Name: Aplicación del ADN específico de la mancha verde de metilo en el etiquetado fluorescente de embriones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Aprende a usar el verde de metilo como marcador nuclear fluorescente en microscopía confocal de embriones completos. Este método permite obtener imágenes de alta calidad con excelente resistencia a la fotodegradación.

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Los autores desean agradecer a Patxi Jaso por la producción del vídeo, a PEDECIBA y a la Agencia Nacional de Investigación e Innovación (ANII) por su financiación parcial.

1. Purificación del colorante <ol><li> Preparar una solución acuosa al 4% de verde de metilo disolviendo 0,4 g de polvo de manchas en 10 ml de agua destilada. Mezclar bien hasta que esté completamente disolviéndolo. </li><li> Bajo un humo del capó, se mezcla con al menos 2 partes de cloroformo. Es importante comprobar de antemano si los tubos son resistentes cloroformo. </li><li> Mezclar bien y centrifugar durante 1 min a 2000 xg para acelerar la separación de fases. </li><li> Después de la centrifugación, se obtienen una fase superior acuosa con verde de metilo y una fase orgánica inferior con cloroformo y la habitual cristal violeta contaminante. </li><li> Recuperar la fase superior y repita este paso hasta fase inferior aparece completamente carente de cristal violeta. </li><li> Al final, la fase superior se recuperó y se diluyó en agua hasta una concentración final de 2% de verde de metilo. Esta solución madre es estable en la mesa de trabajo durante meses y no necesita ser protegido de la luz. </li></ol><ol><li> Fijar los embriones durante la noche en 4% de formaldehído (de paraformaldehído) en tampón fosfato salino (PBS). NOTA: Esto puede tardar desde un par de horas para la noche, dependiendo del grosor de los embriones. En el ejemplo, hemos arreglado 48 horas después de la fecundación (HPF) embriones de pez cebra durante la noche. </li><li> Lavar los embriones tres veces en PBS-T (1% Triton X-100 en PBS) durante 5 min. La elevada concentración de detergente permeabiliza la cutícula. </li><li> Preparar una solución 1: 10.000 de verde de metilo (de 2% solución madre) en PBS-T: 5,000-1. La presencia de detergente durante la incubación es útil para muestras gruesas, tales como embriones de pez cebra y larvas. </li><li> Incubar los embriones en la solución durante al menos 6 horas a 4 ° C, con agitación suave. Una vez más, el espesor del embrión es el parámetro de calibración para la longitud de la incubación. </li><li> Lave los embriones 3 times con PBS durante 30 min para eliminar el exceso de detergente. Metil fluorescencia verde sólo es evidente cuando se une al ADN, por lo tanto, el fondo de la molécula no unida es insignificante. </li><li> Montar en una diapositiva excavado o una cámara casera con solución de montaje (75% de glicerol, 0,1 M Tris · HCl pH 8). NOTA: Si la tinción nuclear se va a realizar después de immunolabeling, verde de metilo se puede incorporar a la solución de montaje en la concentración de trabajo, sin necesidad de lavar a la basura. </li><li> Tienda refrigerada o iniciar imágenes inmediatamente. Realizar de imágenes con un confocal de barrido láser (u otro fluorescencia) microscopio con excitación a 633 nm y filtros de emisión establecidos para registrarse en 650-750 nm teniendo en cuenta que el metil emisión verde alcanza su máximo a 677 nm. NOTA: Proporcionamos los datos medidos del perfil de emisión verde de metilo, para ser cargados en el software de adquisición, como material complementario. </li></ol> 3. Fluorescente Nuclear StESP ACIO Plenario polluelo embriones utilizando metil verde <ol><li> Incubar huevos de gallina fertilizados a la etapa de su interés. Fijar los embriones durante la noche en formaldehído al 4% (de paraformaldehído) en PBS a 4 ° C. Lave embriones 3 veces en PBS-T durante 2 horas. </li><li> Preparar una solución 1: 10.000 de verde de metilo (de 2% solución madre) en PBS-T: 5,000-1. Incubar los embriones en la solución de tinción durante la noche a 4 ° C. Lave los embriones 3 veces en PBS, 1 hora cada uno. Monte en la cámara con 75% de glicerol, 0,1 M Tris, pH 8. </li></ol> 4. Imaging marcados con fluorescencia Núcleos de embriones-enteros montada <ol><li> Preparar una cámara de imágenes pegando varias capas de cinta aislante sobre un portaobjetos de microscopio y cuidadosamente cortar un agujero en él con un bisturí para colocar los embriones en su interior. Esto evitará que los embriones de aplastamiento durante la exploración. </li><li> Transferir cuidadosamente los embriones a la cámara de imagen y llenar la cámara a la cima con 75% de glicerol, Tris-HCl 0,1 M, pH = 8 a unla formación de burbujas vacío. </li><li> Cubrir con un # 0 cubreobjetos evitando o eliminando medio desbordante. Selle con esmalte de uñas. </li><li> Adquirir imágenes de la muestra en un microscopio de fluorescencia equipado con un filtro de excitación 633 o línea de láser. NOTA: Los filtros de emisión deben cubrir el máximo 677 emisión de verde de metilo. </li></ol>

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<li>Nordén, B., Tjerneld, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+methyl+green+to+deoxyribonucleic+acid+analyzed+by+linear+dichroism%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Binding of methyl green to deoxyribonucleic acid analyzed by linear dichroism.</a> Chemical Physics Letters. 50 (3), 508-512 (1977).</li>
<li>Lyon, H., Jakobsen, P., Andersen, aP. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+methyl+green-pyronin+Y+procedures+using+pure+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Histochemical+journal%22%5BJournal%5D)">Standardized methyl green-pyronin Y procedures using pure dyes.</a> The Histochemical journal. 18 (2-3), 90-94 (1986).</li>
<li>Amat, F., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+comprehensive+cell+lineage+reconstructions+in+complex+organisms+using+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+growth+%26+differentiation%22%5BJournal%5D)">Towards comprehensive cell lineage reconstructions in complex organisms using light-sheet microscopy.</a> Development, growth & differentiation. 55 (4), 563-578 (2013).</li>
<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+for+mapping+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature methods. 10 (6), 508-5013 (2013).</li>
<li>Lenz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+measurement+in+thick+tissue+layers+by+linear+or+nonlinear+long-wavelength+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Applied%22%5BJournal%5D)">Fluorescence measurement in thick tissue layers by linear or nonlinear long-wavelength excitation.</a> Applied. 38 (16), 3662-3669 (1999).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El progresivo desarrollo de las técnicas de microscopía en las últimas décadas, con especial atención a las variaciones de la microscopía fluorescente, ha llevado a la posibilidad de explorar la dinámica y estructura de muestras de tejido intactas, incluidos embriones enteros10,11. Sin embargo, una limitación importante ha sido la disponibilidad de fluoróforos de buena calidad que se pueden usar para teñir directa y rápidamente las estructuras subcelulares. 
Las tinciones de ADN flu...

La tinción fluorescente de ADN se utiliza amplia y rutinariamente tanto en la investigación biológica como en el diagnóstico clínico, ya sea para el estudio detallado de la estructura nuclear y cromosómica, para contratinción de tejidos y células, o para el estudio de los parámetros del ciclo celular1. Aunque existen varias tinciones de ADN, las más utilizadas han sido las excitadas por luz ultravioleta y emitidas en azul, que encajan en los sistemas habituales de tres filtros utilizados en la mayoría de los microscopios de epifluorescencia convencionales cuando se combinan con fluoróforos emisores de verde y rojo anaranjado, como proteínas fluorescentes o pequeñas moléculas unidas a los anticuerpos. Entre estas tinciones de ADN emisoras de azul, las más comunes son los agentes aglutinantes de surcos menores DAPI y Hoechst2,3. No obstante, la incorporación de una amplia variedad de líneas de emisión láser y la detección espectral en los microscopios de barrido láser, ha permitido a los investigadores optar por el uso de tinciones nucleares emisoras de rojo lejano como el yoduro de propidio (PI) o TO-PRO 34. Una ventaja de estas tinciones es que superan el problema de la autofluorescencia que se encuentra en muchas células y tejidos, particularmente en embriones5, pero muchos de ellos tienen diferentes problemas como tener perfiles de emisión amplios o ser muy sensibles al fotoblanqueo6.
El investigador suizo Friedrich Miescher descubrió el ADN en 1869, extrayéndolo de los núcleos de los glóbulos blancos que se encuentran en el pus. Lo llamó nucleína, y demostró unos años más tarde que formaba precipitados con la tinción relativamente nueva verde de metilo. El verde de metilo está compuesto por tres anillos de anilina, con diferentes grados de metilación, y tiene dos cargas positivas que le permiten unirse fuertemente al surco principal del ADN7,8. Muy pronto se demostró que la tinción de ADN por verde de metilo era específica, lo que llevó al desarrollo por parte de Unna y Pappenheim de una tinción combinada con pironina, que marca específicamente el ARN. Desde entonces, el verde de metilo pironina se ha utilizado ampliamente en la técnica histológica de rutina9.
Hasta hace poco, se sabía muy poco sobre las propiedades fluorescentes del verde de metilo. Nuestro trabajo anterior, sin embargo, ha descubierto algunas de las ventajas espectrales del verde de metilo6, como su excitación a 633 nm, un conveniente desplazamiento de Stokes, su emisión en la porción del espectro electromagnético del infrarrojo cercano, una fotoestabilidad más alta que las tinciones de ADN disponibles comercialmente con propiedades espectrales similares y a un costo muy bajo. Es por eso que decidimos probarlo para su uso como un marcador fluorescente de muy alta afinidad y específico para el ADN en tejidos embrionarios y en embriones completos. Además, hasta ahora, la tinción nuclear con verde de metilo se realizaba a pH bajo, lo que dificultaba su combinación con la tinción de anticuerpos. El objetivo del método aquí detallado es disponer de un protocolo de tinción de ADN nuclear fluorescente que supere el inconveniente antes mencionado al realizar el procedimiento de tinción a pH fisiológico, lo que lo convierte en una contratinción adecuada para el inmunomarcaje en secciones y tejidos completos.

<table><tbody><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Verde de metilo</td><td>Dr. G. Gr&uuml; bler</td><td></td><td>También probó Sigma-Aldrich 323829, que es un 158127</td></tr><tr><td>de microscopía confocal de barrido láser sin paraformaldehído sin cristales Sigma-Aldrich Leica TCS-SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Phalloidin&ndash;<td></td></tr><tr><td> Isotiocianato de tetrametilrodamina B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td> P1951&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>cloroformo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>372978</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5810 R</td><td>eppendorf</td><td>5811 000.010&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>portaobjetos para microscopio</td><td>Deltalab D100004</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cubreobjetos</td><td>Esco optics</td><td>R525025</td><td></td></tr></tbody></table>

aplicación del adn específico de la mancha verde de metilo en el etiquetado fluorescente de embriones

Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos

El verde de metilo se conoce desde hace mucho tiempo como una tinción histológica con una afinidad específica por el ADN, aunque sus propiedades fluorescentes han permanecido inexploradas hasta hace poco. En este artículo, ilustramos el método para preparar una solución madre acuosa de verde metilo, que cuando se diluye se puede usar como una etiqueta nuclear fluorescente muy conveniente para células y tejidos fijos. Se detallan procedimientos sencillos para etiquetar embriones enteros de pez cebra y pollito, y se muestran ejemplos de imágenes obtenidas. El verde de metilo es excitado al máximo por la luz roja, a 633 nm, y emite con un espectro relativamente agudo que alcanza su punto máximo a 677 nm. Es muy barato, no tóxico, muy estable en solución y muy resistente al fotoblanqueo cuando se une al ADN. Su emisión roja permite obtener imágenes confocales de escaneo de alta resolución inalteradas de núcleos en muestras gruesas. Por último, este protocolo de tinción con verde de metilo es compatible con otros procedimientos de tinción celular, como el marcaje de anticuerpos o el marcaje de filamentos de actina con faloidina conjugada con fluoróforos.

Tinción nuclear de muestras gruesas. El protocolo aquí descrito permite el logro de la tinción homogénea de estructuras profundas en embriones enteros. Lentes en desarrollo forman núcleos 48 HPF embriones de pez cebra son homogéneamente etiquetados (Figura 1). Tinción de ADN verde de metilo permite la discriminación de diferencias morfológicas del ciclo celular dependientes tales como la identificación de figuras mitóticas o núcleos apoptóticos (Figura 2a). ...

Se describe un método para la tinción fluorescente de material biológico fijado con la etiqueta específica de ADN verde de metilo. El verde de metilo se utiliza en una solución acuosa diluida y es muy resistente al fotoblanqueo. Su emisión de color rojo lejano permite la obtención de imágenes profundas de las muestras, lo que la hace especialmente adecuada para embriones enteros.

Aplicación del ADN específico de la mancha verde de metilo en el etiquetado fluorescente de embriones

Methyl green has long been known as a histological stain with a specific affinity for DNA, although its fluorescent properties have remained unexplored ...

En este video, mostraremos cómo el colorante histológico muy común verde de metilo puede utilizarse como una etiqueta nuclear extremadamente conveniente en microscopía fluorescente, con aplicaciones especiales en microscopía confocal con láser de especímenes biológicos gruesos, como embriones completos. Tras una breve introducción del verde de metilo como un colorante específico de ADN, describiremos el método para preparar soluciones stock y de trabajo para la tinción fluorescente. Luego, mostraremos el procedimiento experimental para lograr la tinción nuclear y presentaremos varios ejemplos de embriones de pez y de imágenes confocales obtenidas.Finalmente, se demostrarán y discutirán las excelentes propiedades físico-químicas del verde de metilo. Freddy Misha descubrió el ADN en 1869 y mostró unos años después que formaba precipitados con una tinción relativamente nueva, el verde de metilo. El verde de metilo tiene dos cargas positivas que le permiten interactuar fuertemente con el ADN en su grupo mayor, uniéndose preferentemente a regiones ricas en AT.El uso más extendido del verde de metilo ha sido su combinación en una solución nasal con el colorante de ARN perina, un metilo desarrollado por UNA y Poppen Heim a principios del siglo XX. Sin embargo, se ha analizado muy poco sobre las propiedades fluorescentes del verde de metilo, y por ello decidimos probar la posibilidad de que pudiera utilizarse como una etiqueta fluorescente de muy alta afinidad y especificidad para el ADN en células.El verde metilo es un colorante de metano con siete grupos metilo. Este séptimo grupo se pierde fácilmente y se revierte directamente al violeta de cristal. Por esta razón, se añade una cantidad determinada de violeta de cristal mezclada con verde metilo para eliminar los cristales.La solución de verde metilo violeta puede lavarse con cloroformo para extraer el violeta de cristal. Como mostraremos inmediatamente para este propósito, preparamos una solución de ACU al 4 % bajo una campana extractora. La mezclamos con al menos dos partes de cloroformo y centrifugamos para acelerar la separación de fases.Tras la centrifugación, se obtiene una fase acuosa con verde metilo y una fase orgánica inferior con cloroformo y violeta de cristal. Se recuperó la fase superior y se repitió el proceso hasta que la fase inferior quedó transparente. Al final, se recuperó la fase superior y se diluyó.Esta solución es estable sobre el banco de trabajo durante meses. Ahora mostraremos cómo proceder a teñir la capa de embriones MO completa con verde de metilo. Para la microscopía confocal, utilizaremos el embrión de pez con trasplantes de alta eficiencia.Como ejemplo, obtener embriones de pez cebra y lavarlos para eliminar los restos con un colador. Incubarlos hasta la etapa deseada en agua de acuario o medio para embriones. Retirar el corion con pinzas finas y fijar los embriones en formaldehído al 4 % durante varias horas o durante la noche.Luego lave los embriones en PBST varias veces. Prepare una solución de trabajo de verde de metilo diluyendo la solución stock entre cinco y diez mil veces en PBST. Incube los embriones en la solución durante al menos tres horas a temperatura ambiente o durante la noche a cuatro grados Celsius disminuidos.En este ejemplo, se obtendrán imágenes confocales en un microscopio confocal de menor nivel equipado con detectores espectrales. La excitación máxima se logra con un láser de 633 nanómetros y el detector se ajusta a un rango amplio en la región roja del espectro visible.La emisión roja del verde de metilo permite obtener imágenes nucleares de buena calidad incluso de especímenes profundos, como embriones completos, con una pérdida mínima de señal. Esta primera serie muestra una retina de pez cebra cuyos núcleos han sido teñidos con un colorante de ADN bien establecido para tres. Después de un minuto, hacemos zoom hacia afuera.Una región de escaneo ABL resulta evidente cuando realizamos el mismo experimento con verde de metilo, no se observa un blanqueo evidente. En la siguiente serie, mostramos resultados representativos de lo que puede obtenerse utilizando el protocolo descrito aquí: una célula mitótica del epitelio de pez cebra en la que pueden observarse figuras mitóticas. Núcleo IIC del mismo espécimen donde puede apreciarse la arquitectura nuclear.Reconstrucción 3D de una parte de una célula epitelial de larva de pez cebra marcada con amalina verde metílico, una vista más panorámica de diferentes formas nucleares dentro de un embrión de 48 horas post-fertilización, pez plata, retina br. Aquí hemos mostrado una forma sencilla de preparar un colorante fluorescente de ADN extremadamente económico que puede utilizarse para etiquetado nuclear, aunque solo lo mostramos como ejemplo, el método tiene múltiples aplicaciones. Esta técnica puede aplicarse a sus embriones o tejidos, ya sea en preparaciones completas o seccionadas.También se puede utilizar para la tinción de ADN en geles y para la determinación de ADN en solución mediante fotometría.

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Aprende a usar el verde de metilo como marcador nuclear fluorescente en microscopía confocal de embriones completos. Este método permite obtener imágenes de alta calidad con excelente resistencia a la fotodegradación.

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