Name: Escalable 96 pocillos Placa base IPSC Cultura y Producción Usando un sistema de manipulación robótica Líquido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Aprende a cultivar células madre pluripotentes humanas de forma escalable usando un robot de manipulación líquida en placas de 96 pocillos. Este método automatizado mantiene la pluripotencia y permite la diferenciación en cardiomiocitos.

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Este trabajo ha sido financiado en parte por subvenciones del NIH, R44 GM087784 y R01 HL109505. Autores gracias al equipo técnico y OEM en Gilson, INC para el soporte técnico ampliado.

Los autores MKC, MJG, EEB, NJD y RO son o fueron en el momento de empleados de desarrollo de InvivoSciences, INC que concibieron y desarrollaron los protocolos robóticos que se describen aquí. TW es el PEP para InvivoSciences INC. SH es un empleado de Gilson INC.

En el presente estudio se desarrolló un método de cultivo para la producción robotizada IPSC que miniaturiza y automatiza la alimentación y el pasaje en un formato de placa de 96 pocillos a la vez que permite eficiente escala hacia arriba. Un robot de manejo de líquidos se usó para alimentar rutinariamente colonias IPSC y el paso a intervalos regulares por disociación enzimática. El robot también se programó para producir placas recubiertas de gel de matriz extracelular y llevar a cabo un gradiente de densidad de siembra. Cuando fibroblastos y células iPS derivadas de tejido adiposo se cultivaron en este sistema durante más de 20 pasajes, unos 3 meses, se mantuvo la pluripotencia, como lo fueron cariotipos estables. Ambas líneas celulares fueron capaces de diferenciación en cardiomiocitos. En conjunto, la colección de protocolos descritos aquí permite a los usuarios con muy poca experiencia en cultivo de células madre, o acceso limitado a la cultura equipo especializado, a las células madre de la cultura y lograr la producción de células de alta o manejar con mano de obra y el costo mínimo de varias líneas. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Los protocolos robóticos se detallan aquí proporcionan un método para la escala económica de producción y manejo de IPSC. Una de las ventajas es la cultura de células madre escalable en un formato basado en la placa establecida demostrado aquí y previamente 44,47 - 49 para mantener la pluripotencia. Mientras que otros formatos de células pluripotentes escalable rendimiento cultivo de células madre 20,23,29 método basado esta placa requiere esencialmente ningún cambio en el formato de la cultura, como la adaptación a la suspensión, el uso de antiespumantes químicos o el uso prolongado de Rho-kinasa inhibidor 20. Este método de la placa basada puede, por tanto, rápidamente, y como era previsible, acomodar nuevas líneas porque las condiciones de cultivo son similares. Como el uso de CMPI para el modelado de la enfermedad aumenta 4,6,19,50, nuevas líneas de IPSC se generan continuamente. Las técnicas descritas aquí son los más adecuados a la cultura nueva líneas en medio a alto volumen y el rendimiento debido a la barrera de la transición hacia el formato es lujo. Esto también es cierto para la mano de obra y equipo necesario para mantener las colonias. Finalmente, debido a que el formato y la manipulación son similares para el medio ambiente utilizado para deducir y validar las líneas de IPSC, el rendimiento cultura, tales como diferenciación dirigida, es probable que sea más predecible. La Figura 8 ilustra una estrategia para la escala de producción de células madre en placas de 96 pocillos. Una placa (ciclo 0) se utiliza para sembrar robóticamente 12 nuevas placas, un aumento de 12 veces (Ciclo 0 a 1). Después de varios días de alimentación, uno de los doce placas es pasado para sembrar otro conjunto de doce placas (Ciclo 1 Ciclo 2 a). Las placas once restantes están ahora disponibles para otros usos y representan la componente de producción del sistema. A este ritmo, el paso de una placa proporcionará 11 placas cada ciclo, o cada 3-4 días. Esta metodología se puede escalar más cuando múltiples placas se pasan como se muestra en la transición del Ciclo 2 Ciclo a 3. En el Ciclo 3, dos placas sonsiempre se utiliza para mantener la colonia y sembrar 24 nuevas placas. Las 22 placas restantes estarán disponibles para su uso después de cada ciclo de pasaje. En cualquier punto en el ciclo de mantenimiento el usuario puede sembrar más placas para aumentar la producción. Un ejemplo sería la de pasaje cada columna para dos ciclos de crecimiento. El primer pasaje convierte una placa en doce placas, y cada uno de los doce placas se utiliza para sembrar 144 placas. En este caso, un usuario comienza con una placa y después de dos pasajes, o alrededor de 1,5-2 semanas de cultivo, tiene 144 placas. Por ejemplo, los fibroblastos y adiposo IPSC líneas de fluencia de aproximadamente 25-75 million células por placa de 96 pocillos cuando esté listo para pasaje. Por lo tanto, 144 placas podrían representar cerca de 4-7 x 10 9 células. ¿Cuál es la carga de trabajo para la realización de 144 placas de 96 pocillos robot? Uno de los objetivos de este trabajo fue la producción de células madre escalable que reduce la mano de obra en comparación con (placa es decir, de 6 pocillos) tradicional de cultivo de células madre. El robot accomplishes esta aliviando la necesidad de manejar físicamente cada placa durante la alimentación y pases. Mientras que las escalas de producción de placas de 96 pocillos linealmente como sería en placas de 6 pocillos tradicionales, el tiempo de un técnico pasa a trabajar con las placas es significativamente menor uso de la cultura robótica. La eficiencia de la producción de la cultura robótico se deriva de esta diferencia (Figura 9). Se encontró técnicos podrían eliminar una placa de 6 pocillos de la incubadora, comprobarlo en el microscopio, y luego aspirar y alimentar la placa en aproximadamente 3,5 minutos. En comparación, los técnicos pasan aproximadamente 30 sec la eliminación de una placa de 96 pocillos de la incubadora y la inspección en el microscopio para la densidad y la contaminación antes de colocarlo en el robot. Con un protocolo de alimentación ampliado similar a la descrita anteriormente, seis placas de 96 pocillos se pueden cargar y alimentado, que dura aproximadamente 21 min, o 3,5 min por placa. El tiempo total transcurrido para alimentar una placa es comparable entre el robotSe requiere ic y métodos manuales, pero a alimentar a mano 6 placas de un técnico para los 21 minutos, mientras que el técnico gasta sólo 3 min manejo de las seis placas para el robot (una inspección de 30 segundos por placa). Como figura 9 muestra, el tiempo de un técnico pasa el manejo de 144 placas utilizando el robot es alrededor de 1,2 horas en comparación con 8 horas de forma manual y el robot nunca cometer un error de manipulación de las placas o la transferencia de líquidos. Los 96 pozos métodos de cultivo IPSC descritos aquí proporcionan una plataforma manejable para las tareas de detección de complejos. Debido a que cada pozo es genéticamente idéntica y sin semillas a la misma densidad de la misma agrupación inicial, las variables pueden ser distribuidos a través de la placa y mantenidos por el robot con depósitos disponibles en el mercado para segregar condiciones. Esto sería útil para los experimentos tales como el crecimiento de células madre desarrollo de los medios 34,35,47, pruebas de sustrato o condición de cultivo y los estudios de toxicidad que utilizan células madre51. Dado que cada línea de células madre es único en términos de requisitos óptimos tamaño de las colonias y de paso, se puede utilizar este sistema para modular la densidad de siembra, la frecuencia de la alimentación y el manejo paso por la manipulación de las columnas cosechados, la agitación mecánica durante el paso y la frecuencia de alimentación. Iteración a través de estas variables permitirá al usuario encontrar rápidamente un conjunto de condiciones adecuadas para el cultivo de una nueva línea o desarrollar nuevas técnicas de cultivo. El sistema robótico también es capaz de mantener 96 colonias de células madre paralelas pero independientes. Cuando IPSC se derivan de células somáticas o clonado después de la manipulación genética, muchos clones paralelas son examinados para producir potenciales líneas de IPSC. Una vez que las células individuales se siembran en placas de 96 pocillos, este sistema puede alimentar y de paso de las placas de 96 pocillos de mantenimiento de cada colonia separado. Esto permite un rendimiento muy alto cuando la selección de clones potenciales y elimina la dificultad en el cultivo físicamente 96 líneas paralelas. Este método también unallows ampliarse producción de cada clon para que el material está fácilmente disponible para el análisis paralelo. Finalmente, prevemos la integración de estas técnicas de cultivo con un sistema de tráfico de placa robótico que entrega a placas de la incubadora y permitiendo cultura totalmente automatizado. Esto podría lograrse con la robótica más complejos que permiten una mayor expansión desde los protocolos básicos descritos aquí son transferibles a otros sistemas basados ​​en placa. Los primeros pasos críticos para abordar en los protocolos son los que previenen y comprobar la contaminación como los pasos 1.5 y 4.2. La contaminación, como se discutió anteriormente, se puede evitar con éxito si se utilizan buena técnica estéril y el sentido común. Es imprescindible, independientemente del formato cultivo de células madre, que el cheque del operador de contaminación y haciendo lo que en este protocolo en los pasos indicados reducirá significativamente el riesgo de contaminación. La aplicación del gel matriz extracelular adecuada es una segunda esspaso cial para el éxito general de este protocolo. Sin recubrir adecuadamente las placas de 96 pocillos, las células madre no crecerán. Un tema común es el recubrimiento bien incompleta. La experiencia ha demostrado que las burbujas de aire, la atracción electrostática y la acción capilar dificultar el revestimiento bien completa. La etapa de pre-humectación (1.6) fue desarrollado para mejorar significativamente recubrimiento pocillos de fondo y no debe ser omitido. Este paso pre-humectación parece reducir la aparente hidrofobicidad de la placa de 96 pocillos de plástico de tal manera que cuando se aplica el recubrimiento de gel de la matriz extracelular se distribuye uniformemente a través de la parte inferior y lados bien. También se recomienda para golpear suavemente las placas de 96 pocillos contra una mano limpia una vez recubierto para asegurar la distribución solución de gel de matriz extracelular, incluso. Los parámetros de disociación también son importantes para optimizar. Incubación extendida con la enzima o reactivo de disociación basada EDTA resultará en células individuales que pueden o no ser el objetivo durante el paso. Por lo tanto, el operadordebe prestar especial atención a cómo el tiempo de disociación, la fuerza de trituración, y las repeticiones de lavado afectan a la morfología de la colonia y la salud y ajustar en consecuencia. La comprensión de las limitaciones de las técnicas descritas aquí son de suma importancia para la operación exitosa. Como en cualquier otro entorno de cultivo celular, el uso de placas de 96 pocillos presenta un riesgo relativamente alto de contaminación. Como se describió anteriormente, un técnico es el manejo de cada placa durante la alimentación y pases; por ejemplo, al abrir la tapa, poner la placa en la cama robot, y la comprobación de la placa en el microscopio. Por lo tanto, como se señaló después del paso 1.5, es imperativo no tocar el interior de cualquier plato o tapa exponer esta parte a cualquier superficie potencialmente contaminada, como los bloques de calentamiento inclinadas o clavijas verticales en la cama. Durante el desarrollo del protocolo de esta limitación fue descubierto y fue el impulso para desarrollar un estante para mantener las tapas de la placa para mantener la esterilidad. Del mismo modo, los embalses mínimas, puntas de pipeta y other suministros en la cama manejo robot líquido son fuentes potenciales de contaminación, ya que están abiertos al medio ambiente y manejado por el técnico. Por lo tanto, una buena técnica estéril se debe aplicar como la reducción de los movimientos de los materiales expuestos cultura o líquidos abiertos. Otra limitación es que cuando el protocolo se escala hacia arriba, comprobando visualmente cada pocillo de&gt; 100 placas de 96 pocillos es engorroso. Esto puede ser tratado por inspección visual de toda la placa en busca de signos de contaminación, tales como medios turbios, para identificar pozos sospechosas. Para futuro escala hacia arriba, se incorporará el uso de un microscopio automatizado y el indicador del crecimiento celular y la contaminación potencial. En resumen, el 96 pocillos plataforma basada alto rendimiento descrito aquí ofrece un método reproducible, de alta fidelidad para cultivo de células madre y la producción en un formato de placa. Este método reduce la experiencia necesaria, el equipo de tiempo necesario y el trabajo dedicado a frenar el cultivo de células, mientras queel mantenimiento de los beneficios de la cultura tradicional adherente.

El uso de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSCs) ha aumentado significativamente desde su derivación en 2007 1 para el ensayo en recintos, la medicina regenerativa y la modelización de la enfermedad 2-6. Esta demanda viene de la capacidad de IPSC para producir grandes cantidades de células pluripotentes que pueden diferenciarse en células somáticas en una cantidad sin precedentes. Como técnicas de diferenciación dirigida mejoran 7 - 10 de y el desarrollo de célula humana o modelado de tejidos y terapia celular aumenta 11 - 14, también lo hace el requisito para la producción en masa de CMPI de alta calidad. Es ampliamente citado que, entre otras enfermedades, infarto de miocardio o la sustitución funcional de las células b requerirán cientos de millones a miles de millones de IPSC derivado células somáticas 15-18. Por otra parte, cada vez más complejos de modelado tejido 3D para el descubrimiento de fármacos y therapy exigirá un gran número de células 9,13,19. En todos estos ejemplos, definidos, uniformes y reproducibles iPSCs deben estar disponibles y sencillo de producir. Con el fin de producir vástago Biofarmacéutica celulares derivadas de células y para la ingeniería de tejidos y el trasplante, una tecnología celular fabricación rentable es esencial. La producción en escala de CMPI se ha centrado en cultivo en suspensión 20 - 25 o suspensión con el uso de sustratos microportadores 26-28 en parte debido a que estas técnicas se implementan con éxito para gran escala, no IPSC, la producción basada eucariota. Varios grupos han demostrado los sistemas de cultivo en suspensión que producen las células madre pluripotentes 20,21,23,24,29. Sin embargo, estos enfoques utilizan sistemas caros y complejos no están fácilmente disponibles para los investigadores que desarrollan programas de diferenciación nuevos, conduciendo la ingeniería de tejidos y haciendo laboratinvestigaciones a escala de ORY. Por otra parte, las culturas IPSC suspensión y microportadoras requieren adaptación y técnicas o productos químicos que no se encuentran en la cultura tradicional adherente IPSC como el uso continuo de inhibidor de Rho-quinasa, agentes antiespumantes y filtración para regular la agregación. El estrés físico a las células es más frecuente en cultivo en suspensión, introducida por agitación mecánica, así como durante la colisión microsoporte. Estos problemas limitan la previsibilidad y la velocidad a la que se acaba de generar líneas de células madre pueden cultivarse en suspensión. Otros han desarrollado sistemas de manipulación de placas robóticos que imitan las técnicas de cultivo en placa de 30,31 pero estas plataformas exigir inversiones significativas para el equipo y experiencia para operar en Además de los retos fundamentales asociados con cultivo de células madre. El siguiente trabajo describe el desarrollo y la práctica de un sistema de cultivo IPSC escalable que utiliza un líquido robótico de 8 canales estándar autónomocontrolador y placas de 96 pocillos. Este método fue diseñado para salvar la cultura IPSC escala de laboratorio y de alto volumen de producción IPSC (por ejemplo, 10 7-1,5 x 10 9 células por semana por técnico) que permitan a los que desarrollan nuevas tecnologías IPSC escalar fácilmente hasta la producción sin grandes inversiones en hardware o laborales. Este método es relativamente barato de instalar, requiere poca o ninguna experiencia cultivo de células madre, programación o ingeniería, tiene una pequeña huella de equipo sin la necesidad de una campana de cultivo celular dedicado, y utiliza el equipo de cultivo celular estándar para permitir a mediano y alto rendimiento automatizado la producción de células. El objetivo era desarrollar un sistema capaz de cultivo de células madre escalable que puede ser utilizado por los laboratorios nuevos para frenar el cultivo de células, los que se encuentran el cultivo manual de una barrera para el desarrollo de sus ideas o aquellos que quieran un medio económico para producir un gran número de células madre. La plataforma presenta aquí elimina la influencia técnico enmadre de cultivo de células y normaliza los procedimientos de alimentación y de paso para permitir la producción de células madre consistente.

<table><tbody><tr><td>placas de 96 pocillos</td><td>Corning</td><td>3596</td><td>de 96 pocillos; Volumen del pozo: 360&nbsp; &#956; l; Área de crecimiento celular: 0.32&nbsp; cm2; Comedero</td></tr> de <tr><td>caballito de mar</td> envuelto <td>individualmente SeahorseBio</td><td>201308-100</td><td>Depósito 4 Parte Transparente Poly Proplene 73Ml 25/Cs</td></tr><tr><td>Puntas</td><td>Gilson Gilson</td><td>F167023</td><td>10 bastidores Gilson 96 puntas D200 puntas</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12500062</td><td>DMEM/F12 polvo. Resuspender en 1 L de agua purificada de grado de cultivo celular y filtro estéril.</td></tr><tr><td>Factor de crecimiento reducido Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Referido como "gel de matriz extracelular" en el texto. Matrigel GFR, 10&nbsp; ml</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell Technologies</td><td>5857</td><td>mTeSR1 Kit completo para el mantenimiento de hES.</td></tr><tr><td>E8 Media</td><td>StemCell Technologies</td><td>5940</td><td>TeSR-E8 Kit para el mantenimiento de hESC / hiPSC</td></tr><tr><td>Y27632</td><td>AdooQ BioScience</td><td>A11001-50</td><td>Rock inhinitor Y-27632 2HCI</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Tecnologías celulares innovadoras</td><td>ACCUTASE</td><td>Referido como "reactivo de disociación proteolítico y colagenolítico" en el texto. Accutase 500&nbsp; ml de solución celular estéril</td></tr><tr><td>PBS Fisher</td><td>SH30256FS</td><td></td><td>PBS sin Ca Mg 500&nbsp; ml, 6/pk</td></tr><tr><td>Gilson PIPETMAX</td><td>Gilson</td><td>PIPETMAX</td><td>http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk</td></tr></tbody></table>

escalable 96 pocillos placa base ipsc cultura y producción usando un sistema de manipulación robótica líquido

Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System

El avance continuado en el cultivo de células madre pluripotentes se está cerrando la brecha entre la banca y de noche para el uso de estas células en la medicina regenerativa, el descubrimiento de fármacos y pruebas de seguridad. Con el fin de producir vástago Biofarmacéutica celulares derivadas de células y para la ingeniería de tejidos y el trasplante, una tecnología celular fabricación rentable es esencial. Mantenimiento de la pluripotencia y un rendimiento estable de células en aplicaciones posteriores (por ejemplo, la diferenciación celular) con el tiempo es de suma importancia para la producción de células a gran escala. Sin embargo, eso puede ser difícil de conseguir, especialmente si las células se cultivan de forma manual en el que el operador puede introducir variabilidad significativa, así como ser prohibitivo para escalar en marcha. Para habilitar de alto rendimiento, en gran escala la producción de células madre y quitar protocolos de cultivo de células madre novela influencia operador utilizando un sobremesa multicanal robot de manejo de líquido fueron desarrollados que requieren la participación de técnicos mínimos o experiencia. Conestas células madre pluripotentes inducidas protocolos humanos (iPSCs) se cultivaron en condiciones libres de alimentador directamente de una acción congelada y se mantuvieron en placas de 96 pocillos. Dependiendo de la línea celular y la tasa de escalado deseado, el operador puede determinar fácilmente cuando a paso basado en una serie de imágenes que muestran las densidades de colonias óptimas para la división. A continuación, los reactivos necesarios están preparados para llevar a cabo una división colonia a nuevas placas sin una etapa de centrifugación. Después de 20 pasajes (~ 3 meses), dos líneas de IPSC mantienen estables cariotipos, expresan marcadores de células madre, y diferenciarse en cardiomiocitos con alta eficiencia. El sistema puede realizar cribado de alto rendimiento subsiguiente de nuevos protocolos de diferenciación o la manipulación genética diseñados para placas de 96 pocillos. Esta tecnología reducirá la carga de trabajo y técnica para producir grandes cantidades de células madre idénticas para una miríada de aplicaciones.

Los protocolos descritos permiten a los laboratorios realizar cultivos de células madre adherentes y escalables con un rendimiento mínimo con un costo mínimo de inversión en mano de obra, experiencia y equipo utilizando un robot de manejo de líquidos programable y placas de 96 pocillos. Las iPSCs transitadas más de 20 veces en este sistema mantuvieron la pluripotencia, los cariotipos normales y se diferenciaron en cardiomiocitos.

Escalable 96 pocillos Placa base IPSC Cultura y Producción Usando un sistema de manipulación robótica Líquido

Continued advancement in pluripotent stem cell culture is closing the gap between bench and bedside for using these cells in regenerative medicine, drug ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en establecer de forma reproducible un cultivo de células pluripotentes escalable. Esto se logra primero utilizando un robot programado de manipulación de líquidos para sembrar células madre pluripotentes humanas a distintas densidades. En una placa de 96 pocillos, en una segunda etapa, se identifican visualmente los pocillos con densidades óptimas de colonias para su envasado.Las células madre pluripotentes inducidas se siembran luego en nuevas placas para alimentación automática y empaquetado adicional. En última instancia, este procedimiento permite la selección de las mejores densidades de siembra para multiplicar células madre pluripotentes inducidas humanas con miras a su posterior diferenciación en cardiomiocitos. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el desarrollo de terapias personalizadas y regenerativas a escala media.El robot de cultivo potente de URI es adecuado para producir varios cientos de millones de células madre potentes de URI en varios días, las cuales luego pueden diferenciarse en diversos tipos celulares para pruebas personalizadas de fármacos o terapias de implante celular y tisular. Aunque este método se ha aplicado al tamizado de densidades de siembra para la expansión óptima del cultivo de células pluripotentes, también puede utilizarse para optimizar e identificar protocolos novedosos de diferenciación para otros tipos celulares. El procedimiento será demostrado por científicos farmacéuticos, Neil Daily de mi laboratorio. Antes de iniciar el procedimiento de alimentación, revise la placa de 96 pocillos con colonias de células madre para descartar contaminación y confirme que la colonia celular se encuentre por debajo de la densidad de paso ideal.Si las células se encuentran en buenas condiciones, coloque la placa en la cama. Coloque tres en la rampa inclinada de 37 grados Celsius del robot de manipulación de líquidos y cargue el soporte de puntas en la cama. Coloque uno con puntas de pipeta de 200 microlitros a temperatura ambiente.Coloque un canalón de cuatro pocillos en la posición dos del lecho y llene el pocillo tres del canalón con ocho mililitros de medio de crecimiento de células madre fresco a temperatura ambiente, sin inhibidor de quinasa RO. A continuación, transfiera la placa a la rejilla portaplacas y, mediante la pantalla táctil de control robótico, seleccione secuencialmente Ejecutar el protocolo alimentación de colonias una placa y luego siguiente; después, presione prueba de ejecución para usar el asistente paso a paso y preprobar el programa seleccionado. Una vez aprobado el protocolo, seleccione ejecutar protocolo. Tras la alimentación, recupere la placa de 96 pocillos con colonias de células madre.Luego registre los detalles del evento de alimentación en la tapa de la placa y devuélvala al incubador de cultivo celular durante 24 horas hasta la próxima alimentación o pase. La elección del pocillo para dividir depende de la densidad de las colonias. Varios días después de establecer un gradiente de densidad de siembra en esta placa, observamos un pocillo demasiado denso para dividir, una densidad ideal para dividir y un pocillo demasiado escaso para realizar el pase tras varios ciclos de alimentación.Confirme que el espacio entre la mayoría de las colonias en la placa de 96 pocillos sea el 25% del diámetro de la colonia adyacente, ya que de lo contrario un posterior abasto provocaría que las colonias crecieran fusionadas entre sí. Luego, si la colonia no está contaminada, coloque la placa en la cama. Coloque la posición tres en la rampa de 37 grados y cargue la repisa de puntas en la cama.Coloque un extremo con puntas de pipeta de 200 microlitros a temperatura ambiente. Coloque una placa de cuatro pocillos en la posición dos del lecho, y dejando el pocillo cuatro vacío, dispense 8,5 mililitros de medio de crecimiento de células madre suplementado con el inhibidor de la quinasa Rho Y 27632 en el pocillo tres, 3,5 mililitros de reactivo de disociación proteolítico y colagenolítico al 30 % en el pocillo dos y 4,5 mililitros de PBS en el pocillo uno.A continuación, coloque una nueva placa de 96 pocillos recubierta con gel de matriz extracelular precalentada a 37 grados Celsius en el lugar uno, posición cinco, y transfiera las tapas de la placa antigua y de la nueva placa al soporte para tapas. Ahora, utilice el panel táctil de control robótico para seleccionar secuencialmente ejecutar un protocolo: división de colonias uno a doce, columna uno, seguido de siguiente. Luego, seleccione prueba de ejecución para utilizar el asistente paso a paso con el fin de preprobar un programa seleccionado, seguido de ejecutar protocolo.Una vez finalizado el protocolo de paso, recupere ambas placas. Etiquete la placa nueva con la información relevante y devuelva las placas al incubador. Durante 24 horas, las células y colonias deben adherirse a la placa dentro de las dos o tres horas posteriores a la siembra, presentándose muy dispersas debido a la presencia del inhibidor de la quinasa RO.Después de la primera alimentación sin inhibidor de la quinasa RO, las células se condensarán y exhibirán la morfología característica de células madre en forma de adoquín. Las anomalías cromosómicas se observan comúnmente durante el cultivo de células madre, pero podrían no afectar la distribución de los marcadores de pluripotencia como los mostrados en estas imágenes; de hecho, el análisis de cariotipo de células cultivadas mediante el protocolo recién demostrado reveló que ambas líneas de células madre pluripotentes inducibles pasadas robóticamente tenían 46 cromosomas normales, lo que sugiere que el método de cultivo robótico no introdujo inestabilidad cromosómica más allá de lo que normalmente podría ocurrir. Para analizar los marcadores establecidos de expresión génica en líneas de células madre pluripotentes inducibles cultivadas robóticamente, también se recolectó el ARN total.Ambas líneas de células madre pluripotentes inducibles en este experimento mostraron una expresión similar de marcadores de pluripotencia, mientras que los cardiomiocitos diferenciados a partir de cada línea no los mostraron, ni tampoco una línea independiente de fibroblastos dérmicos humanos. Además, cuando ambas líneas de células madre pluripotentes inducibles se diferenciaron en cardiomiocitos, exhibieron una clara formación de sarcómeros. En conjunto, estos datos sugieren que tres meses y más de 20 pasajes de cultivo robótico dieron como resultado células cromosómicamente normales que exhiben un programa de transcripción consistente con la pluripotencia y que también fueron capaces de diferenciarse en cardiomiocitos.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar este robot de manipulación de líquidos o uno similar para cultivar células pluripotentes de manera escalable.

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