Escalable 96 pocillos Placa base IPSC Cultura y Producción Usando un sistema de manipulación robótica Líquido

El objetivo general del siguiente experimento es establecer de forma reproducible un cultivo celular pluripotente escalable. Esto se logra utilizando primero un robot de manejo de líquidos preprogramado para sembrar células madre pluripotentes humanas a diferentes densidades. En una placa de 96 pocillos en el segundo paso, los pocillos con densidades óptimas de colonias se identifican visualmente para el empaquetado.

A continuación, las células madre pluripotentes humanas inducidas se siembran en nuevas placas para su alimentación automática y posterior envasado. En última instancia, este procedimiento permite la selección de las mejores densidades de siembra para la multiplicación de células madre pluripotentes inducidas humanas para su eventual diferenciación en cardiomiocitos. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el desarrollo de terapias personalizadas y regenerativas a mediana escala.

El potente robot de cultivo URI es adecuado para producir unos pocos cientos de millones de células madre potentes URI en varios días, que luego se pueden diferenciar en varias células para pruebas de medicamentos personalizadas o terapia de implante de células y tejidos. Aunque este método se ha aplicado al cribado de densidades de siembra para una expansión óptima del cultivo de células pluripotentes, también se puede utilizar para optimizar e identificar nuevos protocolos de diferenciación para otros tipos de células. Los científicos farmacéuticos, Neil Daily de mi laboratorio, demostrarán el procedimiento Antes de comenzar el procedimiento de alimentación, verifique la placa de colonia de células madre de 96 hinchamientos para ver si está contaminada y para confirmar que la colonia celular está por debajo de la densidad de paso ideal.

Si las celdas están en buenas condiciones, coloque la placa en la cama. Colóquese tres en la rampa inclinada de 37 grados centígrados del robot de manejo de líquidos y cargue el estante de puntas en la cama. Coloque uno con puntas de pipeta de 200 microlitros a temperatura ambiente.

Coloque un comedero de cuatro pocillos en la posición dos de la cama y llene el pozo tres del comedero con ocho mililitros de medio de crecimiento de células madre a temperatura ambiente fresca sin inhibidor de la quinasa RO. A continuación, transfiera la plaqueta a la rejilla de retención de plaquetas y, utilizando el panel táctil de control robótico, seleccione secuencialmente Ejecutar la alimentación de colonias de protocolo, una placa y, a continuación, pulse probar ejecutar para utilizar el asistente paso a paso para realizar una prueba previa del programa seleccionado. Cuando se apruebe el protocolo, seleccione ejecutar el protocolo Después de la alimentación, recupere la placa de colonia de células madre de 96 pocillos.

A continuación, registre los detalles del evento de alimentación en la cubierta de la placa y devuélvala a la incubadora de cultivo celular durante 24 horas hasta la próxima alimentación o paso. La elección del pozo a dividir depende de la densidad de la colonia. Varios días después de que se estableció un gradiente de densidad de siembra en esta placa, vemos un pozo que es demasiado denso para dividir, una densidad ideal para dividir y un pozo demasiado escaso para pasar después de varios ciclos de alimentación.

Confirme que el espacio entre la mayoría de las colonias en la placa de 96 pocillos es el 25% del diámetro de la colonia adyacente, o una alimentación posterior resultaría en que las colonias crezcan entre sí. Luego, si la colonia no está contaminada, coloque la placa en la cama. Coloque tres en la rampa de 37 grados y cargue el estante de propinas en la cama.

Coloque uno con puntas de pipeta de 200 microlitros a temperatura ambiente. Coloque un comedero de cuatro pocillos en la posición dos de la cama, luego deje el comedero de cuatro pocillos vacío, dispense 8,5 mililitros de crecimiento de células madre. Medio suplementado con el inhibidor de quinasa Y 2 7 6 3 2 en tres pocillos, 3,5 mililitros de reactivo de disociación proteolítica y lítica de colágeno al 30% en el pocillo dos y 4,5 mililitros de PBS en el pocillo.

Un siguiente lugar, una nueva placa de 96 pocillos precalentada de 37 grados Celsius recubierta de gel de matriz extracelular en la cama, coloque cinco y transfiera las tapas de placas viejas y nuevas al estante del soporte de la tapa de la placa. Ahora use el panel táctil de control robótico para seleccionar secuencialmente ejecutar una colonia de protocolo dividida uno a 12 columnas uno, seguido de siguiente. A continuación, seleccione Ejecución de prueba para utilizar el asistente paso a paso para realizar una prueba previa de un programa seleccionado seguido del protocolo de ejecución.

Una vez finalizado el protocolo de paso, recupere ambas placas. Etiquete la nueva placa con la información relevante y devuelva las placas a la incubadora. Durante 24 horas, las células y colonias deben adherirse a la placa dentro de las dos o tres horas posteriores a la división, apareciendo muy dispersas debido a la presencia del inhibidor de la quinasa RO.

Después de la primera alimentación libre del inhibidor de la quinasa RO, las células se condensarán y exhibirán la morfología característica de las células madre de adoquín. Las anomalías cromosómicas se observan comúnmente durante el cultivo de células madre, pero es posible que no afecten la distribución de marcadores de pluripotencia como los que se muestran en estas imágenes. Para sondear los marcadores de expresión génica de células madre establecidos en líneas de células madre pluripotentes inducibles cultivadas robóticamente, también se recolectó el ARN total.

Ambas líneas de células madre pluripotentes inducibles en este experimento exhibieron una expresión similar de marcadores de pluripotencia, mientras que los cardiomiocitos diferenciados de cada línea no lo hicieron, ni tampoco lo hizo una línea separada de fibroblastos dérmicos humanos. Además, cuando ambas líneas de células madre pluripotentes inducibles se diferenciaron en cardiomiocitos, exhibieron una clara formación de sarcómeros. En conjunto, estos datos sugieren que tres meses y más de 20 pasos de cultivo robótico dieron como resultado células cromosómicamente normales que exhibían un programa de transcripción consistente con la pluripotencia y que también eran capaces de diferenciarse en cardiomiocitos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar este robot de manejo de líquidos u otro similar para cultivar células pluripotentes de manera escalable.