Name: Imaging Whole-animal y de citometría de flujo Las técnicas para T CD8 + respuestas celulares Análisis de antígeno-específicos después de nanopartículas Vacunación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Aprende a sintetizar nanopartículas lipídicas vacunales y evaluar la expansión de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno en ratones mediante imágenes de bioluminiscencia y citometría de flujo.

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Este estudio fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud otorga 1K22AI097291-01 y por el Centro Nacional para el Avance de las Ciencias de traslación de los Institutos Nacionales de la Salud con el Número Premio UL1TR000433. También reconocemos Prof. Darrell Irvine en el MIT y profesor Matthias Stephan en el Centro del Cáncer Fred Hutchinson por su contribución en el trabajo inicial sobre las nanopartículas de vacunas y ratones transgénicos OT-I / Luc.

Todos los experimentos descritos en este protocolo fue aprobado por el Comité Universitario de Uso y Cuidado de los Animales (UCUCA) de la Universidad de Michigan y realizaron de acuerdo con las políticas y directrices establecidas. 1. Síntesis y caracterización de ICMVs Co-cargado con proteína de antígeno y adyuvante Moléculas <ol><li> Mezclar 1: 1 relación molar de 1,2-dioleoyl- sn -glicero-3-fosfocolina (DOPC) y 1,2-dioleoyl- sn -glicero-3-phosphoethanolamine- N - [4- (p -maleimidophenyl) butiramida] (MPB) en cloroformo, manteniendo la cantidad total de lípidos en 1,26 mol por lotes (es decir, 500 g de DOPC y 630 g de MPB) en un vial de vidrio de 20 ml (diámetro = 28 mm y la altura = 61 mm). </li><li> Añadir fármacos lipófilos, como monofosforil lípido A (MPLA), o colorantes lipófilos (por ejemplo, DiD), a la solución de los lípidos en la concentración deseada. Eliminar completamente el disolvente orgánico purgando con nitroge extra secon gas y la colocación de las muestras al vacío O / N. </li><li> Hidratar la película lipídica mediante la adición de 200 l de 10 mM de propano bis-tris (BTP, pH 7,0) que contiene fármacos solubles en agua (por ejemplo, antígenos de proteína). Vortex durante 10 s cada 10 min durante 1 hora a RT. </li><li> Transferir el contenido del frasco de vidrio en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, colocar las muestras en un baño de agua helada, y sonicar continuamente durante 5 min usando la intensidad del 40% en un ajuste / 20 kHz sonicador de sonda de punta de 125 W. </li><li> Añadir 4 l de ditiotreitol 150 mM (DTT) a cada lote (trabajando concentración 2,4 mM), vórtice, y centrifugar brevemente utilizando una microcentrífuga de mesa. </li><li> Añadir 40 l de 200 mM CaCl 2 y mezclar con la pipeta (trabajando concentración 33 mM). Incubar las muestras a 37 ° C durante 1 hora para permitir la reticulación de MPB-que contiene capas de lípidos con DTT. </li><li> Centrifugar las muestras a 20.000 xg durante 15 minutos, retire el sobrenadante y resuspender en 200 l de ddiH 2 O. </li><li> Repita el paso 1.7 y centrifugar de nuevo después de la segunda ddiH 2 O de lavado para eliminar CaCl 2, DTT sin reaccionar, y materiales de carga no encapsuladas a partir del sobrenadante. </li><li> Preparar 10 mg / ml de 2 kDa polietilenglicol-tiol (PEG-SH) en ddiH 2 O. Resuspender cada muestra ICMV en 100 l de solución de PEG-SH y se incuba a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Realice dos ddiH 2 O lavados (paso 1.7) y resuspender el botón ICMV final en PBS y se almacena a 4 ° C. Antes de usar, mezclar la suspensión ICMV, como partículas pueden depositarse en el fondo después de un almacenamiento prolongado. </li><li> Para la caracterización de partículas, extraer una pequeña alícuota (~ 10%) de ICMVs de cada lote y diluir individualmente en un volumen total de 1 ml de ddiH 2 O. Coloque una sola muestra en un tamaño de partícula Zetasizer celular y medida, índice de polidispersidad, y el potencial zeta de las muestras usando un DLS y sistema de medición potencial zeta (de acuerdo con el protocolo del fabricante). </li></ol> 2. El examen de Nódulo Linfático Drenaje de ICMVs fluorescencia etiquetada con Microscopía Confocal <ol><li> Preparación de ICMVs cargado con antígeno-fluoróforo etiquetado y colorante fluorescente lipofílico <ol><li> Preparar proteína fluoróforo de etiquetado, tales como ovoalbúmina hace reaccionar con Alexa Fluor 555-éster de succinimidilo, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Para preparar ICMVs etiquetados con fluoróforo en la cáscara de los lípidos, añadir colorante fluorescente lipofílica, (por ejemplo, 1,1-dioctadecil-3,3,3 &#39;, 3&#39;-Tetramethylindodicarbocyanine, (DiD)) durante la preparación de la película lipídica (Paso 1.2) en 0,05% de lípidos cantidad molar. Para lípidos hidratación película (Paso 1.3), tampón uso que contiene el antígeno fluoróforo etiquetado, y la síntesis ICMV completa tal como se describe en los pasos 1.4 a 1.11. </li></ol></li><li> La administración subcutánea de nanopartículas a base de la cola <ol><li> Anestesiar ratón usando un vaporizador flujo controlado equipado con una cámara de inducción utilizing 3% isoflurano y 1,5 l / min de flujo de oxígeno de acuerdo con un protocolo aprobado IACUC animal. Una vez que el ratón está inconsciente, realice los siguientes pasos con rapidez antes de la anestesia que desaparecen para permitir un acceso óptimo a el sitio de la inyección y minimizar las molestias al animal. También puede utilizar un buen cono de la nariz apropiado para mantener la anestesia. Si los ratones se anestesiaron durante más de 5 min, aplicar lubricante necesario para minimizar la irritación del ojo después del procedimiento. </li><li> Pulverizar la base de la cola con etanol al 70% para desinfectar y humedecer la parte de piel el pelo mojado para exponer un pequeño parche de piel visible, que puede ser utilizado para visualizar la aguja bajo la piel. </li><li> Prepare suspensión inyección de partículas que contiene la cantidad deseada de antígeno y adyuvante por 100 l de dosis de vacunación en PBS (por ejemplo, 10 g OVA y 0,3 g MPLA por 100 l de dosis de inyección se ha utilizado en el pasado 6,9). </li><li> Dibujar el int suspensión de partículasjeringuilla oa una aguja 27-29 G e insertar la aguja en la base de la cola (~ 5 mm de la línea del cabello) con el bisel hacia arriba e inyectar 50 l de la suspensión de partículas 22. </li><li> Espere unos segundos para que la presión de igualar para evitar excesiva de reflujo y tire de la aguja. Repetir la inyección en el otro lado de la base de la cola para dirigirse tanto que drenan los LN inguinales. </li></ol></li><li> Preparación de cryosections ganglios linfáticos y el examen con el microscopio confocal. <ol><li> La eutanasia del ratón con asfixia con CO2, seguido por neumotórax inducida de acuerdo con un protocolo aprobado IACUC animal. Extraer los LN inguinales, según el protocolo demostrado en Bedoya 23 y lavar la sangre mediante la colocación de los tejidos en 1 ml de PBS 4 ° C. </li><li> Absorbe el PBS de los tejidos con tejidos y colocar el tejido en criomoldes de tejido (10 x 10 x 5 mm 3) precargada a la cima con 24 octubre medio de congelación. Snap congelar la tisdemandar bloque en nitrógeno líquido durante 30 segundos. Como alternativa, coloque bloque de tejido en hielo seco durante 30 minutos. Almacenar tejido congelado en -80 ° C congelador. </li><li> Cortar secciones de tejido de 5-10 m de espesor en un criostato fijado en -20 ° C 24. </li><li> Si es necesario, lleve a cabo el etiquetado de inmunofluorescencia, y examinar el tejido con la microscopía confocal como previamente demostrada 24. </li></ol></li></ol> 3. Monitoreo de expansión de antígeno-específica, luciferasa que expresan las células T CD8 + después de nanopartículas vacunación con Whole Animal Imaging <ol><li> Aislamiento de OVA 257-264 específico de, las células T CD8 + que expresan luciferasa de OT-I / Luc ratones transgénicos <ol><li> La eutanasia a un ratón transgénico OT-I / Luc con asfixia de CO 2 e inducir un neumotórax de acuerdo con un protocolo aprobado IACUC animal. Se recoge el bazo de una manera estéril mediante el acceso a la cavidad peritoneal y con cuidado de extraer el tejido del páncreas 23, ylugar en 5 ml de 4 ° C PBS + FBS al 2% para la transferencia a la campana de cultivo de tejidos. </li><li> Coloque el bazo en un colador de nylon 70 micras sobre un tubo de centrífuga cónico de 50 ml (hasta 3 bazos a la vez). El uso de un émbolo de una jeringa de 3 ml, moler las células a través del colador. </li><li> Lave el émbolo y el filtro con PBS + FBS al 2% y deseche. Llevar el volumen total a 10 ml / bazo en el tubo de 50 ml, tomar una pequeña muestra de la suspensión celular a contar con un hemocitómetro, y se centrifuga durante 10 min a 300 x g. </li><li> El uso de un kit de selección negativa magnético disponible comercialmente, aislar la población de células T CD8 +, siguiendo las instrucciones del fabricante. </li><li> Después de lavar las células con PBS, contar el número de células T CD8 + aisladas. Para evaluar la pureza de las células T CD8 + aisladas, incubar ~ 20.000-30.000 células en 20 l de CD16 de ratón / 32 anticuerpo (0,025 mg / ml) durante 10 min, a continuación, añadir 20 l de anticuerpo αCD8-APC (0,005 mg / ml) y se incuba durante 30 min. Performa todas las incubaciones a 4 ° C en PBS + 1% w / v BSA. Realizar análisis de citometría de flujo 25. </li></ol></li><li> La transferencia adoptiva de células T CD8 + aisladas y la visualización de su expansión después de la vacunación <ol><li> Realice la transferencia adoptiva de células T aisladas OT-I / Luc CD8 + en ingenuo C57BL / 6 ratones mediante la administración de 1-10 × 10 5 células en un volumen de 200 l de PBS mediante inyección intravenosa vena de la cola 22 (día -1). Teniendo en cuenta que los parches de piel y de la piel negro en ratones C57BL / 6 puede interferir con la señal bioluminiscente, albinos afeitado C57BL / 6 ratones son ideales para estos estudios. </li><li> Después de un día (día 0), administrar la vacuna como se describe anteriormente (sección 2.2). </li><li> Administrar 150 mg de luciferina por kg de peso corporal del ratón por vía intraperitoneal en un volumen de 300 l de PBS. Después de 10 min, anestesiar los ratones con isoflurano (como en el paso 2.2.1) y visualizar las células T OT-I / Luc CD8 + mediante la adquisición de la señal de la bioluminiscencia durante 5-10 min won un sistema de imágenes de animales conjunto (IVIS; consulte Wilson 26 para obtener instrucciones detalladas). Repita según sea necesario para los estudios longitudinales. </li></ol></li></ol> Las células 4. péptido-MHC de tetrámeros La tinción de PBMCs de Análisis del antígeno T CD8 + específicas Nota: El procedimiento siguiente protocolo se puede realizar utilizando cualquiera de ratones C57BL / 6 adoptiva transferidos con las células T OT-I / Luc CD8 + o C57BL / 6 ratones sin la transferencia adoptiva. <ol><li> En un punto de tiempo deseado después de la vacunación, recoger aproximadamente 100 l de sangre (4-6 gotas) de los ratones a través de la técnica de sangrado submandibular 27 en un tubo revestido con K 2 EDTA y se invierte varias veces para prevenir la coagulación. </li><li> Transferir 100 l de sangre a un tubo de microcentrífuga, añadir 1 ml de tampón de lisis, y se incuba durante 2 a 3 min con el fin de eliminar los glóbulos rojos (GR). Centrifugar las muestras durante 5 min a 1.500 xg y eliminar el sobrenadante. Si el pellet todavía unappears rojo (que indica eliminación incompleta de los glóbulos rojos), repetir la etapa de lisis con una breve incubación (&lt;1 min) de tampón de lisis. </li><li> Lavar las PBMCs restantes con 1 ml de tampón FACS (PBS + 1% p / v BSA) y centrifugar a 1500 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender la muestra en 20 l de ratón CD16 / 32 anticuerpo (0,025 mg / ml) para bloquear el anticuerpo no específica y mediada por FcR vinculante. Incubar durante 10 min a TA. </li><li> Transferir las células a partir de tubos de microcentrífuga en 4 ml de fondo redondo de tubos de FACS. Añadir 20 l de H-2K b solución OVA Tetramer-SIINFEKL-PE de acuerdo con las especificaciones del fabricante a cada muestra y se incuba durante 30 minutos en hielo. </li><li> Prepare el cóctel de anticuerpos (por ejemplo, αCD8-APC, αCD44-FITC y αCD62L-PECy7 anticuerpos (0.005, / ml de concentración 0.005 y 0.002 mg, respectivamente)). Añadir 20 l a cada muestra experimental, y se incuba durante 20 min en hielo. Preparar controles individuales fluoróforo por labeling células con cada tetrámero fluoróforo de etiquetado o anticuerpo a la concentración indicada anteriormente. </li><li> Lavar 2 veces con tampón FACS y resuspender el sedimento final en tampón FACS que contiene 2 mg / ml de DAPI. Las células están ahora listas para citometría de flujo (análisis de detalles y ejemplos se pueden encontrar en Scheffold 25). </li></ol>

Perkin Elmer siempre que el coste de producción incurridos durante la publicación de este artículo.

El protocolo previsto en este artículo se describe la síntesis y caracterización de un nuevo sistema de nanopartículas a base de lípidos, denominados ICMVs, y proporciona el proceso de validar la efectividad de las formulaciones vacunales basados ​​en nanopartículas para inducir respuestas de células T CD8 + específicas de antígeno. ICMV síntesis se completa en todas las condiciones acuosa, que es una importante ventaja en comparación con otros sistemas de nanopartículas poliméricas comúnmente utilizados (por ejempl...

Desarrollo de la vacuna tradicional ha empleado principalmente el enfoque empírico de ensayo y error. Sin embargo, con el reciente desarrollo de una amplia variedad de biomateriales y descubrimiento de los determinantes moleculares de la activación inmune, ahora es posible diseñar racionalmente formulaciones de vacunas con señales biofísicos y bioquímicos derivados de patógenos 1,2. En particular, varias plataformas de administración de fármacos de partículas han sido examinadas como portadores de vacuna, ya que pueden ser co-cargado con antígenos de subunidades y agentes inmunoestimulantes, proteger componentes de la vacuna de la degradación, y mejorar su co-entrega a células presentadoras de antígeno (APCs) que reside en la linfa nodos (LNS), maximizando así la estimulación inmune y la activación 3-5. En este informe, se describe la síntesis de un sistema de nanopartículas &quot;patógenos imitando&quot;, denominado vesículas multilamelares-interbilayer reticulado (ICMVs), que se han demostrado previamente como platfor vacuna potentem para elicitación de robusta de linfocitos T citotóxicos (CTL) y respuestas inmunes humorales en ambos compartimentos de tejido sistémicas y mucosas 6-9. En particular, la vacunación con ICMVs Conseguido mejorado sustancialmente los niveles de IgG en suero contra un antígeno de la malaria, en comparación con la vacunación con adyuvantes convencionales (por ejemplo, alumbre y Montanide) 7 y también suscitó respuestas CTL potentes contra las células tumorales y modelos de desafío virales en ratones 9. Aquí, utilizando ICMVs como un sistema de nanopartículas vacuna modelo, se describen los métodos para la caracterización de la vacuna nano-formulaciones, incluyendo el tamaño de las partículas y las mediciones de potencial zeta y el seguimiento de la trata de partículas para los LN de drenaje (dLNs) que utilizan la imagen confocal de tejidos cryosectioned 7. Además, se presenta un método basado en imágenes-toda-animales de analizar la expansión de las respuestas de CTL en ratones después de la transferencia adoptiva de células T CD8 + específicas de antígeno que expresan luciferasa 9,10. Finalmente, detinción de tetrámero escriba de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) para la cuantificación longitudinal de las respuestas de células T endógenas en ratones vacunados con nanopartículas de 6,9. ICMVs son una formulación de nanopartículas a base de lípidos sintetizados por fusión controlada de liposomas simples en estructuras multilaminares, que luego son estabilizadas químicamente por grupos de cabeza de fosfolípidos de maleimida-funcionalizado de reticulación dentro de las capas de lípidos con ditiol reticulantes 6. Una vez ICMVs se sintetizan, una pequeña fracción de nanopartículas se puede utilizar para determinar el tamaño de partícula y el potencial zeta (es decir, la carga superficial de las partículas) con un sistema de dispersión de luz dinámica (DLS) y un analizador de potencial zeta. DLS mide los cambios en la dispersión de luz en suspensiones de partículas, lo que permite la determinación del coeficiente de difusión y el tamaño hidrodinámico de partículas 11. El logro de tamaño de partícula consistente de lote a lote síntesis es críticoya que el tamaño de partícula es uno de los principales factores que influyen en el drenaje linfático de partículas de vacunas para dLNs y captación celular posterior por APCs 12,13. Además, el potencial zeta puede obtenerse mediante la medición de la velocidad de las partículas cuando se aplica una corriente eléctrica, que permite la determinación de la movilidad electroforética de las partículas y superficie de las partículas de carga 11. Garantizar valores de potencial zeta consistentes de partículas es importante ya que la carga superficial de las partículas determina la estabilidad coloidal, la cual tiene un impacto directo sobre la dispersión de partículas durante el almacenamiento y después de la administración in vivo 14,15. Con el fin de realizar un seguimiento de la localización de partículas para dLNs, ICMVs pueden ser etiquetados con fluoróforos deseados incluyendo colorantes lipófilos y antígenos covalentemente etiquetados. Después de la inmunización, los ratones pueden ser sacrificados en diversos puntos temporales, dLNs resecadas, cryosectioned, y se analizaron con microscopía confocal. Esta técnica permite la visualización de Desagüe linfáticoción tanto de los transportistas y el antígeno de la vacuna dLNs nanopartícula. Las secciones de tejido, además, se pueden teñir con anticuerpos marcados fluorescentemente y utilizado para obtener más información, tales como tipos de células asociadas con el antígeno y la formación de centros germinales como hemos demostrado previamente 7. Una vez que la síntesis de partículas está optimizado y el tráfico a las dLNs se confirma, es importante para validar la elicitación de expansión de CTL in vivo. Con el fin de analizar la elicitación de las células T CD8 + específicas de antígeno en respuesta a la vacunación de nanopartículas, hemos utilizado un antígeno modelo, ovoalbúmina (OVA), con OVA 257-264 péptido (SIINFEKL) inmunodominante epítopo de células T CD8 +, que permite análisis inmunológicos detalladas de las respuestas de células T específicas de antígeno de 16,17 inicial el desarrollo de vacunas. En particular, para interrogar a la dinámica de expansión y migración de las células T CD8 + específicas de antígeno, hemos generado unamodelo de doble ratón transgénico mediante el cruce de luciferasa de luciérnaga-expresión de ratones transgénicos (Luc) con OT-I ratones transgénicos que poseen las células T CD8 + con receptor de células T (TCR) específico para SIINFEKL (en asociación con H-2K b). A partir de estos ratones OT-I / Luc, luciferasa que expresan, las células T OT-I CD8 + pueden ser aislados y preparados para la transferencia adoptiva en ingenuas ratones C57BL / 6. Una vez sembrada, la inmunización con éxito con nanopartículas que contienen OVA-dará lugar a la expansión de las células T transferidas, que pueden ser rastreados mediante el control de la señal de bioluminiscencia con todo un sistema de imagen 9,10 animal. Esta técnica de formación de imágenes de todo el cuerpo no invasiva se ha utilizado con otros antígenos virales o tumorales en el pasado 18-20, revelando procesos implicados en la expansión de células T en los tejidos linfoides y difusión a los tejidos periféricos de una manera longitudinal. Complementario al análisis de adoptivamente células T CD8 + específicas de antígeno transferidos, endogenolas respuestas de células T después de la vacunación nos puede ser examinado con el complejo péptido-mayor de histocompatibilidad (MHC) de ensayo tetrámero 21, en ​​el que un complejo tetrámero MHC-péptido, que consta de cuatro fluoróforo de etiquetado MHC de clase I moléculas cargado con epítopos de péptidos, se emplea para unirse TCR y la etiqueta las células T CD8 + de una manera específica de antígeno. El ensayo de tetrámero de péptido-MHC se puede realizar ya sea en estudios de necropsia terminales para identificar las células T CD8 + específicas de antígeno en tejidos linfoides y periféricas o en estudios longitudinales con células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) obtenidas a partir de extracciones de sangre en serie. Después de la tinción de los linfocitos con el péptido-MHC tetrámero, citometría de flujo análisis se realiza para los análisis detallados sobre el fenotipo de los CTL o cuantificación de su frecuencia entre las células T CD8 +.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Síntesis y caracterización de ICMVs cocargados con antígeno proteico y moléculas adyuvantes</td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[4-(p-maleimidofenil)butiramida] (sal sódica) (MPB)</td><td>Avanti Polar Lipids, INC.</td><td></td><td></td>870012</tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids, INC.</td><td></td><td></td>850375</tr><tr><td>Lípido monofosforílico A (sintético) (PHAD&trade;) (MPLA)</td><td>Avanti Polar Lipids, INC.</td><td>699800</td><td></td></tr><tr><td>Viales de vidrio de 20 ml</td><td>Wheaton</td><td>0334125D</td><td></td></tr><tr><td>Symphny Horno de vacío</td><td>VWR</td><td>414004-580</td><td></td></tr><tr><td>Ovoalbúmina (OVA)</td><td>Worthington</td><td>3054</td><td></td></tr><tr><td>Bis-Tris Propano (BTP)</td><td>Fisher</td><td>BP2943</td><td></td></tr><tr><td>Q125 Sonicador (125&nbsp; W/20&nbsp; kHz)</td><td>Qsonica</td><td>Q125-110</td><td></td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>Fisher</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>2 kDa Polietilenglicol tiolado (PEG-SH)</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SH-2000-1g</td><td></td></tr><tr><td>Malvern ZetaSizer Nano ZSP&nbsp;</td><td>Malvern</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZetaSizer Cubetas</td><td>Malvern</td><td>DTS1070</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">2. Examen del drenaje de ganglios linfáticos de ICMV marcados con fluorescencia con microscopía confocal</fuerte></td></tr><tr><td>1,1'-Dioctadecil-3,3,3',3'-Tetrametilindodicarbocianina, sal de 4-clorobencenosulfonato (DID)</td><td>Life Technologies</td><td>D-7757</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555-succinimidil éster (AF555-NHS)</td><td>Life Technologies</td><td>A37571</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT medio de congelación&nbsp;</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Criomoldes de tejidos</td><td>VWR</td><td>25608-922</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">3. Monitorización de la expansión de los linfocitos T CD8+ específicos de antígeno que expresan luciferasa después de la vacunación con nanopartículas con imágenes de animales enteros</td></tr><tr><td>C57BL/6 ratones</td><td>Jackson</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Albino C57BL/6 ratones</td><td>Jackson</td><td>000058</td><td></td></tr><tr><td>OT-1 C57BL/6 ratones</td><td>Jackson</td><td></td> 003831 <td></td></tr><tr><td>70 &mu; m colador de nylon</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>EasySep&trade; Kit de aislamiento de células T CD8+ de ratón</td><td>StemCell</td><td>19853</td><td></td></tr><tr><td>IVIS&reg; sistema de imagen de animales enteros</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">4. Tinción de tetrámeros peptídicos-MHC de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) para el análisis por citometría de flujo de células T CD8+ específicas de antígenos</fuertes></td></tr><tr><td>K2EDTA tubos</td><td>BD</td><td>365974</td><td></td></tr><tr><td>ACK tampón de lisis</td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD16/32 Fc Block</td><td>Ebioscience</td><td>14-0161-86</td><td></td></tr><tr><td>H-2Kb OVA Tetrámero</td><td>MBL</td><td>TS-5001-1C</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD8-APC</td><td>BD</td><td>553031</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD44-FITC</td><td>BD</td><td>553133</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD62L-PECy7</td><td>Ebioscience</td><td>25-0621-82</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;,6- Diimino-2-fenilindol diclorhidrato (DAPI)</td><td>SIGMA</td><td>D8417-10MG</td><td></td></tr><tr><td>CyAn Citómetro de flujo</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Software</td><td>FlowJo</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imaging whole-animal y de citometría de flujo las técnicas para t cd8 + respuestas celulares análisis de antígeno-específicos después de nanopartículas vacunación

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Los adyuvantes tradicionales de las vacunas, como el alumbre, provocan respuestas subóptimas de las células T CD8+. Para abordar este importante desafío en el desarrollo de vacunas, se han diseñado varios sistemas de nanopartículas para imitar las características de los patógenos para mejorar la entrega de antígenos a los ganglios linfáticos que drenan y aumentar la absorción de antígenos por parte de las células presentadoras de antígenos, lo que lleva a nuevas formulaciones de vacunas optimizadas para la inducción de respuestas de células T CD8+ específicas de antígenos. En este artículo, describimos la síntesis de un sistema de nanopartículas "imitador de patógenos", denominadas vesículas multilaminares reticuladas entre capas (ICMV) que pueden servir como un portador de vacuna eficaz para la administración conjunta de antígenos de subunidades y agentes inmunoestimulantes y la obtención de potentes respuestas citotóxicas de linfocitos T CD8+ (CTL). Describimos métodos para caracterizar el tamaño hidrodinámico y la carga superficial de las nanopartículas de la vacuna con dispersión dinámica de luz y analizador de potencial zeta, y presentamos un procedimiento basado en microscopía confocal para analizar la entrega de antígenos mediada por nanopartículas a los ganglios linfáticos drenantes. Además, mostramos una nueva técnica de imagen de bioluminiscencia de animales enteros que utiliza la transferencia adoptiva de células T CD8+ específicas de antígeno que expresan luciferasa a ratones receptores, seguida de la vacunación con nanopartículas, que permite la interrogación no invasiva de los patrones de expansión y tráfico de CTL en tiempo real. También describimos la tinción de tetrámeros y el análisis citométrico de flujo de células mononucleares de sangre periférica para la cuantificación longitudinal de las respuestas de las células T endógenas en ratones vacunados con nanopartículas.

Los pasos implicados en la síntesis de ICMVs se ilustran en la Figura 1 6. En resumen, una película lipídica que contiene cualquier fármacos lipófilos o colorantes fluorescentes se hidrata en presencia de fármacos hidrófilos. Los cationes divalentes, tales como Ca 2+, se añaden a conducir fusión de liposomas aniónicos en vesículas multilamelares. Ditiol agente de reticulación, tales como la TDT, se añade a los lípidos de maleimida-funcionalizado &quot;grapas&quot; en apposing capas...

Describimos técnicas basadas en imágenes de animales enteros y citometría de flujo para monitorear la expansión de las células T CD8+ específicas de antígeno en respuesta a la inmunización con nanopartículas en un modelo murino de vacunación.

Imaging Whole-animal y de citometría de flujo Las técnicas para T CD8 + respuestas celulares Análisis de antígeno-específicos después de nanopartículas Vacunación

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

El objetivo general del siguiente experimento es sintetizar y caracterizar nanopartículas lipídicas para vacunas y evaluar su capacidad para inducir la expansión in vivo de linfocitos T citotóxicos específicos del antígeno. Esto se logra mediante la ingeniería de vesículas multilaminares interbicapa entrecruzadas, o ICMV, que incorporan simultáneamente antígeno y adyuvante, para la vacunación de ratones ingenuos. Transferidos adoptivamente con linfocitos T CD8 positivos específicos del antígeno que expresan luciferasa.En el segundo paso, se evalúa la expansión de las células T CD8 positivas específicas del antígeno mediante imágenes in vivo en todo el organismo. Las células mononucleares de la sangre periférica obtenidas de los animales inmunizados con ICMV se tiñen entonces con tetrámeros marcados con fluorocromos y se analizan mediante citometría de flujo para cuantificar la frecuencia de las células T CD8 positivas específicas del antígeno endógeno dentro del compartimento sistémico. Finalmente, la imagen bioluminiscente puede utilizarse para rastrear la expansión de los linfocitos T citotóxicos específicos del antígeno en respuesta a la vacunación con nanopartículas.Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas preliminares clave en el diseño de vacunas, como cuál es el grado de expansión de los linfocitos T citotóxicos y cómo estas células migran hacia diversos tejidos en respuesta a la vacunación con nanopartículas. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como el análisis de linfocitos T in situ tras la necropsia de tejidos, es que la imagenología in vivo de la respuesta de células T es no invasiva. Permite el monitoreo longitudinal del mismo animal. Comience mezclando una proporción molar uno a uno de DOPC y MPB en cloroformo, manteniendo una cantidad total de lípidos de 1,26 micromoles por lote en un vial de vidrio de 20 mililitros.A continuación, agregue el fármaco lipofílico a la solución lipídica en la concentración deseada y purgue la solución con gas nitrógeno seco adicional para eliminar completamente el disolvente orgánico. Coloque la muestra bajo vacío durante la noche; al día siguiente, agregue por la mañana 200 microlitros de BTP 10 milimolar que contenga el fármaco hidrosoluble de interés para hidratar la película lipídica; vortexee la solución resultante durante 10 segundos cada 10 minutos durante una hora a temperatura ambiente. Luego, transfiera el contenido a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros.A continuación, coloque el tubo en un baño de hielo con agua, sometiéndolo a sonicación continua utilizando la configuración de intensidad al 40 % en una punta de sonda de 125 vatios y 20 kilohercios. Después de cinco minutos, agregue cuatro microlitros de DTT de 150 milimolar al tubo, vortexee para mezclar y centrifugue brevemente la muestra en una microcentrífuga. Luego, mezcle 40 microlitros de cloruro de calcio de 200 milimolar en la muestra, seguido del entrecruzamiento de las capas lipídicas que contienen MPB con DTT a 37 grados Celsius durante una hora.Al final de la incubación, centrifugar la solución tres veces, añadiendo 200 microlitros de agua doblemente destilada durante la segunda y tercera centrifugación, para eliminar el cloruro de calcio remanente, el DTT no reaccionado y los materiales de carga no encapsulados del sobrenadante. Después de la última centrifugación, suspendemos los I CMVs en 100 microlitros de pegol recién preparado durante 30 minutos a 37 grados Celsius. Luego, lavar los vesículos dos veces más con agua doblemente destilada.Re-suspenda el pellet final en PBS y almacene las ICMV a cuatro grados Celsius. Para caracterizar las partículas, mezcle la suspensión fría de ICMV antes de diluir una pequeña alícuota de la muestra en un volumen total de un mililitro de agua doblemente destilada. Luego, coloque las ICMV en una celda para analizador de zeta y utilice un sistema de dispersión dinámica de luz y medición de potencial zeta para determinar el tamaño de partícula, el índice de polidispersidad y el potencial zeta de las muestras según las instrucciones del fabricante.Para aislar linfocitos T CD8 positivos específicos de ova que expresan luciferasa, primero recolecte los bazo de ratones transgénicos OT1 luciferasa. Coloque los tejidos en cinco mililitros de PBS frío con hielo y 2 %FBS y luego en una campana de cultivo celular.Utilice el émbolo de una jeringa de tres mililitros para triturar hasta tres bazo a la vez a través de un filtro de 70 micrones hacia un tubo cónico de 15 mililitros. Lave el émbolo y el filtro con PBS y FBS al 2%. Luego, ajuste el volumen total de la suspensión celular a 10 mililitros por bazo.Determine el número total de células y luego centrifugue las células. A continuación, utilice un kit comercial de selección negativa magnética para aislar las células esplénicas positivas para CD ocho según las instrucciones del fabricante. Luego lave los linfocitos T en PBS.Cuente las células e incube de dos a tres veces 10 a la quinta de las células en 20 microlitros de anticuerpo bloqueante de CD1632 de ratón. Después de 10 minutos, agregue 20 microlitros de anticuerpo anti-CD8a PC a las células durante 30 minutos y evalúe la pureza de la población de linfocitos T CD8 positivos aislados mediante perlas magnéticas por citometría de flujo. A continuación, transfiera adoptivamente de uno a 10 veces 10 a la quinta células T CD8 positivas OT1 luciferasa a ratones albinos C57BL/6 naíves afeitados en 200 microlitros de PBS mediante inyección intravenosa en la vena de la cola; 24 horas después, administre la vacuna al número apropiado de días posteriores a la vacunación.Administre a los animales 150 miligramos por kilogramo de Lucifer después de 10 minutos, adquiera la señal de bioluminiscencia durante cinco a 10 minutos con un sistema de imagenología de animal completo para visualizar las células T positivas para OT uno Lucifer CD ocho y determinar el número de células T CD ocho positivas específicas para el antígeno en el momento adecuado. Posterior a la vacunación, recoja aproximadamente 100 microlitros de sangre de los ratones vacunados mediante la técnica de sangrado submandibular en un tubo recubierto con EDTA potásico, invierta el tubo varias veces para prevenir la coagulación. Luego transfiera 100 microlitros de sangre a un tubo de microcentrífuga y agregue un mililitro de un tampón de lisis CK.Después de dos a tres minutos, centrifugue las células y elimine el sobrenadante. Lave los PBMC restantes en un mililitro de tampón fax y bloquee la unión no específica con CD 1632 tal como se acaba de demostrar. Después de 10 minutos, divida la suspensión celular en tubos fax redondos de cuatro mililitros y agregue 20 microlitros de la solución PE fecal tetramérica H2Kb según las especificaciones del fabricante.Después de 30 minutos en hielo, agregue 20 microlitros del cóctel de anticuerpos apropiado a cada muestra experimental y los cuatro anticuerpos de control fluorocuatro para cada tetrámero con etiqueta fluorocuatro o anticuerpo a cada muestra de control. Finalmente, tras otra incubación de 20 minutos, lave todas las muestras en tampón de fax, resuspenda los pellets en tampón de fax suplementado con DPI y analice las muestras mediante citometría de flujo. Los CMV cargados conjuntamente con antígenos de proteína fluorocuatro y colorantes lipofílicos fluorescentes permiten la visualización in vivo de la entrega de antígenos y nanopartículas. Por ejemplo, imágenes de microscopía confocal indican que el antígeno soluble administrado por vía subcutánea en la base de la cola alcanza los ganglios linfáticos drenantes dentro de las cuatro horas posteriores a la administración y se elimina a las 24 horas.En contraste, los CMV I sobrecargados se detectan primero en la periferia de los ganglios linfáticos drenantes a las 24 horas posteriores a la administración, con una acumulación continua que da como resultado un depósito considerable de CMV I ova dentro del tejido linfático drenante. Al cuarto día, de hecho, la imagen de bioluminiscencia de ratones C57BL/6 transferidos adoptivamente con células T CD8 positivas OT1 luciferasa el día de la vacunación demuestra un nivel mínimo de fondo de células T OT1 luciferasa al cuarto día posterior a la vacunación. Sin embargo, los ratones inmunizados con los CMV I ova MPI exhiben una señal de bioluminiscencia robusta dentro de los ganglios linfáticos inguinales drenantes.Los ratones vacunados con ova soluble, por otro lado, muestran una expansión mucho menor de las células T CD8 positivas OT-I Lucifer en los ganglios linfáticos drenantes. Además, los ratones inmunizados con ova soluble y MPLA, sin ninguna transferencia adoptiva de células T específicas para el antígeno, no exhiben una expansión apreciable de células T CD8 positivas específicas para ova, tal como lo indica el monitoreo semanal de las células mononucleares periféricas (pbmc). La vacunación con ICMV, sin embargo, provoca una respuesta endógena de células T CD8 positivas significativamente más fuerte, alcanzando un pico del 28 % de las células T positivas para el tetrámero sin fecal dentro del compartimento de células T CD8 positivas entre las pbmc al día 41. Después de ver este video, usted debería tener una buena comprensión de cómo sintetizar nanopartículas basadas en lípidos, realizar inmunizaciones y visualizar y cuantificar la expansión de células T citotóxicas in vivo.Estos métodos pueden modificarse aún más para revelar información adicional sobre la respuesta CTL. Por ejemplo, el ensayo de tinción teer puede complementarse con marcadores adicionales como CD127, BCL2 y KLRG1 para evaluar el fenotipo de memoria de las células.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

En este artículo se describe un método que utiliza multi-espectral citometría de flujo de imágenes para cuantificar la internalización de nanopartículas polianhídrido o bacterias de las células RAW 264.7.

El análisis de la internalización celular de nanopartículas y bacterias en un Multi-espectral de Citometría de Flujo de imágenes

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Enriquecimiento y expansión basados en nanopartículas de linfocitos T CD8+ específicos de antígenos

Este video muestra un ensayo para analizar células T CD8+ específicas de antígeno en diferentes etapas del ciclo celular. Las células viables marcadas con fluorescencia se seleccionan mediante citometría de flujo, y las células en las diferentes etapas del ciclo celular se identifican por su contenido de ADN utilizando anticuerpos contra la proteína nuclear asociada a la proliferación celular y una tinción de ácido nucleico.

Un ensayo para el análisis del ciclo celular de células T CD8+ específicas de antígenos

El video muestra un método inmunológico para monitorear in vivo la producción de linfocitos T citotóxicos o CTL inducidos por adyuvantes. A un ratón se le inyectan previamente linfocitos T CD8+ de donantes modificados genéticamente, teñidos con colorante proliferativo. La inyección subcutánea de ovoalbúmina con adyuvantes genera linfocitos T CD8+ citotóxicos que se identifican después de la cosecha mediante inmunotinción y citometría de flujo.

Una técnica inmunológica para monitorizar la generación de linfocitos T citotóxicos mediados por adyuvantes

Análisis de la interacción de nanopartículas con subpoblaciones definidas de células inmunes por citometría de flujo.

La detección de nanopartículas fluorescentes Interacciones con inmunodeficiencia primaria subpoblaciones celulares por citometría de flujo

Este protocolo describe los pasos necesarios para realizar la validación ex vivo de experimentos de imágenes de xenoinjertos de fluorescencia de infrarrojo cercano in vivo en ratones utilizando nanocuerpos marcados con fluoróforos y anticuerpos convencionales.

Validación de nanocuerpo y basados ​​en anticuerpos<em&gt; En Vivo</em&gt; Experimentos tumor de xenoinjerto NIRF-de formación de imágenes en ratones utilizando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Citometría de flujo y microscopía

Aquí, describimos un completo flujo de trabajo para el análisis cualitativo y cuantitativo de la sinapsis inmunes entre las células de T humanas primarias y células presentadoras de antígeno. El método se basa en imágenes por citometría de flujo, que permite la adquisición y evaluación de varias imágenes de miles de células en un período relativamente corto de tiempo.

Análisis cualitativo y cuantitativo de la sinapsis inmune en el sistema humano utilizando imágenes de citometría de flujo

Linfocitos T antígeno específicos son difíciles de caracterizar o utilizar en terapias debido a su extremadamente baja frecuencia. Aquí proporcionamos un protocolo para desarrollar una partícula magnética que puede atar a las células T antígeno específicas para enriquecer estas células y luego ampliarlas varias centenas para caracterización y tratamiento.

Enriquecer y ampliar las células T específicas de antígeno raro con nanopartículas magnéticas

Aquí, presentamos un protocolo para el ex vivo cualitativamente específica de antígeno CD8+ T las células. Análisis es posible con suspensiones de la célula de órganos o de pequeñas cantidades de sangre. Una amplia gama de estudios requieren el análisis de las respuestas de la célula de T citotóxica (vacunación y estudios de inmunoterapia del cáncer).

Cuantificación simultánea de CD8 anti-vector y Anti-transgénicos-específico+ T células vía MHC Tetramer tinción después de la vacunación con un Vector Viral

La expansión clonal es una característica clave de la respuesta de las células T específicas del antígeno. Sin embargo, el ciclo celular de las células T que responden a los antígenos ha sido poco investigado, en parte debido a limitaciones técnicas. Describimos un método citométrico de flujo para analizar células T CD8 específicas de antígeno en expansión clonal en bazo y ganglios linfáticos de ratones vacunados.

Un ensayo de citometría de flujo basado en ADN/Ki67 para el análisis del ciclo celular de células T CD8 específicas de antígeno en ratones vacunados

El protocolo presenta métodos detallados para evaluar si el adyuvante de bioemulsión ofiopogonina D promueve respuestas inmunes celulares efectivas.

In vitro Evaluación de la actividad celular del adyuvante de la vacuna de nanoemulsión Ophiopogonin D

Aprende a sintetizar nanopartículas lipídicas vacunales y evaluar la expansión de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno en ratones mediante imágenes de bioluminiscencia y citometría de flujo.

Imaging Whole-animal y de citometría de flujo Las técnicas para T CD8 + respuestas celulares Análisis de antígeno-específicos después de nanopartículas Vacunación (Video) | JoVE Journal

Imaging Whole-animal y de citometría de flujo Las técnicas para T CD8 + respuestas celulares Análisis de antígeno-específicos después de nanopartículas Vacunación

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