Name: Producción Robótica de Cancer Cell esferoides con un sistema acuoso de dos fases para la prueba de la droga (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Aprende a producir esferoides de células cancerosas mediante un sistema acuoso de dos fases con automatización robótica. Este método permite pruebas de fármacos anticancerígenos en formato de alto rendimiento.

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Los autores reconocen la financiación de los Institutos Nacionales de Salud R21CA182333.

1. Preparación de polimérica acuosa sistema de dos fases (ATPS) <ol><li> Pesar 0,5 g de polietilenglicol (PEG) (MW: 35.000) y añadirlo a 9,5 ml de medio de crecimiento completo en un cónica 15 ml estéril para preparar 10 ml de 5% (w / v) PEG fase acuosa. Nota: Adición de la mitad del medio a la cónica primero seguido de la adición del polímero y luego la cantidad restante de medio minimiza la adhesión del polímero a las paredes cónicas y ayuda a que el polímero se disuelve más rápido. </li><li> Pesar 0,128 g de dextrano (DEX) (MW: 500.000) y añadirlo a 0,872 ml de medio de crecimiento completo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril para preparar 1 ml de 12,8% (w / v) de fase acuosa DEX. </li><li> Vortex tanto soluciones durante aproximadamente 1 min para disolver los polímeros en el medio. </li><li> Mantenga ambas soluciones en un baño de agua a 37 ° C durante 1 hora para asegurar la disolución y mezclas homogéneas. Mantenga las tapas por encima del nivel del agua para evitar la posibilidad de contaminación de las soluciones del bañoagua. </li><li> Cargar la solución de fase de PEG en una jeringa de plástico estéril y pasarlo a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras de tamaño de poro para eliminar las impurezas. Nota: llene la jeringa con la solución de PEG, colocarlo en el inserto del filtro en la parte superior de un tubo cónico y el uso de la fuerza, empuje lentamente la solución a través del filtro. Es normal experimentar la resistencia contra el movimiento del émbolo de la jeringa. Pérdida menor de la solución de polímero se produce como parte de la solución permanecerá en el filtro, pero la concentración de polímero no va a cambiar. </li><li> Pipetear 10 l de la solución de fase DEX y diluir en 10 l de medio en un tubo separado para dar lugar a 6,4% (w / v) solución de fase DEX. Aspirar 100 l de la solución de fase de PEG y dispensar en una placa de Petri. <ol><li> Dispensar 0,5 l de la 6,4% (w / v) solución de fase de DEX en la solución de fase de PEG. Confirmar visualmente con éxito la formación de ATPS mediante la observación de una gota DEX bajo un microscopio. El límite gotadebe permanecer visible, indicando la presencia de dos fases acuosas estables, separadas. </li></ol></li><li> Almacenar la madre acuosa PEG y soluciones de fase de DEX en 4 ° C hasta su uso. Nota: Se recomienda que las soluciones de polímero se preparan fresco antes de cada experimento y se usan dentro de las 24 horas de almacenamiento. </li></ol> 2. Preparación para la impresión de cáncer esferoides celulares <ol><li> Se cultivan las células de cáncer de interés (por ejemplo, células MDA-MB-157 de cáncer de mama) a un 90% -100% monocapa confluente. Para MDA-MB-157 células, utilizar un medio compuesto por DMEM que contenía 10% de FBS, 1% de glutamina, y 1% de antibiótico. <ol><li> Cosecha células utilizando un tampón de disociación celular (de acuerdo con el protocolo del fabricante) y cargar la suspensión en una cónica 15 ml. Centrifugar durante 5 min a 173,3 xg, eliminar el sobrenadante y volver a suspender las células en 1 ml de medio de crecimiento completo. </li></ol></li><li> Las celdas de carga en un hemocitómetro y contarlas para calcular el número requeridode células para una densidad celular esferoide deseado. Una monocapa confluente de células MDA-MB-157 células cultivadas en un matraz T75 generalmente da ~ 7 x 10 6 células. Nota:. Densidad celular requerida para un volumen de gota para generar un solo esferoide dependerá del tipo de célula 22 Por ejemplo, una densidad de 1,5 x 10 4 o mayor para la MDA-MB-157 células se recomienda por 0,3 l gota fase de DEX a asegurar la formación de un solo esferoide. </li><li> Centrifugar las células para una segunda vez durante 5 min a 173,3 xg y resuspender en un volumen apropiado de medio de crecimiento para concentrar la suspensión a una densidad celular deseada. Nota: Por ejemplo, si se cosecharon 7 x 10 6 células cancerosas, el volumen total de suspensión de células requerido para formar un esferoide de la densidad de 1,5 x 10 4 células en una gota de fase DEX 0,3 l será 140 l. Sin embargo debido a la dilución con la solución de fase DEX en el siguiente paso, sólo utilizar 70 l de medio de cultivo celular para resuspender las células. </li><li&gt; Añadir a la suspensión de células resultante un volumen igual de la 12,8% (w / v) solución de fase acuosa preparada en la DEX 1.2. Para el ejemplo de esferoide densidad de 1,5 x 10 4 células, 70 l de la solución de fase DEX se añaden a 70 l de suspensión celular. </li><li> Mezclar bien la suspensión de células para asegurar una distribución uniforme de células y la mezcla de solución de DEX. Pipeteado arriba y abajo deben hacerse con cuidado para evitar la formación de burbujas. </li></ol> 3. Preparación para la impresión de los esferoides cocultivaron <ol><li> Se cultivan las células de cáncer (por ejemplo, MDA-MB-157 células de cáncer de mama humano) y células de apoyo (por ejemplo, fibroblastos humanos) a un 90% -100% monocapa confluente. Cosecha de cada tipo de células usando un tampón de disociación celular (de acuerdo con el protocolo del fabricante). <ol><li> Cargar cada suspensión en un cónica 15 ml, centrifugar durante 5 min a 173,3 xg, y el sobrenadante aspirado de cada cónica. Resuspender las células de cada cónica en 1 ml de g completamedio recimiento. Nota: Los tintes fluorescentes tales como calceína AM (tinción de células vivas) y colorantes nucleares (Hoechst) se pueden utilizar para distinguir los dos tipos de células. </li></ol></li><li> Cargar cada tipo de célula por separado en un hemocitómetro y contarlas para calcular el número requerido de cada tipo de célula para una relación deseada de las células de cáncer de células de soporte en co-cultivadas esferoides. Monocapas confluentes de células MDA-MB-157 células y los fibroblastos cultivados en matraces T75 suelen dar ~ 7 x 10 ~ 6 y 6 x 10 6 células, respectivamente. </li><li> Añadir el volumen correcto de la suspensión de células de sostén a las células cancerosas suspensión para dar una relación deseada de la cantidad de dos tipos de células. Por ejemplo, utilizar una proporción de 50 células cancerosas a 1 celular de fibroblastos. </li><li> Centrifugar la cónica que contiene la suspensión celular se mezcló durante 5 min a 173,3 células XG y resuspender en un volumen apropiado para dar como resultado la densidad final que comprende de volúmenes iguales de medio de crecimiento y el 12,8% (w / v) DEX acuosasolución de fase (preparado en 1.2). </li><li> Pipetear suavemente la suspensión celular resultante de arriba a abajo para asegurar la homogeneidad de la suspensión. </li></ol> 4. Impresión de esferoides tumorales en una placa de 96 pocillos <ol><li> Un día antes de los experimentos, recubrir placas no tratadas, de fondo redondo de 96 pocillos con 1% (w / v) Pluronic a 37 ° C durante 24 hr. Este recubrimiento evita la unión de células durante el período de cultivo. </li><li> Dispensar 50 l de la filtró 5% (w / v) PEG fase acuosa en cada pocillo de una (placa de destino) placa de 96 pocillos. </li><li> Con una pipeta, mezclar la suspensión celular (preparado en el paso 2 o el paso 3 de los mono y co-cultivo, respectivamente) y añadir 20 l de la suspensión de todos los demás bien de una columna de una placa de 384 pocillos (placa de fuente) . </li><li> Encienda el manipulador de líquidos y &quot;casa&quot; la cabeza de pipeteado para registrar las coordenadas. A continuación, compile un protocolo previamente definido (por debajo de 4,6) para asegurar el material de laboratorio y los parámetros se definen correctaly. Este paso &quot;homing&quot; puede ser diferente para diferentes manejadores de líquidos. Nota: El flujo del protocolo, se muestra paso a paso a continuación en 4.6, será similar independientemente del manipulador de líquidos robótico utilizado; Sin embargo, la interfaz de programación puede ser diferente debido a la utilización de un software diferente. </li><li> Colocar la placa fuente, la placa de destino, y las cajas de puntas de pipeta en las posiciones definidas en la estación de trabajo del manipulador de líquidos como se muestra en la Figura 1. </li><li> Ejecutar el protocolo que incluye los siguientes pasos: <ol><li> Cargar una columna de barriles de la cabeza de pipeteado del manipulador de líquidos con la mezcla de puntas de pipeta (8 tips) desde la estación de trabajo (Figura 1). </li><li> Mezclar la suspensión celular en pocillos de la placa fuente (Figura 1). Seleccionar un volumen de mezcla más pequeño que el volumen de suspensión celular en pocillos para evitar la formación de burbujas. </li><li> Expulsar puntas en una caja de vertederos vacío (Figura 1). </li&gt; <li> Cargar una columna de barriles de la cabeza de pipeteado con 10 l de dispensación puntas de pipeta (Figura 1). </li><li> Aspirar 0,3 l de la suspensión de células de la placa fuente (Figura 1) en cada punta de la pipeta. </li><li> Dispensar la suspensión de células en los pocillos de una columna de la placa de destino (Figura 1). Utilice una altura de dispensación de 0,5 mm y una velocidad de flujo de dispensación de menor que 1 l / seg. </li><li> Repetir los pasos 4.6.1 a través de 4.6.6 hasta que la impresión de la columna por columna en toda la placa de destino es completa. </li></ol></li><li> Retire con cuidado la placa de destino de la superficie de trabajo y colocarla en una incubadora húmeda a 37 ° C y 5% de CO 2. Mantener la placa horizontal al introducirla a la incubadora para evitar la interrupción de las gotas de la fase de ejecución directa que contienen células. </li><li> Incubar la placa durante 24 horas para permitir la agregación de células en un esferoide dentro de la gota fase DEX. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. Tratamiento de Drogas de esferoides de células cancerosas Tenga en cuenta que el siguiente protocolo es para un tratamiento farmacológico de 4 días e incluye una renovación con el fármaco fresco después de día 2. Puede ser modificado para otros períodos de tratamiento. <ol><li> Confirmar visualmente la formación de esferoides en placas de 96 pocillos después de 24 horas. Si es necesario, pozos de imagen para la medición del tamaño de esferoides promediando los diámetros más pequeños y más grandes de cada esferoide. </li><li> Preparar la solución de stock de un fármaco deseado mediante su disolución en un disolvente recomendado por el fabricante a una concentración de solubilidad predeterminado. Por ejemplo, el cisplatino se disuelva en agua a 2 mg / ml. Nota: Proteja la solución madre de la droga de la luz si el fármaco es sensible a la luz. </li><li> Utilizando la técnica de dilución en serie, preparar concentraciones de fármaco diluido con medio de cultivo celular a partir de la solución madre preparada en la etapa anterior. Cada dilución se debe hacer dos veces la concentración deseada. Dilratios de ution variarán dependiendo de la concentración de stock de partida y concentraciones de trabajo deseada. </li><li> Añadir 50 l de solución de fármaco preparada en el paso anterior a cada pocillo. Esto se puede hacer robóticamente o mediante pipeteo manual. Nota: Cada concentración del fármaco se diluye en medio a la concentración deseada por la fase acuosa PEG 50 l ya en cada pocillo. <ol><li> Utilice esferoides de dos columnas de una placa de 96 pocillos (n = 16) para cada concentración. </li><li> En los pocillos de control, añadir sólo 50 l de medio de cultivo fresco a los 50 l de la fase acuosa PEG existentes. </li></ol></li><li> Incubar esferoides con el fármaco durante 48 horas a 37 ° C y 5% de CO 2, protegido de la luz. </li><li> Después de 48 h de incubación, preparar diluciones frescas de la droga a concentraciones deseadas y renovar de drogas mediante la adición de 50 l de solución de fármaco fresco a cada pocillo. Nota: Los pozos ya contienen la concentración de fármaco deseado a partir de la primera droga tratamiento. Por lo tanto en esta fase de renovación, cada concentración se prepara a la concentración deseada, ya que no se producirá una dilución. </li><li> Incubar esferoides con el medicamento durante otras 48 horas a 37 ° C y 5% de CO 2, protegido de la luz. </li></ol> 6. Análisis de la viabilidad celular en esferoides <ol><li> Después de 48 horas de incubación con el fármaco renovado (es decir, el tiempo total de tratamiento de esferoides con un fármaco es 4 días), medir el volumen total de medio en un pocillo mediante pipeteo manual. Nota: El volumen típico en un pocillo es de ~ 140 l (una pequeña disminución se produce debido a la evaporación). </li><li> Calcular el volumen de reactivo de la viabilidad celular (por ejemplo, PrestoBlue) como la concentración de 10% del volumen total así. Añadir este volumen de reactivo de la viabilidad celular a cada pocillo. Nota: Con un volumen de medios de comunicación existentes de 140 l en un pozo, se requiere un volumen de 15,6 l para dar una concentración 10% del total así. Esto se calculadividiendo el volumen de medios existente por 9 (140 l / 9 = 15,6 l). </li><li> Se incuba la placa con el reactivo de la viabilidad celular a cada pocillo durante 6 horas a 37 ° C, protegido de la luz. </li><li> Colocar la placa en un lector de micro-placa y leer la señal de fluorescencia a 560 nm y 590 nm de excitación y de emisión de longitudes de onda, respectivamente. </li><li> Calcular el porcentaje de viabilidad de las células en los esferoides por la normalización de la señal fluorescente de los pocillos tratados con el de los pocillos de control después de promediar los valores de las mismas condiciones de tratamiento. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Esferoides presentan un modelo realista para entender mejor la fisiología del tumor y la eficacia del fármaco y proporcionar una herramienta útil para el descubrimiento de fármacos anti-cáncer. Dichas aplicaciones se beneficiarían mucho de técnicas sencillas de generación y mantenimiento esferoide que sólo requieren material de laboratorio estándar, herramientas de manejo de líquidos y equipos de control. El uso de un sistema de dos fases acuosa células cancerosas espontáneamente agregados dentro de la fase de caída per...

Ensayos basados ​​en células constituyen un instrumento importante para el desarrollo y descubrimiento de nuevos fármacos contra el cáncer. 1,2 Históricamente, se han empleado cultivos monocapa de células cancerosas para investigar la eficacia de los compuestos candidatos contra determinados tipos de células cancerosas. La facilidad de mantenimiento de los cultivos en monocapa en placas de cultivo estándar, la compatibilidad de placas estándar con herramientas robóticas comerciales para la adición de reactivos, y con los equipos de control para el análisis de aguas abajo de las respuestas celulares a los compuestos químicos son los principales beneficios que hacen que las culturas 2D una herramienta atractiva para las pruebas de drogas. 3 Desafortunadamente, ensayos de células monocapa a menudo fallan para predecir la eficacia de los compuestos in vivo, por lo que el desarrollo de fármacos y el descubrimiento de un proceso extremadamente costoso. 4,5 A pesar de la inversión y el esfuerzo significativo por las compañías farmacéuticas y unidades académicas, sólo ~ 1% de lucha contra el cáncer fueron aprobados fármacos en ensayos clínicospor la FDA en los últimos dos decenios. 6 Disparidad entre las culturas en 2D y el complejo entorno 3D de células cancerosas en vivo es una de las principales deficiencias de los sistemas de cultivo en monocapa. 7 Por lo tanto, el cribado de compuestos candidatos contra las células tumorales en un entorno que se asemeja más el ambiente del tumor 3D puede acelerar el desarrollo de nuevos fármacos para quimioterapia. 8 Esferoides celulares de cáncer presentan un modelo de tumor 3D relevante in vitro. 9,10 esferoides son grupos compactos que se forman a través del conjunto espontánea o inducida de células cancerosas en las superficies no adherentes o en suspensión usando técnicas tales como matraz de centrifugación, recubrimiento líquido, micro microfabricado . bien arrays, microfluídica, y las gotas que cuelgan 11-16 esferoides imitan las características clave de los tumores sólidos, incluyendo la geometría y el transporte limitado de oxígeno, nutrientes y compuestos de la droga en la zona central; Por lo tanto, se regeneran más estrechamente respon drogasSE de tumores sólidos en comparación con los cultivos monocapa. 17-19 A pesar de esta marcado beneficio, esferoides no se utilizan habitualmente para el cribado de compuestos químicos contra las células cancerosas. Dificultad de producir esferoides de tamaño uniforme en un entorno estándar de alto rendimiento que es compatible con la robótica disponibles en el mercado y herramientas de detección / imagen impide la incorporación de la cultura esferoide en línea de desarrollo de fármacos. Aunque los materiales y las placas personalizados se han convertido recientemente disponible en el mercado para hacer frente a esta necesidad, las consideraciones de costo disuaden de su uso generalizado. Dos de las principales técnicas con la capacidad de producir esferoides tamaño consistentes en alto rendimiento de utilizar una nueva plataforma de gota colgante y micro pozos microfabricados. 13,16,20 Sin embargo, ambos enfoques requieren placas y dispositivos que son caros de fabricar e inconveniente para los usuarios de puntos finales especiales en centros de investigación básicos y las industrias farmacéuticas donde lo más importante efse hacen fuertes para el descubrimiento de nuevos fármacos contra el cáncer. A pesar de algunas mejoras en la estabilidad de las gotas que contienen células con un diseño reciente de colgar placas de caída, sólo uno de cada otro agujero de la placa todavía se utiliza durante el cultivo para evitar la propagación / fusión de gotas. 16 Esto disminuye significativamente el rendimiento experimental. Además de Drogas y la renovación es difícil con manual o pipeteo robotizado y esferoides deben ser transferidos a una placa estándar para el análisis bioquímico, porque esta configuración de la placa no es fácilmente compatible con los equipos de control convencional, tal como lectores de placas. 21 Micro-pozos fabricados utilizando litografía blanda también permitir tamaño controlado producción esferoide. 13,20 Sin embargo, la incompatibilidad de esta plataforma con herramientas de pipeteo estándar evita el tratamiento de esferoides individuales con diferentes compuestos de fármacos / concentraciones, exponiendo todos los esferoides a una sola condición de tratamiento. Por lo tanto, este método no es apropiado para altala investigación de compuestos rendimiento que exige la prueba simultánea de múltiples compuestos / concentraciones. Para superar estos obstáculos, una nueva técnica para la producción de alto rendimiento de esferoides de células de cáncer de tamaño uniforme en placas de 96 pocillos estándar ha sido desarrollado. 22,23 El enfoque se basa en un sistema acuoso polimérico de dos fases (ATPS) con polietilenglicol ( PEG) y dextrano (dex) como polímeros formadores de fase. 24 ATPSs Recientemente se han utilizado en una variedad de aplicaciones biológicas celulares nuevas que permitan micropatterning celular y localizada entrega de reactivos biológicos a las células en medios altamente acuosas. 25-32 Para formar una esferoide, las células cancerosas se mezclan con la fase acuosa DEX y una gota sub-microlitros de la suspensión resultante se pipetean en una solución de fase acuosa PEG de la inmersión pocillo que contiene. La caída sigue siendo inmiscible de la fase de inmersión y las células se limita a facilitar la formación de un esferoide. Diablilloortantly, la fase de inmersión altamente acuosa proporciona nutrientes a las células del esferoide y minimiza el problema bien conocido de la evaporación medios de comunicación común a algunos otros ensayos que causa cambios en la osmolalidad medios de comunicación y las fluctuaciones de las concentraciones de fármaco. Esta técnica permite la producción esferoide y el tratamiento de drogas sólo utilizando reactivos comercialmente disponibles y herramientas de pipeteado en placas de 96 pocillos estándar. Es importante destacar que, el análisis de las respuestas celulares de esferoides se realiza en la misma placa utilizando ensayos bioquímicos estándar y lectores de placas. La facilidad de trabajar con SDFA y adaptabilidad del enfoque para el manejo de líquidos robótico hace alta generación de rendimiento tanto de mono-cultura y la co-cultura esferoides una técnica de laboratorio sencillo. Este nuevo enfoque será un gran paso adelante hacia la integración de esferoides de células cancerosas en los procesos de desarrollo y descubrimiento de fármacos con un mejor rendimiento de las pruebas y la rentabilidad (aumento del número de compuestos y redu probadosconsumo ced reactivo) y la eficiencia (reducción de manos a tiempo). Un protocolo detallado para la producción robótico de esferoides de células de cáncer en placas de 96 pocillos utilizando el enfoque ATPS se describe a continuación. Además, se presentan los detalles del tratamiento farmacológico de esferoides resultantes y análisis de aguas abajo de respuestas celulares usando un ensayo bioquímico comercial.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reactivos y consumibles</td></tr><tr><td>Polietilenglicol, MW: 35.000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94646</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, MW: 500.000</td><td>Pharmacosmos</td><td>5510 0500 9007</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12306C</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Claceína AM</td><td>Life Technologies</td><td>C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Life Technologies</td><td>33342</td><td></td></tr><tr><td>Cisplatino</td><td>Spectrum Chemicals</td><td>15663-27-1</td><td></td></tr><tr><td>PrestoBlue</td><td>Life Technologies</td><td>A-13261</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-108</td><td>Sigma Aldrich</td><td>542342</td><td></td></tr><tr><td>Puntas Desechables (10 &micro; l)</td> <td>Puntas C-P10V11.ST</td><td></td><td></td></tr><tr><td>desechables Fluotics (70 y micro; l)</td><td>Fluotics</td><td>C-P70V11.ST</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 96 pocillos de fondo redondo</td><td>Nunc</td><td>268200</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Liquid Handler</td><td>Agilent Technologies</td><td>SRT Bravo</td><td></td></tr><tr><td>Lector de microplacas</td><td>Biotek Instruments</td><td>Synergy H1M</td><td></td></tr></tbody></table>

producción robótica de cancer cell esferoides con un sistema acuoso de dos fases para la prueba de la droga

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Los esferoides de células cancerosas presentan un modelo in vitro relevante de tumores avasculares para aplicaciones de prueba de fármacos contra el cáncer. En este trabajo se describe un protocolo detallado para la producción de esferoides de monocultivo y cocultivo en un formato de placa de 96 pocillos de alto rendimiento. Este enfoque utiliza un sistema acuoso de dos fases para confinar las células en una gota de la fase acuosa más densa sumergida dentro de la segunda fase acuosa. La gota descansa sobre la superficie del pozo y mantiene las células muy cerca para formar un solo esferoide. Esta tecnología se ha adaptado a un manipulador de líquidos robótico para producir esferoides de tamaño controlado y acelerar el proceso de producción de esferoides para aplicaciones de cribado de compuestos. Los esferoides tratados con un fármaco utilizado clínicamente muestran una viabilidad celular reducida con el aumento de la dosis del fármaco. El uso de una placa de micropocillos estándar para la generación de esferoides facilita el análisis de la viabilidad de las células cancerosas de los esferoides tratados con fármacos con un lector de microplacas. Esta tecnología es fácil de implementar tanto de forma robótica como con otras herramientas de manipulación de líquidos, como las pipetas manuales.

La estación de trabajo del manipulador de líquidos robótico se muestra en la Figura 1. La cabeza de pipeteado y todas las estaciones utilizadas en la impresión robótica de esferoides en la sección 4.6 se etiquetan. La imagen muestra el uso de dos estaciones diferentes de cajas de punta (un conjunto de consejos para la mezcla y el segundo conjunto para la aspiración / dispensación de mezcla de fase DEX-suspensión acuosa de células). Toda la instalación se encuentra en un armario estándar de seguridad bio...

Se presenta un protocolo para la impresión robótica de esferoides de células cancerosas en un formato de placa de 96 pocillos de alto rendimiento utilizando un sistema acuoso de dos fases.

Producción Robótica de Cancer Cell esferoides con un sistema acuoso de dos fases para la prueba de la droga

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

El objetivo general de este procedimiento es formar el pH de células cancerosas en un formato estándar de alto rendimiento para utilizarlas en pruebas de fármacos anticancerígenos. Esto se logra primero disolviendo dos polímeros, polietilenglicol y dextrano, en medio de cultivo celular a concentraciones predeterminadas para formar un sistema acuoso bifásico exitoso. El segundo paso consiste en preparar las células de interés a una densidad celular dos veces mayor que la deseada y mezclar la suspensión celular con un volumen igual de la fase acuosa de dextrano.Luego, llene una placa de 96 pocillos con la fase acuosa de polietilenglicol y dispense gotas submicrolitro de la fase de dextrano que contiene células en los pocillos utilizando un robot de manipulación líquida. El siguiente paso consiste en confirmar la formación de esferoides en las placas de 96 pocillos tras 24 horas de incubación y añadir directamente los fármacos anticancerígenos de interés a los pocillos. Finalmente, se utiliza un ensayo de viabilidad compatible con lectoras de placas estándar para mostrar el porcentaje de viabilidad de los esteroides tratados con fármacos, normalizado respecto a las esferas de control no tratadas.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el método de gota colgante o el enfoque de pocillos microfabricados es que no requiere placas o dispositivos personalizados y permite la formación de esferoides y pruebas de fármacos con alto rendimiento. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la investigación del cáncer y acelerar el descubrimiento de quimioterápicos anticancerígenos. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia del cáncer porque permite la selección de alto rendimiento de compuestos químicos utilizando modelos de tumores más relevantes para identificar nuevos fármacos anticancerígenos.Las personas nuevas en este método formarán cómodamente esteroides de células cancerosas y microplacas y realizarán fácilmente experimentos de tratamiento con fármacos utilizando equipo de laboratorio estándar y herramientas robóticas. Para comenzar, pese 0,5 gramos de polietilenglicol y añádalos a 9,5 mililitros de medio de crecimiento completo en un tubo cónico estéril de 15 mililitros. Vortexee la mezcla durante un minuto para preparar 10 mililitros de una fase acuosa de polietilenglicol al 5% peso por volumen. Luego, pese 0,128 gramos de dextrano y añádalos a 0,87.Dos mililitros de medio de crecimiento completo en un tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Vortex. Esta mezcla durante un minuto para preparar un mililitro de una fase acuosa de dextrano al 12,8% peso por volumen. Coloque tanto la solución de polietilenglicol como la de dextrano en un baño de agua a 37 grados Celsius durante una hora.Para ayudar a lograr la disolución completa. Asegúrese de que las tapas permanezcan por encima del nivel del agua para evitar posibles contaminaciones tras una hora. Retire la solución de polietilenglicol y colóquela en una jeringa estéril de plástico de cinco mililitros.Pase la solución a través de un filtro de jeringa con poro de 0,2 micrones para eliminar cualquier impureza. Almacene ambas soluciones de fases, el polietilenglicol y el dextrán, a cuatro grados Celsius durante un máximo de 24 horas antes de su uso. Cultive las células cancerosas de interés, como la línea celular de cáncer de mama M-D-A-M-B 1 57, hasta que alcancen una confluencia del 90 al 100 %.Luego, recolecte las células utilizando técnicas estándar y cuente el rendimiento en un hemocitómetro; re suspenda el precipitado a una concentración de 50 millones de células por mililitro en una mezcla de medio de crecimiento y solución de strand en partes iguales. Esto asegura una densidad de aproximadamente 15.000 células por gota de 0,3 microlitros; dispense 50 microlitros de la fase acuosa de polietilenglicol al 5% filtrada en cada pocillo de una placa de 96 pocillos no adherente que haya sido previamente codificada con onic según se describe en el protocolo de texto adjunto. La adición de polietilenglicol puede realizarse manualmente con una pipeta multicanal o de forma robótica con un manipulador de líquidos utilizando una pipeta; mezcle la suspensión celular pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo para resuspender.Suspenda cualquier célula que se haya sedimentado con el tiempo. Añada 20 microlitros de la suspensión a cada pocillo alternativo de una columna de una placa de 384 pocillos. Luego encienda el manipulador de líquidos y coloque la cabeza de pipeteo en la posición inicial.Para registrar las coordenadas, coloque la placa de origen, la placa de destino y las cajas de puntas de pipeta en posiciones definidas sobre la estación de trabajo del dispensador de líquidos. Utilizando el dispensador de líquidos automatizado, seleccione un volumen de mezcla, aproximadamente un tercio del volumen de la suspensión celular, y cargue una columna de cilindros del cabezal de pipeteo del dispensador con puntas de pipeta para mezcla procedentes de la estación de trabajo. Use el dispensador de líquidos para mezclar la suspensión celular en la placa de origen de 384 pocillos.Luego expulse las puntas en una caja vacía para puntas usadas. A continuación, cargue una columna de cilindros del cabezal de pipeteo con puntas de pipeta dispensadoras de 10 microlitros. Utilice el manipulador de líquidos para aspirar 0,3 microlitros de la suspensión celular desde la placa de origen hacia cada punta de pipeta.Luego, dispense la suspensión celular en los pocillos de una columna de la placa de destino que contiene 50 microlitros de la fase de polietilenglicol al 5%. Utilice una altura de dispensación de 0,5 milímetros y agregue la gota a un caudal de un microlitro por segundo o más lento. Repita este proceso hasta que todas las columnas de la placa de destino hayan sido cargadas con células. Una vez finalizado, retire cuidadosamente la placa de destino de la estación de trabajo e incube las células en un ambiente humedecido a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 24 horas antes de cualquier tratamiento con fármacos.Confirma visualmente la formación de esteroides en cada pocillo de la placa de 96 pocillos tras 24 horas de cultivo. Utilice diluciones seriadas para preparar un fármaco de interés, como el cisplatino, para su evaluación. Diluya la solución stock del fármaco en medio de cultivo de manera que cada dilución sea dos veces la concentración final deseada.Se pueden probar hasta cinco concentraciones diferentes por placa de 96 pocillos. Añada 50 microlitros de la solución del fármaco en la fase de polietilenglicol de cada pocillo. Utilice dos columnas de ocho pocillos por grupo de tratamiento, incluyendo un grupo control al que se añade solo medio.Incube los esteroides con el fármaco durante 48 horas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono, protegido de la luz. Después de 48 horas, prepare diluciones frescas del fármaco y renueve el fármaco añadiendo 50 microlitros adicionales de medio que contenga fármaco fresco en la concentración deseada. Incube el EHP durante otras 48 horas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono, protegido de la luz.A continuación, agregue un reactivo de viabilidad celular a cada pocillo según se describe en el protocolo de texto adjunto e incube la placa durante seis horas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono, protegida de la luz. Cuando el ensayo haya finalizado, coloque la placa en un lector de microplacas y mida la señal fluorescente a longitudes de onda de excitación y emisión de 560 y 590 nanómetros, respectivamente. El cribado de alto rendimiento de fármacos anticancerígenos requiere un método reproducible para formar cientos de esteroides de tamaño uniforme.El gráfico mostrado aquí enfatiza la reproducibilidad de este método para formar esferoides. En una placa estándar de 96 pocillos, el diámetro promedio fue de 332 micrones con una desviación estándar inferior al 10 %. Las variaciones en los diámetros de los esferoides resultaron ser típicas de una distribución normal. Cuando los esferoides fueron expuestos durante cuatro días a concentraciones variables de cisplatino, un fármaco quimioterapéutico clínico, mostraron una respuesta dependiente de la dosis frente a los tratamientos.Se encontró que la concentración del fármaco correspondiente a la dosis letal 50% era de 4,67 micromolar. El tratamiento con el fármaco a concentraciones letales desintegra las sps de células cancerosas. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en aproximadamente dos horas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar verificar rápidamente la formación de dos fases acuosas antes de proceder a experimentos de impresión de esteroides. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la criosección, la tinción inmunohistoquímica de esteroides en muestras y otros ensayos biológicos, con el fin de responder preguntas adicionales sobre los blancos moleculares de los fármacos en los esteroides de células cancerosas.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo formar cultivos de células cancerosas en 3D de manera conveniente y realizar pruebas de fármacos de forma de alto rendimiento utilizando placas y dispositivos estándar.

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Bioingeniería

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Aquí, describimos un protocolo rápido y flexible para la formación de esferoides celulares 3D a través de la agregación celular. Se adapta fácilmente a múltiples tipos de células y es adecuado para su uso en una variedad de aplicaciones, incluidos los ensayos de migración celular, invasión o anoikis, y para obtener imágenes y cuantificar las interacciones célula-matriz.

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Producción Robótica de Cancer Cell esferoides con un sistema acuoso de dos fases para la prueba de la droga

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