Imaging Whole-animal y de citometría de flujo Las técnicas para T CD8 + respuestas celulares Análisis de antígeno-específicos después de nanopartículas Vacunación

El objetivo general del siguiente experimento es sintetizar y caracterizar nanopartículas de vacunas basadas en lípidos y evaluar su capacidad para provocar la expansión de linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno in vivo. Esto se logra mediante la ingeniería de patógenos que imitan a la inter bicapa, vesículas multilam reticuladas o CMV I cocargados con antígeno y adyuvantes para la vacunación de ratones naïve. Se transfieren adoptivamente con luciferasa que expresa linfocitos T positivos CD ocho antígenos específicos.

En el segundo paso, se evalúa la expansión de las células T positivas CD ocho específicas del antígeno mediante imágenes in vivo de animales enteros. A continuación, las células mononucleares de sangre periférica extraídas de los animales inmunizados por el ICMV se tiñen con tetrámeros marcados con fluorescencia y se analizan mediante citometría de flujo para cuantificar la frecuencia de las células T positivas CD ocho específicas del antígeno endógeno dentro del compartimento sistémico. En última instancia, las imágenes bioluminiscentes se pueden utilizar para rastrear la expansión de los linfocitos T citotóxicos específicos del antígeno en respuesta a la vacunación con nanopartículas.

Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas preliminares clave en el diseño de vacunas, como ¿cuál es el grado de expansión de los linfocitos tiales citotóxicos y cómo se transportan estas células a varios tejidos en respuesta a la vacunación con nanopartículas? La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el análisis in situ de células T después de la necropsia de tejidos, es que la obtención de imágenes in vivo de la respuesta de las células TT no es invasiva. Permitir el monitoreo longitudinal del mismo animal Comience mezclando una proporción molar de uno a uno de DOPC y MPB en cloroformo, manteniendo una cantidad total de lípidos de 1,26 micromoles por lote en un vial de vidrio de 20 mililitros.

A continuación, agregue carga lipofílica a la solución lipídica a la concentración deseada y purgue la solución con gas nitrógeno extra seco para eliminar completamente el solvente orgánico. Coloque la muestra al vacío durante la noche a la mañana siguiente a 200 microlitros de BTP de 10 milimolares que contenga la carga soluble en agua de interés para hidratar el vórtice de la película lipídica, la solución resultante durante 10 segundos cada 10 minutos durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, transfiera el contenido a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

A continuación, coloque el tubo en un baño de agua helada con sonicación continua utilizando el ajuste de intensidad del 40% en una sonda de 125 vatios y 20 kilohercios. Después de cinco minutos, agregue cuatro microlitros de DTT de 150 milimolares al vórtice del tubo para mezclar y centrifugar la muestra en una microcentrífuga. A continuación, mezcle 40 microlitros de cloruro de calcio de 200 milimolares en la muestra, seguido de la reticulación de las capas lipídicas que contienen MPB con DTT a 37 grados centígrados durante una hora.

Al final de la incubación, centrifugar la solución tres veces a 200 microlitros de agua destilada doble durante la segunda y tercera centrifugación para eliminar el cloruro de calcio restante sin reaccionar DTT y los materiales de carga no encapsulados del sobrenadante. Después del último giro, suspendemos los CMV I en 100 microlitros de pegol recién preparado durante 30 minutos a 37 grados centígrados. A continuación, lave las vesículas dos veces más en agua destilada doble.

Resus suspendiendo el pellet final en PBS y almacenando el ICM VS a cuatro grados centígrados. Para caracterizar las partículas, mezcle la suspensión fría de ICMV antes de diluir una pequeña alícuota de la muestra en un volumen total de un mililitro de agua bidestilada. A continuación, coloque los CMV I en una celda calibradora zeta y utilice un sistema de medición de dispersión de luz dinámica y potencial zeta para medir el tamaño de partícula, el índice de dispersión polivinílica y el potencial zeta de las muestras de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Aislar óvulos específicos de luciferasa que expresan células T CD ocho positivas. Primero cosecha los bazos de ratones transgénicos de luciferasa OT. Coloque los tejidos en cinco mililitros de PBS helado y 2% de FBS y luego en una campana de cultivo de tejidos.

Use el émbolo de una jeringa de tres mililitros para moler hasta tres bazos a la vez a través de un colador de 70 micras en un tubo cónico de 15 mililitros. Lave el émbolo y el colador con PBS y 2% FBS. A continuación, lleve el volumen total de la suspensión de citis a 10 mililitros por bazo.

Determine el número total de celdas y luego gire hacia abajo las celdas. A continuación, utilice un kit de selección de negativos magnéticos disponible en el mercado para aislar las células de bazo CD ocho positivas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, lave las células T en PBS.

Contarlas e incubar de dos a tres veces 10 a la quinta de las células en 20 microlitros de anticuerpo bloqueante CD 1632 de ratón. Después de 10 minutos, agregue 20 microlitros de anticuerpo anti CD ocho A PC a las células durante 30 minutos y evalúe la pureza de la población de células T positivas CD ocho aisladas con perlas magnéticas mediante citometría de flujo. A continuación, transfiera adoptivamente de uno a 10 veces 10 al quinto OT una luciferasa CD ocho células T positivas en ratones albinos C 57 negros afeitados sin afeitar nunca en 200 microlitros de PBS mediante inyección intravenosa en la vena de la cola 24 horas después, administre la vacuna en el número adecuado de días después de la vacunación.

Inyecte a los animales 150 miligramos por kilogramo de Lucifer después de 10 minutos, adquiera la señal de bioluminiscencia durante cinco a 10 minutos con un sistema de imágenes de animales completos para visualizar el OT un Lucifer CD ocho células T positivas para determinar el número de células T positivas CD ocho antígeno específico en el momento apropiado. Después de la vacunación, recoja aproximadamente 100 microlitros de sangre de los ratones vacunados a través de la técnica de sangrado submandibular en un tubo recubierto con EDTA de potasio, invierta el tubo varias veces para evitar la coagulación. A continuación, transfiera 100 microlitros de sangre a un tubo de microcentrífuga y añada un mililitro de un tampón de lisis CK.

Después de dos o tres minutos, centrifugar las células y eliminar el sobrenadante. Lave el PBMC restante en un mililitro de búfer de fax y bloquee el enlace no específico con CD 1632 como se acaba de demostrar. Después de 10 minutos, divida la suspensión celular en tubos de fax de fondo redondo de cuatro mililitros y agregue 20 microlitros de H dos KB sobre una solución de PE fecal sinfecal de tetrámero a cada muestra de acuerdo con las especificaciones del fabricante.

Después de 30 minutos en hielo, agregue 20 microlitros del cóctel de anticuerpos apropiado a cada muestra experimental y los anticuerpos de control de fluoro cuatro para cada tetrámero o anticuerpo de etiqueta de fluoro cuatro a cada muestra de control. Finalmente, después de otros 20 minutos de incubación, lavar todas las muestras en tampón de fax, resuspender los pellets en tampón de fax suplementado con DPI, y analizar las muestras por citometría de flujo, CMVs cocargados con antígenos proteicos de cuatro tactos fluorados y colorantes lipofílicos fluorescentes que permiten la visualización de la entrega de antígenos y nanopartículas in vivo. Por ejemplo, las imágenes de microscopía confocal indican que el antígeno soluble administrado por vía subcutánea en la base de la cola, llega a los ganglios linfáticos de drenaje dentro de las cuatro horas posteriores a la administración y se elimina a las 24 horas.

Por el contrario, los CMV I sobrecargados se detectan por primera vez en la periferia de los ganglios linfáticos drenantes a las 24 horas después de la administración, con una acumulación continua que da lugar a un gran depósito de CMV de óvulos I dentro del tejido linfático drenante. Al cuarto día, las imágenes de bioluminiscencia de C 57 BL seis ratones transferidos adoptivamente con células T positivas OT una luciferasa CD ocho el día de la vacunación demuestran un nivel mínimo de fondo de OT una luciferasa tcell al cuarto día después de la vacunación. Sin embargo, los ratones inmunizados con los óvulos MPI CMV exhiben una señal de bioluminiscencia robusta dentro de los ganglios linfáticos inguinales que drenan.

Los ratones vacunados con óvulos solubles, por otro lado, demuestran una expansión mucho menor de la célula T positiva OT one Lucifer CD 8 dentro de los ganglios linfáticos drenantes. Otros ratones inmunizados con óvulos solubles y MPLA sin ninguna transferencia adoptiva de células T específicas de antígeno no exhiben una expansión apreciable de células T CD ocho positivas específicas de óvulos como lo indica el monitoreo semanal de la vacunación contra ICMV pbmc, sin embargo, provoca una respuesta de células T CD ocho positivas significativamente más fuerte y endógena logrando un pico del 28% de las células T positivas tetrámero sinfecal dentro del compartimento de células T CD ocho positivas entre PBMC para el día 41. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo sintetizar nanopartículas basadas en lípidos, realizar inmunizaciones y visualizar y cuantificar la expansión de CTL in vivo.

Estos métodos se pueden modificar aún más para revelar información adicional sobre la respuesta CTL. Por ejemplo, el ensayo de tinción de Teer se puede complementar con marcadores adicionales como CD 1 27, BCL dos y K lrg uno para evaluar el fenotipo de memoria de las células.