Imaging Whole-animal y de citometría de flujo Las técnicas para T CD8 + respuestas celulares Análisis de antígeno-específicos después de nanopartículas Vacunación

El objetivo general del siguiente experimento es sintetizar y caracterizar nanopartículas lipídicas para vacunas y evaluar su capacidad para inducir la expansión in vivo de linfocitos T citotóxicos específicos del antígeno. Esto se logra mediante la ingeniería de vesículas multilaminares interbicapa entrecruzadas, o ICMV, que incorporan simultáneamente antígeno y adyuvante, para la vacunación de ratones ingenuos. Transferidos adoptivamente con linfocitos T CD8 positivos específicos del antígeno que expresan luciferasa.

En el segundo paso, se evalúa la expansión de las células T CD8 positivas específicas del antígeno mediante imágenes in vivo en todo el organismo. Las células mononucleares de la sangre periférica obtenidas de los animales inmunizados con ICMV se tiñen entonces con tetrámeros marcados con fluorocromos y se analizan mediante citometría de flujo para cuantificar la frecuencia de las células T CD8 positivas específicas del antígeno endógeno dentro del compartimento sistémico. Finalmente, la imagen bioluminiscente puede utilizarse para rastrear la expansión de los linfocitos T citotóxicos específicos del antígeno en respuesta a la vacunación con nanopartículas.

Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas preliminares clave en el diseño de vacunas, como cuál es el grado de expansión de los linfocitos T citotóxicos y cómo estas células migran hacia diversos tejidos en respuesta a la vacunación con nanopartículas. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como el análisis de linfocitos T in situ tras la necropsia de tejidos, es que la imagenología in vivo de la respuesta de células T es no invasiva. Permite el monitoreo longitudinal del mismo animal. Comience mezclando una proporción molar uno a uno de DOPC y MPB en cloroformo, manteniendo una cantidad total de lípidos de 1,26 micromoles por lote en un vial de vidrio de 20 mililitros.

A continuación, agregue el fármaco lipofílico a la solución lipídica en la concentración deseada y purgue la solución con gas nitrógeno seco adicional para eliminar completamente el disolvente orgánico. Coloque la muestra bajo vacío durante la noche; al día siguiente, agregue por la mañana 200 microlitros de BTP 10 milimolar que contenga el fármaco hidrosoluble de interés para hidratar la película lipídica; vortexee la solución resultante durante 10 segundos cada 10 minutos durante una hora a temperatura ambiente. Luego, transfiera el contenido a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros.

A continuación, coloque el tubo en un baño de hielo con agua, sometiéndolo a sonicación continua utilizando la configuración de intensidad al 40 % en una punta de sonda de 125 vatios y 20 kilohercios. Después de cinco minutos, agregue cuatro microlitros de DTT de 150 milimolar al tubo, vortexee para mezclar y centrifugue brevemente la muestra en una microcentrífuga. Luego, mezcle 40 microlitros de cloruro de calcio de 200 milimolar en la muestra, seguido del entrecruzamiento de las capas lipídicas que contienen MPB con DTT a 37 grados Celsius durante una hora.

Al final de la incubación, centrifugar la solución tres veces, añadiendo 200 microlitros de agua doblemente destilada durante la segunda y tercera centrifugación, para eliminar el cloruro de calcio remanente, el DTT no reaccionado y los materiales de carga no encapsulados del sobrenadante. Después de la última centrifugación, suspendemos los I CMVs en 100 microlitros de pegol recién preparado durante 30 minutos a 37 grados Celsius. Luego, lavar los vesículos dos veces más con agua doblemente destilada.

Re-suspenda el pellet final en PBS y almacene las ICMV a cuatro grados Celsius. Para caracterizar las partículas, mezcle la suspensión fría de ICMV antes de diluir una pequeña alícuota de la muestra en un volumen total de un mililitro de agua doblemente destilada. Luego, coloque las ICMV en una celda para analizador de zeta y utilice un sistema de dispersión dinámica de luz y medición de potencial zeta para determinar el tamaño de partícula, el índice de polidispersidad y el potencial zeta de las muestras según las instrucciones del fabricante.

Para aislar linfocitos T CD8 positivos específicos de ova que expresan luciferasa, primero recolecte los bazo de ratones transgénicos OT1 luciferasa. Coloque los tejidos en cinco mililitros de PBS frío con hielo y 2 %FBS y luego en una campana de cultivo celular.

Utilice el émbolo de una jeringa de tres mililitros para triturar hasta tres bazo a la vez a través de un filtro de 70 micrones hacia un tubo cónico de 15 mililitros. Lave el émbolo y el filtro con PBS y FBS al 2%. Luego, ajuste el volumen total de la suspensión celular a 10 mililitros por bazo.

Determine el número total de células y luego centrifugue las células. A continuación, utilice un kit comercial de selección negativa magnética para aislar las células esplénicas positivas para CD ocho según las instrucciones del fabricante. Luego lave los linfocitos T en PBS.

Cuente las células e incube de dos a tres veces 10 a la quinta de las células en 20 microlitros de anticuerpo bloqueante de CD1632 de ratón. Después de 10 minutos, agregue 20 microlitros de anticuerpo anti-CD8a PC a las células durante 30 minutos y evalúe la pureza de la población de linfocitos T CD8 positivos aislados mediante perlas magnéticas por citometría de flujo. A continuación, transfiera adoptivamente de uno a 10 veces 10 a la quinta células T CD8 positivas OT1 luciferasa a ratones albinos C57BL/6 naíves afeitados en 200 microlitros de PBS mediante inyección intravenosa en la vena de la cola; 24 horas después, administre la vacuna al número apropiado de días posteriores a la vacunación.

Administre a los animales 150 miligramos por kilogramo de Lucifer después de 10 minutos, adquiera la señal de bioluminiscencia durante cinco a 10 minutos con un sistema de imagenología de animal completo para visualizar las células T positivas para OT uno Lucifer CD ocho y determinar el número de células T CD ocho positivas específicas para el antígeno en el momento adecuado. Posterior a la vacunación, recoja aproximadamente 100 microlitros de sangre de los ratones vacunados mediante la técnica de sangrado submandibular en un tubo recubierto con EDTA potásico, invierta el tubo varias veces para prevenir la coagulación. Luego transfiera 100 microlitros de sangre a un tubo de microcentrífuga y agregue un mililitro de un tampón de lisis CK.

Después de dos a tres minutos, centrifugue las células y elimine el sobrenadante. Lave los PBMC restantes en un mililitro de tampón fax y bloquee la unión no específica con CD 1632 tal como se acaba de demostrar. Después de 10 minutos, divida la suspensión celular en tubos fax redondos de cuatro mililitros y agregue 20 microlitros de la solución PE fecal tetramérica H2Kb según las especificaciones del fabricante.

Después de 30 minutos en hielo, agregue 20 microlitros del cóctel de anticuerpos apropiado a cada muestra experimental y los cuatro anticuerpos de control fluorocuatro para cada tetrámero con etiqueta fluorocuatro o anticuerpo a cada muestra de control. Finalmente, tras otra incubación de 20 minutos, lave todas las muestras en tampón de fax, resuspenda los pellets en tampón de fax suplementado con DPI y analice las muestras mediante citometría de flujo. Los CMV cargados conjuntamente con antígenos de proteína fluorocuatro y colorantes lipofílicos fluorescentes permiten la visualización in vivo de la entrega de antígenos y nanopartículas. Por ejemplo, imágenes de microscopía confocal indican que el antígeno soluble administrado por vía subcutánea en la base de la cola alcanza los ganglios linfáticos drenantes dentro de las cuatro horas posteriores a la administración y se elimina a las 24 horas.

En contraste, los CMV I sobrecargados se detectan primero en la periferia de los ganglios linfáticos drenantes a las 24 horas posteriores a la administración, con una acumulación continua que da como resultado un depósito considerable de CMV I ova dentro del tejido linfático drenante. Al cuarto día, de hecho, la imagen de bioluminiscencia de ratones C57BL/6 transferidos adoptivamente con células T CD8 positivas OT1 luciferasa el día de la vacunación demuestra un nivel mínimo de fondo de células T OT1 luciferasa al cuarto día posterior a la vacunación. Sin embargo, los ratones inmunizados con los CMV I ova MPI exhiben una señal de bioluminiscencia robusta dentro de los ganglios linfáticos inguinales drenantes.

Los ratones vacunados con ova soluble, por otro lado, muestran una expansión mucho menor de las células T CD8 positivas OT-I Lucifer en los ganglios linfáticos drenantes. Además, los ratones inmunizados con ova soluble y MPLA, sin ninguna transferencia adoptiva de células T específicas para el antígeno, no exhiben una expansión apreciable de células T CD8 positivas específicas para ova, tal como lo indica el monitoreo semanal de las células mononucleares periféricas (pbmc). La vacunación con ICMV, sin embargo, provoca una respuesta endógena de células T CD8 positivas significativamente más fuerte, alcanzando un pico del 28 % de las células T positivas para el tetrámero sin fecal dentro del compartimento de células T CD8 positivas entre las pbmc al día 41. Después de ver este video, usted debería tener una buena comprensión de cómo sintetizar nanopartículas basadas en lípidos, realizar inmunizaciones y visualizar y cuantificar la expansión de células T citotóxicas in vivo.

Estos métodos pueden modificarse aún más para revelar información adicional sobre la respuesta CTL. Por ejemplo, el ensayo de tinción teer puede complementarse con marcadores adicionales como CD127, BCL2 y KLRG1 para evaluar el fenotipo de memoria de las células.