Aplicación del ADN específico de la mancha verde de metilo en el etiquetado fluorescente de embriones
2 de mayo de 2015
Se describe un método para la tinción fluorescente de material biológico fijado con la etiqueta específica de ADN verde de metilo. El verde de metilo se utiliza en una solución acuosa diluida y es muy resistente al fotoblanqueo. Su emisión de color rojo lejano permite la obtención de imágenes profundas de las muestras, lo que la hace especialmente adecuada para embriones enteros.
En este vídeo, mostraremos cómo la tinción histológica muy común, el verde de metilo, se puede utilizar como una marca nuclear extremadamente conveniente en microscopía fluorescente con las aplicaciones especiales en microscopía confocal láser de muestras biológicas gruesas como embriones enteros. Después de presentar brevemente el verde de metilo como una tinción específica de ADN, describiremos el método para preparar soluciones madre y de trabajo para la tinción fluorescente. A continuación, mostraremos el procedimiento experimental para lograr la tinción nuclear y mantener varios embriones de peces y ejemplos de imágenes confocales obtenidas.
Finalmente, se demostrarán y discutirán las excelentes propiedades físico-químicas de los verdes de metilo. Freddy Misha descubrió el ADN en 1869 y demostró unos años más tarde que formaba precipitados con un anal relativamente nuevo y teñía de verde metilo. El verde de metilo tiene dos cargas positivas que le permiten interactuar fuertemente con el ADN en su grupo principal, uniéndose preferentemente a las regiones de alcance.
El uso más extendido del verde de metilo ha sido su combinación en una solución nasal con perina con tinción de ARN, un metilo desarrollado por UNA y Poppen Heim a principios del siglo XX. Sin embargo, se ha analizado muy poco sobre las propiedades fluorescentes del verde de metilo, y es por eso que decidimos probar la posibilidad de que pudiera usarse como un marcador fluorescente específico y de muy alta afinidad. Para el ADN en las células.
El verde de metilo es una tinción de metano con siete raíces de metilo. Este séptimo grupo se pierde fácilmente y vuelve a ser violeta cristalino. Por esta razón, hay una cantidad de llegada de cristal violeta mezclado con verde de metilo para eliminar el cristal.
La solución de verde de metilo violeta se puede lavar con cloroformo para extraer el cristal violeta. Como mostraremos inmediatamente para este propósito, preparamos una solución de 4%ACU debajo de una campana extractora. Lo mezclamos con al menos dos partes de cloroformo y centrífuga para acelerar la separación de fases.
Después de la centrificación, obtenemos una fase acuosa con verde de metilo y una fase orgánica inferior con cloroformo y violeta cristalino. Remontamos la fase superior y repetimos hasta que la fase inferior aparece clara. Al final, la fase superior se recupera y se diluye.
Esta solución es un establo en el banco de trabajo durante meses. Ahora vamos a mostrar cómo proceder para cuidar el MO entero en la capa de embriones con verde metanfetamina. Para el microing confocal, utilizaremos el embrión de pez de alto trasplante.
Como ejemplo, obtenga embriones de pez cebra y lave los desechos con un colador. Incubarlos hasta la etapa deseada en agua de pecera o medio embrionario. Retire el corium con pinzas finas, fije los embriones al 4% para el formaldehído durante estas horas o toda la noche.
A continuación, lavar los embriones en PBST varias veces. Prepare una solución de trabajo de verde de metilo diluyendo la solución madre de cinco a 10.000 veces en PBST. Incubar los embriones en la solución durante al menos tres horas a temperatura ambiente o durante la noche a cuatro grados centígrados disminuidos.
En este ejemplo, las imágenes confocales se obtendrán en un microscopio confocal menor con detectores espectrales. La excitación máxima se logra con un láser de 633 nanómetros y el detector se ajusta a un amplio rango. En el área roja del espectro visible.
La emisión de rojo verde de metilo permite obtener imágenes nucleares de buena calidad incluso de muestras profundas como embriones enteros con una pérdida de señal mínima. Esta primera serie muestra la retina de un pez cebra cuyos núcleos han sido teñidos con una tinción de ADN bien establecida a pro tres. Después de un minuto nos alejamos.
Una región de escaneo ABL se hace evidente cuando realizamos el mismo experimento con verde de metilo, no se ve un blanqueamiento evidente. En la siguiente serie, mostramos resultados representativos de lo que se puede obtener utilizando el protocolo aquí descrito, célula mitótica de epidermis de pez cebra en la que se pueden observar figuras mitóticas. Núcleo IIC del mismo espécimen donde se puede ver la arquitectura nuclear.
Reconstrucción 3D de una parte de una célula epidérmica de larvas de pez cebra marcada con amalina verde de metilo, una vista más panorámica de diferentes formas nucleares dentro de un puerto de fertilización de 48 horas, pececillos de plata, retina br. Hemos mostrado aquí una forma fácil de preparar una tinción de ADN fluorescente extremadamente barata que se puede utilizar en el marcaje nuclear, aunque solo mostramos como ejemplo, el de contener varios. Esta técnica se puede aplicar a sus embriones o tejidos, ya sea de montaje completo o seccionales.
También se puede utilizar para la tinción de ADN en geles y para la determinación de ADN en solución mediante fotometría.
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Descripción general
Este artículo describe un método para la tinción fluorescente de material biológico fijado utilizando verde metilo, un marcador específico para el ADN. La emisión en el rojo lejano del verde metilo permite la obtención de imágenes profundas de especímenes, lo que lo hace adecuado para embriones completos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Microscopía fluorescente
- Tinción histológica
- Imagen biológica
Antecedentes
- El verde metilo es un colorante histológico común.
- Interactúa fuertemente con el ADN, uniéndose preferentemente a regiones ricas en AT.
- Fue descubierto en el contexto de la investigación del ADN a finales del siglo XIX.
- El colorante es resistente al blanqueo por luz, lo que aumenta su utilidad en microscopía.
Objetivo del estudio
- Demostrar el uso del verde de metilo como marcador nuclear en microscopía fluorescente.
- Proporcionar un método para la preparación de soluciones stock y soluciones de trabajo para tinción.
- Mostrar imágenes confocales de especímenes biológicos gruesos.
Métodos Utilizados
- Preparación de soluciones stock y de trabajo de verde de metilo.
- Tinción fluorescente de material biológico fijado.
- Aplicación de microscopía confocal con láser.
- Obtención de imágenes de embriones completos y análisis de las imágenes confocales.
Resultados principales
- Tinción nuclear exitosa de embriones de pez utilizando verde de metilo.
- Demuestra excelentes capacidades de imagen debido a las propiedades del verde de metilo.
- Las imágenes confocales obtenidas muestran una marcación nuclear clara.
- Se confirmó la resistencia del verde de metilo al fotodesvanecimiento.
Conclusiones
- El verde metilo es una etiqueta nuclear eficaz para la microscopía fluorescente.
- Sus propiedades lo hacen adecuado para la obtención de imágenes de especímenes biológicos gruesos.
- El método puede aplicarse a diversos contextos de investigación biológica.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La marcación nuclear fluorescente con verde de metilo permite la obtención de imágenes de alta resolución de núcleos en especímenes biológicos gruesos, apoyando los flujos de trabajo de descubrimiento temprano y validación de objetivos. Su estabilidad, especificidad por el ADN y compatibilidad con la microscopía confocal proporcionan confianza predictiva para análisis a nivel celular y tisular. Esta capacidad mejora la toma de decisiones en carteras al permitir imágenes robustas y reproducibles en sistemas modelo complejos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Facilita la visualización precisa del núcleo para estudios basados en hipótesis en células y tejidos fijados.
- Apoya la validación funcional de dianas al permitir la identificación clara de la arquitectura nuclear.
- Reduce la ambigüedad mecanicista en modelos celulares mediante la marcación específica del ADN.
- Permite la triage confiable de dianas candidatas basada en datos de imágenes de alta fidelidad.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Prepara sistemas biológicos validados para flujos de trabajo de imágenes de alto contenido posteriores.
- Proporciona una marcación nuclear cuantitativa y reproducible, esencial para la estandarización de ensayos.
- Facilita la escalabilidad y el reutilización de plataformas debido a la estabilidad y bajo costo del verde de metilo.
- Permite una evaluación confiable de compuestos al minimizar el fotodesvanecimiento y la pérdida de señal.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con sistemas modelo relevantes para enfermedades al permitir la obtención de imágenes en embriones completos y tejidos gruesos.
- Mantiene la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante etiquetado nuclear robusto.
- Apoya el avance ajustado al riesgo al proporcionar resultados de imagen consistentes entre diferentes modelos.
- Mejora la reducción predictiva de riesgos gracias a su compatibilidad con protocolos de tinción multiplexada.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
La marcación fluorescente con verde de metilo se integra en el continuo del descubrimiento, desde la prueba inicial de hipótesis hasta la obtención de imágenes preclínicas, apoyando flujos de trabajo que requieren una visualización nuclear robusta en especímenes complejos.
- Biología del Descubrimiento: Permite la verificación de hipótesis y la aclaración de vías mediante imágenes nucleares específicas del ADN.
- Selección: Proporciona etiquetado nuclear reproducible y listo para ensayos en plataformas de cribado de alto contenido.
- Análisis: Ofrece lecturas cuantitativas y fotostables para el análisis comparativo de condiciones celulares.
- Investigación Traducional: Facilita la alineación de biomarcadores y la continuidad en modelos relevantes para enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una solución de etiquetado estable y rentable, adaptable a diversos programas de I+D.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad en la imagenología nuclear.
- Valor operativo: Mejora la estandarización, la reproducibilidad y la escalabilidad en los flujos de trabajo de imagenología.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance/no avance y la eficiencia del capital al permitir la generación de datos robustos.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo y el avance de los programas de descubrimiento.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microscopía confocal y técnicas de imagen fluorescente.
- Necesita acceso a detectores espectrales y fuentes de excitación láser compatibles (por ejemplo, 633 nm).
- Exige la estandarización entre equipos de los protocolos de tinción y adquisición de imágenes para garantizar la reproducibilidad.
- Adaptable a diversos sistemas modelo fijados, incluyendo embriones completos y secciones de tejido.
- Limitado a especímenes fijados; no adecuado para imágenes nucleares en células vivas.
