Ratón Naïve CD4 ⁺ Aislamiento de células T y In vitro Diferenciación en subconjuntos de células T

El objetivo general del siguiente procedimiento es polarizar las células T positivas CD vírgenes aisladas de los ganglios linfáticos y los bazos de ratón en distintos subconjuntos de células T auxiliares. In vitro, esto se logra procesando primero bazos y ganglios linfáticos recolectados de ratones adultos de tipo salvaje. En el segundo paso, la población de células CD cuatro positivas se enriquece mediante la separación magnética de perlas y luego se clasifica aún más por su expresión previa de marcadores de células T.

En el paso final, las células se tratan con factores activadores del receptor de células T y citocinas polarizantes para inducir su diferenciación en varios linajes de células T auxiliares. En última instancia, citometría de flujo. Elis A y la PCR en tiempo real se utilizan para evaluar la eficiencia de la diferenciación de las células T auxiliares.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las células T colaboradoras, como por ejemplo cómo influye la expresión de moléculas específicas o el tratamiento con fármacos específicos en la naturaleza de la respuesta de las células T. Comience sujetando las extremidades de un ratón C 57 negro de cinco a 10 semanas de edad a la tabla de disección, y luego corte la piel longitudinalmente desde el ano hasta la barbilla, teniendo cuidado de no perforar el tejido peritoneal subyacente. A continuación, abra la piel con alfileres y utilice un par de pinzas para agarrar el ganglio linfático y otro para separar el tejido de cada una de las ubicaciones indicadas en la imagen.

A medida que se extrae cada ganglio linfático, colóquelo en un plato de recolección que contenga PBS suplementado con 1% de FBS o PBS plus, y luego abra con cuidado el peritoneo y retire el bazo. Coloque también el bazo en el plato de recolección y transfiera el plato a un cubo de hielo para enriquecer para el CD cuatro células positivas. Divida los ganglios linfáticos del bazo en dos platos separados de 60 milímetros que contengan tres mililitros de PBS más cada uno con pinzas estériles.

A continuación, coloque un cuadrado de malla de nailon estéril sobre los bazos y use el lado del pulgar de un émbolo de jeringa para aplastarlos suavemente contra la malla hasta que casi todo el tejido quede en suspensión. Coloque la suspensión hacia arriba y hacia abajo varias veces para romper los grumos solubles restantes y luego coloque una nueva pieza de malla de nailon sobre la abertura de un tubo cónico de 15 mililitros. Filtre la suspensión en el tubo para eliminar cualquier residuo restante.

Ahora repita la disociación mecánica de los ganglios linfáticos y llene ambos tubos de células filtradas con PBS plus. A continuación, invierte los tubos unas cuantas veces y gira las celdas hacia abajo. Vuelva a suspender el ganglio linfático en dos mililitros de PBS.

Agregue un mililitro de hielo frío, una solución de CK por ratón a la pastilla de células de bazo. Después de un minuto, detenga la lisis de los glóbulos rojos con 10 mililitros de PBS plus. Invierte el tubo y vuelve a girar las celdas.

A continuación, vuelva a suspender el pellet del bazo en 10 mililitros más de PBS plus, añada las células de los ganglios linfáticos y centrifuga la suspensión de células agrupadas. Esta vez resuspenda el pellet en 15 microlitros de CD cuatro perlas magnéticas diluidas en 85 microlitros de PBS plus por ratón durante 15 a 30 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, diluya las células en 10 mililitros de PBS plus.

Filtre la suspensión a través de un colador de nailon en un nuevo tubo de 15 mililitros y gire las celdas. De nuevo, vuelva a girar el pellet en 100 microlitros de PBS más por ratón y seleccione positivamente para el CD cuatro celdas positivas mediante la selección de perlas magnéticas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de obtener la fracción de células CD cuatro positivas, lave las células con 10 mililitros de PBS plus para clasificar la fracción de células T CD cuatro positivas.

A continuación, etiquete las células con los anticuerpos fluorescentes adecuados durante 15 a 30 minutos a cuatro grados centígrados en la oscuridad después del lavado. Filtre las celdas marcadas para eliminar cualquier residuo y transfiéralas a un tubo de fax en hielo y protéjalo de la luz, clasifique la población CD cuatro positiva, CD 25 negativa, CD 62 L, CD 44 negativa positiva en un medio RPMI completo. Cuando se hayan recogido todas las células.

Lave las células T vírgenes en un medio fresco y completo. A continuación, vuelva a suspender el gránulo y complete el recuento de RPMI de las células T vírgenes y ajuste la concentración a una vez 10 a las seis células por mililitro para inducir la diferenciación in vitro del subconjunto de células T auxiliares. A continuación, lave cada pocillo de las placas de cultivo celular previamente recubiertas con anti CD 3 y anti CD 28 en un mililitro de PBS y placa estériles sin FBS.

Finalmente, las células complementan los medios de cultivo con las citocinas y los anticuerpos bloqueantes adecuados, como se describe en la tabla, e incuban las células a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante cuatro o cinco días después de cuatro o cinco días de cultivo. Se puede realizar la tinción intracelular de citocinas de las células T positivas CD 4 a partir de los cultivos in vitro diferenciados de TH one, TH two treg inducible y TH 17. Para confirmar que cada subconjunto de células T exhibe el perfil de citocinas esperado.

De hecho, después de 24 horas de reestimulación con tres EIS anti CD, A muestra que los subconjuntos exhiben la producción extracelular correspondiente de las proteínas citocinas expresadas intracelularmente. La PCR en tiempo real para factores de transcripción específicos del linaje verifica aún más los perfiles de factores de transcripción apropiados de los subconjuntos de células T positivas CD cuatro diferenciados in vitro. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar y procesar las células espejo de los ganglios linfáticos y el bazo para obtener células T auxiliares positivas para CD cuatro sin previo conocimiento.

Además, podrás diferenciar estos linfocitos T en linfocitos TH uno, TH dos TH 17 o ireg.