes y después del estiramiento, ya que el campo puede cambiar con respecto al objetivo del microscopio, y puede ser necesario ajustar la etapa del microscopio durante el estiramiento. Una vez que todo esté configurado, haga clic en ir.

Comience por hacer ajustes en el microscopio de fuerza atómica. Aumente la altura del cabezal a FM a su posición máxima en la dirección Z. A continuación, coloque extensores en las patas para levantar el plano en el que un voladizo FM entra en contacto con la muestra.

A continuación, retire la placa del escáner A FM y el objetivo deseado del microscopio. Agregue un espaciador al objetivo y luego vuelva a montarlo en el microscopio. A continuación, vuelva a colocar la placa del escáner en el A FM. La altura del espaciador dependerá del objetivo y de la configuración específica de FM, pero es necesario utilizar el espaciador si se desea obtener imágenes ópticas, ya que el plan de observación se desplazará en la dirección Z.

A continuación, inicie el software A FM, el software del microscopio óptico y todas las fuentes de luz necesarias, incluida la fuente de luz para las mediciones de fluorescencia. Monte un chip con un haz en voladizo que tenga una rigidez de 200 picos newtons por nanómetro o menos para medir el módulo elástico de las células vivas en el A FM. A continuación, alinee el láser, monte un cubreobjetos de vidrio en el dispositivo y utilícelo para calibrar la rigidez del voladizo según las sugerencias del fabricante. Inmediatamente antes de montar la membrana en el dispositivo de estiramiento, corte las paredes a aproximadamente un milímetro de altura.

Esto reduce la interferencia experimentada entre las paredes de la membrana y la célula de carga. A continuación, retire el medio de cultivo celular y monte la membrana en el dispositivo mecánico. Coloque el dispositivo mecánico con el adaptador en el escáner utilizando el software.

Estire la membrana hasta el nivel de deformación por tracción deseado antes de la nano indentación. Agregue 0,5 mililitros o menos de medio sobre las células para mantenerlas hidratadas, pero también tenga cuidado de evitar un derrame que pueda dañar el escáner o el microscopio FM. A continuación, enganche la viga en voladizo con la membrana.

Siga el protocolo del dispositivo A FM en particular para escanear áreas de interés. Cuando se aplicó una deformación del 20% a las células sembradas en la membrana, las células se desplazaron un 20%Como se indica aquí, se midió el impacto de las células en la producción de especies reactivas de oxígeno en las células epiteliales bronquiales utilizando un sensor de superóxido mitocondrial acumulativo como se describe en el protocolo de texto adjunto. En ausencia de estiramiento mecánico, la producción de ROS no aumentó significativamente durante 60 minutos cuando se aplicó y mantuvo un solo estiramiento del 17%.

Hubo un aumento en las ROS mitocondriales que persistió durante otros 60 minutos con la incorporación del estirador mecánico al microscopio de fuerza atómica. Módulo elástico, mapas de células epiteliales pulmonares de ratón antes y después de una deformación por tracción del 10% de las regiones aquí descritas. Se registraron 300 curvas individuales de deflexión forzada en un área de 40 por 40 micrómetros, mostrando un cambio en la localización de regiones de alto módulo con la aplicación de deformación.

Una vez dominado, el estiramiento celular se puede realizar en 15 minutos. Si bien una nano indentación FM puede consumir dos horas de rendimiento adecuado Al intentar este procedimiento, es importante recordar manipular las celdas con cuidado pero rápidamente, ya que los resultados pueden verse afectados negativamente por la agitación y la exposición prolongada al aire ambiente antes de que se informen los datos. No olvide que trabajar con un FM puede ser extremadamente desafiante.

Se deben tomar precauciones como mantener todos los líquidos alejados del escáner mientras se realiza este procedimiento.