El uso del Sistema de Teton para estudiar los mecanismos moleculares de la regeneración de pez cebra

El objetivo general de este procedimiento es establecer un sistema TED funcional en pez cebra para lograr una expresión génica específica de tejido y condicional, como se demuestra en esta video con la aleta caudal en regeneración. Esto se logra primero generando líneas transgénicas de activador Tet que expresan un activador transcripcional inducible por tetraciclina marcado con am cyan en el tejido de interés, y líneas transgénicas de respuesta Tet que contienen un gen de interés con etiqueta ype bajo el control de elementos responsivos a Tet. A continuación, se establecen combinaciones específicas de peces doble transgénicos Tet activador y Tet respuesta.

Luego, se induce la expresión del transgén regulado por Tet específica para el tejido mediante la administración de doxiciclina. Finalmente, se verifica la expresión del transgén regulado por Tet mediante la preparación de secciones de tejido de los rebrotes de aleta. En última instancia, se utiliza inmunofluorescencia para visualizar la expresión del transgén regulado por Tet específica para el tejido.

La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos, como la expresión génica inducida por choque térmico, es que el sistema deed on permite una expresión génica inducible y reversible de manera específica para cada tejido. Este método puede ayudar a obtener una comprensión más profunda de las redes de señalización molecular que guían la regeneración de la aleta de pez S, ya que permite el análisis de la vía de señalización y la función génica en tejidos individuales. Aunque utilizamos esta tecnología para estudiar la regeneración de aletas en pez cebra, también puede ser fundamental en muchos otros contextos que requieran la manipulación específica de la función génica en tejidos.

Después de generar líneas de peces respondedores a Tet según el protocolo descrito, evalúe la integración en la línea germinal y la inducibilidad del transgén mediante el cruce de peces individuales de la generación cero con una línea previamente establecida de activador Tet. Luego, recolecte embriones y críelos hasta una etapa en la que se pueda evaluar la inducción del respondedor Tet. Prepare una solución stock de doxiciclina 2000 x utilizando etanol al 50 % para disolver dox para obtener una concentración de 50 miligramos por mililitro.

Almacene alícuotas de docks protegidas de la luz a menos veinte grados Celsius. A continuación, prepare el medio para embrión E tres que contenga docks a una concentración final de 25 microgramos por mililitro. Luego, deseche la mayor parte del medio E tres de los embriones.

Sustitúyalo por dos conteniendo medio E3 y devuelva los embriones a 28,5 grados Celsius durante un mínimo de seis horas. Tras la incubación, utilice un microscopio estereoscópico fluorescente para seleccionar embriones con fluorescencia Y pet. Establezca varias líneas transgénicas estables de respuesta Tet a partir de los fundadores recién identificados.

Seleccione líneas que induzcan fuertemente y muestren poca mosaicidad dentro del dominio de expresión esperado, así como poca variación entre embriones individuales. Una vez establecidas las líneas de peces con el activador Tet y el respondedor Tet, cruce portadores del activador Tet con portadores del respondedor Tet para generar transgénicos dobles. Seleccione embriones que porten el transgén del activador Tet mediante la detección de fluorescencia cian am en un microscopio estereoscópico, y críe los embriones positivos para cian am hasta la edad adulta.

Identifique peces adultos doble transgénicos que porten el sistema Tet responder además del activador Tet mediante genotipificación basada en PCR o por su capacidad para inducir la expresión del Tet Responder en el tejido de interés para realizar la amputación de la aleta caudal. Anestesie el pez cebra adulto en un vaso de precipitados lleno con agua para peces que contenga 160 microgramos por mililitro de trica. Cuando el pez deje de moverse, utilice pinzas para transferirlo cuidadosamente sobre una placa de Petri invertida y use un escalpelo para realizar una amputación parcial de la aleta caudal para tratar con docs. Prepare cajas de apareamiento con un litro de agua del sistema para peces que contenga 25 microgramos por mililitro de doxiciclina.

Como control negativo, agregue 250 microlitros de etanol en lugar de doxiciclina a cajas de reproducción con un litro de agua del sistema para peces, transfiera hasta 10 peces doble transgénicos a cada caja de reproducción y coloque las cajas en la oscuridad para reducir el estrés. Después de un mínimo de seis horas, anestesie y transfiera los peces tratados a una placa recubierta con papel de filtro húmedo y use pinzas para separar la aleta caudal. A continuación, bajo un microscopio de fluorescencia, examine los peces en busca de la aparición de Y PET en el tejido en regeneración.

Posteriormente, los peces pueden utilizarse para tratamientos adicionales o devolverse al sistema de alojamiento de peces para finalizar la inducción del transgén respondiente tras la amputación parcial de la aleta y el tratamiento con docs. Vuelva a amputar los rebrotos de aleta aproximadamente cuatro a cinco segmentos óseos proximales al plano de amputación inicial y en un punto temporal que dependerá de su configuración experimental, como se describió previamente en este video. Con pinzas, y manipulando únicamente la parte del muñón del tejido, coloque cuidadosamente los rebrotos de tejido en posición plana sobre una pequeña placa de Petri que contenga un 4% peso por volumen de PFA en PBS y fíjelos durante toda la noche a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, use PBS para lavar los rebrotos dos veces antes de transferirlos a EDTA 0,5 M en PBS con el fin de descalcificar la matriz ósea a cuatro grados Celsius durante toda la noche. A continuación, incube los rebrotos en una serie de sacarosa en PBS a temperatura ambiente, 30 minutos cada vez, y finalmente en partes iguales de sacarosa al 30% en PBS y medio de congelación tisular durante 30 minutos adicionales.

Transfiera las aletas al medio de congelación de tejidos e incube a cuatro grados Celsius durante al menos dos horas. Luego coloque moldes criogénicos sobre un portaobjetos y llénelos con medio de congelación de tejidos. Transfiera los tejidos en regeneración a los moldes criogénicos y oriente el tejido para obtener secciones longitudinales o transversales.

Asegúrese de que el regenerado esté recto para facilitar el corte en secciones. Junto con la placa de microscopio, transfiera los moldes criogénicos a una rejilla metálica colocada sobre una cama de hielo seco para iniciar el proceso de congelación. Cuando el medio esté sólido, transfiera los moldes criogénicos de regreso a temperatura ambiente para permitir que el medio se derrita en la interfase con el plástico.

Luego, utilizando un instrumento como un bolígrafo, empuje el bloque congelado fuera del molde criogénico y almacénelo a menos 80 grados Celsius hasta su seccionamiento con un microtomo criogénico. Recopile secciones de 10 a 14 micrómetros sobre portaobjetos microscópicos adhesivos y almacene los portaobjetos a menos 20 grados Celsius hasta su uso. Para caracterizar la expresión del respondedor Tet en secciones de aleta, trate las secciones con MEOH al 100% enfriado a menos 20 grados Celsius durante 30 minutos.

Retire cuidadosamente el líquido utilizando una toalla de papel. Luego lave los cortes dos veces con PBT y una vez con PBS durante cinco minutos cada lavado. Incube los cortes durante 10 minutos en dappy antes de lavar con PBS dos veces durante 10 minutos cada vez.

Luego, utilice el medio de montaje Antifa y una lámina de cubierta para montar las muestras antes de usar microscopía de fluorescencia confocal o de campo amplio para obtener imágenes de las muestras, tras haber establecido un sistema TET funcional en pez cebra. Este sistema puede utilizarse para evaluar la función de genes o vías de señalización en tejidos individuales. Como se muestra aquí, el activador tet impulsado por el promotor HER 4.3 induce la expresión del respondedor TED únicamente en un subconjunto de tejidos; se detecta fluorescencia de YFP en la blástula proximal proliferativa, mientras que la blástula distal y el epidermis carecen de expresión.

La expresión del antagonista de beta-catenina WINT actúa en uno de los dominios HER 4.3 que contiene las células proliferativas de la blástula, pero sorprendentemente no tiene efecto sobre la proliferación celular regenerativa. Esto sugiere que la señalización de wind betaine en la blástula proximal proliferativa no desempeña un papel esencial en la regulación de la proliferación de células ML de la blástula. En contraste, el uso de la línea activadora Tet controlada por el promotor de ubiquitina para inducir la expresión de axin uno en todos los tejidos del rebrote de la aleta interfiere fuertemente con la proliferación celular regenerativa.

Además, la expresión de axón uno en el dominio HER 4.3, que no incluye osteoblastos, interfiere fuertemente con la formación ósea en el tejido regenerado. Por lo tanto, la interferencia específica en tejidos con la señalización de wind mediante el sistema TE on revela funciones indirectas inesperadas de la señalización de wind en la regulación de la proliferación celular y la regeneración ósea. Una vez dominada, esta técnica puede utilizarse para lograr una expresión génica dirigida e inducible en cualquier tejido de interés.

Hemos aplicado con éxito este método para investigar las funciones específicas de los tejidos en la señalización de nicotina en la aleta caudal en regeneración del pez S. El uso de este método ayudará a obtener una comprensión más completa de los determinantes moleculares que regulan la regeneración de tejidos.