Name: Una técnica de enriquecimiento optimizado para el aislamiento de Arthrobacter Bacteriófago Especies de Aísla Muestra de Suelo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 24 s
Description: Aprenda un protocolo de enriquecimiento optimizado para aislar bacteriófagos de Arthrobacter a partir de muestras de suelo. Este método permite obtener resultados rápidos y reproducibles para la investigación en virología y terapia fágica.

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Los fondos para el desarrollo de este protocolo fue proporcionada por el Consorcio Sureste de Pensilvania para la Educación Superior y el Departamento de Ciencias Cabrini Colegio. Financiamiento y apoyo adicional vino de Arcadia University y la Universidad Immaculata. Agradecemos especialmente a la doctora Karen Snetselaar en la Universidad de San José para tomar amablemente las imágenes de microscopía electrónica de nuestros fagos aislados. Apoyo adicional fue proporcionado por los cazadores del Instituto Médico Howard Hughes de la Alianza de Educación Científica de fagos que subieron Genómica y programa (SEA-FAGOS) Evolutiva Ciencia.

1. Preparación de las células para el aislamiento de fagos Arthobacter <ul><li> Arthrobacter Cultura sp. KY3901 colonias estrías en una Luria Bertaini (LB) placa de agar se incubaron a 30 ° C durante 2-3 días. Escoja una colonia y utilizar un asa estéril para añadirlo a 250 ml de caldo LB en un matraz de cultivo desconcertado e incubar en una incubadora de agitación a 225 rpm a 30 ° C. </li><li> Deje aproximadamente 24 h de crecimiento para obtener células en fase exponencial finales / temprana estacionarias para experimentos de infección del fago. Supervisar el estado de crecimiento bacteriano de cerca para evitar que las células entren en el medio y tardío estado de crecimiento estacionario. NOTA: El crecimiento celular debe consistir en una densidad óptica OD 600 entre 0,5-aproximadamente 0.7 para los procedimientos de aislamiento y purificación de fagos / pasos descritos a continuación. </li></ul> 2. Recopilación de fagos de muestras de suelo <ol><li> Reúna 200-400 g de suelo desde la ubicación deseada. Nota: Puesto que las bacterias en la Arthrobagénero CTER son bacterias comunes del suelo y que los fagos que infectan a ellos se pueden encontrar en y son omnipresentes en la mayoría de los tipos de suelo. </li><li> Añadir al menos 400 ml de tampón de fago (PB) [NaCl 68 mM, 10 mM MgSO 4, 10 mM Tris-CL (pH 7,5)] para el suelo y mezclar en un matraz lo suficientemente grande como para que al menos 200 ml de PB es en el sobrenadante y es capaz de ser extraído. </li><li> Mezcle por agitación o agitación suave hasta que se suspendió el suelo y permitir que el sedimento del suelo se asiente, típicamente 30 min. </li><li> Pase el &quot;extracto de tierra&quot; a través de papel de filtro por filtración por gravedad para eliminar los restos de sedimentos del suelo. </li><li> Añadir polvo de LB y mezclar para obtener una solución al 2% (4 g LB en polvo en 200 ml de extracto de suelo). </li><li> Pasar la solución a través de un filtro de 0,22 micras por filtración a vacío para obtener un filtrado estéril. Si es posible, continúe con el paso 2.7 inmediatamente. Si es necesario, la tienda filtra muestras a 4 ° C durante un máximo de una semana antes de continuar, sin embargo, el número de partículas de fagos viablesse reducirá. </li><li> Alícuota de múltiples porciones de 50 ml de la mezcla de extracto de LB / suelo esterilizada por filtración en individuales 250 ml esterilizados agitando los matraces de cultivo utilizando técnicas asépticas con deflectores. Añadir M CaCl solución estéril 2,0 2 a las concentraciones finales deseadas (0-50 mm) desde diferentes fagos Arthrobacter crecen óptimamente en diferentes CaCl 2 condiciones. NOTA: Nos encontramos con que la mayoría de los fagos Arthrobacter identificados por nosotros están dentro del rango de 1 mM-2,5 mM CaCl2. Sin embargo, varios de los fagos aislados crecieron por nosotros exclusivamente a 0 mM CaCl 2 .o a muy altas concentraciones de CaCl 2. Proceda inmediatamente al paso 3.1. </li></ol> Aislamiento 3. Fago <ol><li> Añadir 1 a 2,5 ml de cultivo de bacterias estacionaria tardía fase exponencial / temprano para cada uno de los matraces. Para una DO 600 0,5-0,7, utilice 1 ml de células. Para un OD 600 mayor que un diámetro exterior de 0,7 utilizar 2,5 ml delas células. NOTA: Las células en fase de crecimiento exponencial típicamente producen más fagos y los títulos más altos que las células en fase estacionaria del crecimiento. </li><li> Agite matraces a 250 rpm a 30 ° C durante aproximadamente 24 horas en un incubador con agitación. </li><li> Después de un período de incubación de 24 hr eliminar matraces de enriquecimiento de la incubadora de agitación y diluir las muestras de enriquecimiento de diez veces en tampón de fago. </li><li> Establecer tubos de cultivo con 0,5 ml de cultivo de bacterias estacionaria tardía fase exponencial / temprano y añadir diversas cantidades del cultivo de enriquecimiento (5 l a 500 l de una dilución 10 -1 en PB) a los tubos de cultivo. NOTA: Es recomendable probar una amplia gama de concentraciones ya que cada muestra de suelo genera diferentes títulos de fagos después del enriquecimiento. </li><li> Añadir CaCl 2 a tubos de cultivo para hacer una concentración final igual a la concentración presente en el matraz de enriquecimiento inicial. Utilice una gama de diferentes concentraciones de CaCl 2 para seleccionar para muchos fagos wi-ésima variable CaCl 2 dependencias. NOTA: La mayoría de los fagos serán aislados dentro de la gama de CaCl2 de 1 a 2,5 mM pero hay fagos aislados más óptima en cualquier lugar 0-50 mM CaCl 2 concentraciones. Debido a esto lo mejor es comprobar una serie de CaCl 2 concentraciones de maximizar el número de fagos únicos Arthrobacter aisladas. </li><li> Mezclar 4,5 ml de agar superior LB en el tubo de cultivo y verter la mezcla sobre una placa de agar LB. Agitar suavemente para distribuir a través de la placa de manera uniforme y permitir agar superior solidificar durante aproximadamente 15 min. NOTA: Top agar se puede preparar en grandes lotes (250 ml) y agar superior adicional se puede almacenar a temperatura ambiente y se reutiliza para experimentos posteriores durante al menos dos semanas. Aunque existen diferentes fórmulas utilizadas para hacer subir Agar, hacemos subir Agar utilizando 7 g / l de agar mezclado con LB. Top agar Colocar en un baño de agua a 60 ° C para conservar el estado líquido durante el curso de un experimento. </li><li> Invertir tél placa e incubar a temperatura deseada (temperatura a 30 ° C) O / N a 48 h. Vary estas condiciones para optimizar los fagos presentes. La mayoría fagos aislados provienen de placas se incubaron a 30 ° C en 1-2,5 mM CaCl concentración 2 después de un período de incubación de 24 horas. </li></ol> 4. Los fagos Purificación <ol><li> Después de una verificación de incubación de 24 h para la formación de placa en placas. Continuar la incubación durante un máximo de 72 horas si no hay placas son evidentes o para determinar si van a aparecer placas adicionales. Si es necesario, las placas, almacenarlas con placas putativos para hasta una semana a 4 ° C antes de continuar. NOTA: No es raro encontrar una variedad de diferentes morfologías de placa en un plato. Encontrar placas después de 3 días de incubación es posible pero poco frecuente. </li><li> Purificar fagos deseados de placas claramente aislados utilizando el método de la placa racha. Toque una placa con un palo de madera estéril. Racha de la placa mediante la ejecución de un palo de madera a través de una llama, allowing el palo para enfriar brevemente, y luego frotando el palo en la placa de agar en el movimiento suave como se muestra en la Figura 1. Repita este usando un palo limpio para cada pasada. </li><li> Como alternativa, utilice el ensayo de valoración placa tradicional para aislar placas de fagos individuales. El ensayo de valoración de placa requiere el uso de más reactivos tales como agar LB y agar superior LB y materiales tales como placas de Petri para el aislamiento de placas de fagos. Hemos tenido un gran éxito con el método de la placa racha pero es técnicamente más fáciles de aislar placas individuales utilizando el ensayo de valoración de la placa. </li><li> Una vez que la placa de agar LB se raya al menos tres veces, marcar el área con la concentración más baja de partículas de fago putativo y aplique suavemente 0,5 ml de Arthrobacter y 4,5 ml de agar superior LB fundido (que contiene la misma concentración de cloruro de calcio como la placa matriz ) y deje que se distribuye uniformemente en toda la placa. </li><li> Invierta la placa e incubar O / N. Repita la placa rachase aísla técnica para al menos tres iteraciones para garantizar una especie de fagos puros. Placas se almacenan a 4 ° C durante hasta una semana, según sea necesario entre rayas y sin pérdida significativa de la viabilidad del fago. </li><li> Una vez que las placas deseados se han cultivado y aislado en la placa racha final, tocar un pozo aislado placa con una punta de la micropipeta y volver a suspender en 100 l PB. En serie diluir esta solución 10 0 a la dilución 10 -8 haciendo pasar 20 l de la muestra en 180 l de PB fresco. </li><li> Añadir 10 l de cada dilución a 0,5 ml de Arthrobacter crecido en un tubo de cultivo de 5 a 10 min a TA y la placa mediante la mezcla de las bacterias infectadas con 4,5 ml de agar superior LB fundido que contiene la misma concentración de CaCl 2 usado para aislar el fago de la muestra original del suelo. Guarde todas las diluciones hechas a 4 ° C hasta el día siguiente. </li><li> Determinar la dilución en serie fago necesaria para hacer un patrón web utilizando el título de la placa tradicionaldecir. El propósito del ensayo es el título de la placa para determinar el título del fago se necesita para obtener una placa patrón de web. Identificar un patrón placa web como la mayoría desprovisto de bacterias, pero que contengan restos de bacterias que aún no han sido lisadas por los fagos. Añadir 5 ml de la cultura Arthrobacter estacionaria exponencial / principios del XX a un matraz de cultivo de 50 ml estéril. <ol><li> Añadir 100 l de la dilución (que dio un patrón de web a la cultura Arthrobacter) en el matraz de cultivo y permitir que los fagos para infectar las células de las bacterias de 5 a 10 min a TA. Mezclar con agar superior LB fundido que contiene la misma concentración de CaCl 2 tal como se utiliza para identificar inicialmente el fago y la placa 5 ml de esta mezcla sobre 10 placas de LB fresco. Dejar solidificar e incubar las placas invertidas a 30 ° C. </li></ol></li><li> Al día siguiente, inundar las placas modelo web con 5 ml de PB y tienda de O / N a 4 ° C o 4 horas a temperatura ambiente. </li><li> Filtrar el lisado de fago a través de un filtro de jeringa de 0,22 micrasy almacenar a 4 ° C. Utilice esta fago final para experimentos adicionales, tales como imágenes de microscopía electrónica de partículas de fago, fago aislamiento de ADN genómico para el análisis con enzimas de restricción y secuenciación de ADN genómico utilizando procedimientos estándar. Para el almacenamiento a largo plazo de la población de fagos, añadir una cantidad igual del lisado del fago a glicerol estéril en frascos pequeños para la acción de archivado a -80 ° C. NOTA: Para los que no experimentado con estas técnicas de fagos, un gran recurso es el sitio web en línea www.phagesdb.org accesible. </li></ol>

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 <a target="_blank" href="http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/3020-luria-broth-lb-and-luria-agar-la-media-and-their-uses-escherichia-coli">http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/3020-luria-broth-lb-and-luria-agar-la-media-and-their-uses-escherichia-coli</a> (2013).</li>
</ol>

Autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

A pesar de muchos intentos anteriores para aislar fagos capaces de infectar ordenadores Arthrobacter, tuvimos poco éxito utilizando procedimientos de enriquecimiento estándar. El método generalizado de enriquecimiento bacteriana desarrollado y adaptado por van Twest y Kropinski 10 para enriquecer fagos a partir de muestras ambientales sigue siendo la base para la mayoría de procedimientos de enriquecimiento. La evidencia de estudios previos sugieren que los métodos de siembra directa han producido pl...

La ubicuidad de las especies Arthrobacter en entornos de suelo ofrece un gran número y diversidad de fagos capaces de ser aislado a partir de esta especie de bacteria huésped. Miembros bacterianas de la familia Acintobacteriaceae son más notables por sus vías catabólicas de degradar compuestos recalcitrantes como la atrazina y varios otros pesticidas y herbicidas 1,2,3. Aunque la mayoría de investigaciones se ha hecho uso de cepas ambientales de Arthrobacter, aislados clínicos de este género se encuentran en la sangre, la orina, los ojos y muchas otras fuentes humanas que muestran toda la heterogeneidad filogenético 4. Si bien no es un lugar amplio cuerpo de investigación sobre bacterias Arthrobacter, sólo unos pocos estudios informan sobre los fagos capaces de infectar a los miembros de este diverso género. Curiosamente, sin embargo, el trabajo realizado previamente en Arthrobacter fagos toques sobre varios temas clave diferenciadas, como la tipificación de suelo &lt;em&gt; especies Arthrobacter 5, usos industriales con el fin de reducir la espuma perjudicial en las plantas de tratamiento de lodos activados 6, y el trabajo destacando recombinación específica de sitio y los genes de la integrasa 7. Varios protocolos técnica de enriquecimiento se han empleado para generar pura fago aísla en especies de Arthrobacter. Los primeros procedimientos incluyen incubaciones de suelo con agentes tóxicos adicionales como sales de nicotina durante períodos de más de un año 8 dando lugar a los fagos capaces de infectar sólo A. globiformis. Los estudios realizados utilizando suelo percola con productos orgánicos lábiles parecían producir fagos detectables a través de técnicas de ensayo de placa, omitiendo largos períodos de incubación 8. Curiosamente, sin embargo, se utilizó una técnica parecida a la siembra directa en el pasado dando lugar a varios fagos mientras que todavía tiene una baja tasa de éxito particular por los investigadores 5, citando estudios anteriores con bajas tasas de éxito <sarriba&gt; 8. En general, las técnicas de aislamiento utilizados en el pasado eran destaca por tener poca eficacia en la práctica a pesar de género Arthrobacter que representan el suelo aeróbico más común aislar en la naturaleza 4,9,, Van Twest y Kropinski 10 presentes métodos de enriquecimiento para el aislamiento de fagos a partir de agua y el suelo adaptado de técnicas anteriores utilizadas para enriquecer aislamientos bacterianos ambientales, pero estas técnicas de enriquecimiento resultó ineficaz en el aislamiento de los fagos Arthrobacter. El propósito del método descrito aquí es mostrar &quot;prueba de concepto&quot; que los métodos de enriquecimiento primeros pueden ser adaptados para aislar de manera consistente y eficaz fagos Arthrobacter, la superación de dificultades técnicas anteriores asociadas con el aislamiento de fagos de este género bacteriano.

<table><tbody><tr><td>LB Caldo en polvo</td><td>Fisher</td><td>BP9722-2</td><td>Lo mejor es pedirlos a granel.</td></tr><tr><td>Agar granulado</td><td>Fisher</td><td>BP1423-2</td><td>Lo mejor es pedirlos a granel.</td></tr><tr><td>Filtros de jeringa de 0,22 mmm</td><td>Fisher</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>Filtros Buchner de 0,22 mmm</td><td>Fisher</td><td>430320</td> Se <td>pueden obtener más de 50 ml de líquido cambiando cuidadosamente el tubo receptor.</td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>pipetas de 5 ml individuales</td><td>Fisher</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr> tubos <tr><td>cónicos de 50 ml</td><td>Fisher</td><td>76002844</td><td></td></tr><tr><td>tubos cónicos de 15 ml</td><td>Fisher</td><td>76002845</td><td></td></tr><tr><td>10 ml pipetas individuales</td><td>Fisher</td><td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>pipetas de 25 ml individuales</td><td>Fisher</td><td>13-676-10K</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro cualitativo Whatman</td><td>Fisher</td><td>1001-824</td><td></td></tr></tbody></table>

una técnica de enriquecimiento optimizado para el aislamiento de<em&gt; arthrobacter</em&gt; bacteriófago especies de aísla muestra de suelo

An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates

El aislamiento de bacteriófagos a partir de muestras ambientales se ha realizado durante décadas utilizando los principios establecidos por los pioneros de la microbiología. El aislamiento de los fagos que infectan a los huéspedes de Arthrobacter ha sido limitado, tal vez debido a la baja tasa de éxito de muchas técnicas de aislamiento anteriores, lo que ha dado lugar a un grupo infrarrepresentado de fagos de Arthrobacter disponibles para su estudio. La técnica de enriquecimiento descrita aquí, a diferencia de muchas otras, utiliza un extracto filtrado libre de bacterias contaminantes como base para el crecimiento de la bacteria indicadora, Arthrobactersp. KY3901, específicamente. Al eliminar primero las bacterias del suelo, los fagos objetivo no se ven obstaculizados por la competencia con las bacterias nativas del suelo presentes en las muestras iniciales de suelo. Este método de enriquecimiento ha dado como resultado docenas de fagos únicos de varios tipos de suelo diferentes e incluso ha producido diferentes tipos de fagos a partir del mismo aislado de muestra de suelo enriquecido. El uso de este procedimiento puede ampliarse a la mayoría de los medios aeróbicos ricos en nutrientes para el aislamiento de fagos en una gran diversidad de bacterias huésped interesantes.

Para demostrar la reproducibilidad de la técnica de enriquecimiento mejorado para fagos Arthrobacter, se utilizaron 30 muestras de suelo diferentes en diferentes momentos y lugares durante la primavera y el verano de 2014. De estos 30 muestras de suelo fagos Arthrobacter únicas se obtuvieron a partir de 22 muestras de suelo recogidas mediante este enriquecimiento procedimiento. El procedimiento de enriquecimiento estándar produjo fagos únicos de 3 de las mismas muestras de suelo. Las muestras de enriqu...

Presentamos un protocolo de enriquecimiento para el aislamiento de bacteriófagos que infectan bacterias del género Arthrobacter. Este protocolo de enriquecimiento produce resultados rápidos y reproducibles para el aislamiento y amplificación de fagos de Arthrobacter a partir de aislados del suelo.

Una técnica de enriquecimiento optimizado para el aislamiento de<em&gt; Arthrobacter</em&gt; Bacteriófago Especies de Aísla Muestra de Suelo

Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar fagos de bacterias Arthrobacter a partir de muestras de suelo mediante un protocolo de enriquecimiento. Esto se logra primero recolectando muestras de suelo y aislado partículas de fago viables de microorganismos del suelo contaminantes. El segundo paso consiste en infectar células bacterianas hospederas de Arthrobacter con las partículas de fago aisladas.A continuación, las células bacterianas infectadas se siembran en placas con agar para identificar los fagos mediante la formación de placas. El paso final consiste en purificar los fagos deseados a partir de placas claramente aisladas utilizando el método de siembra por estrías. En última instancia, esta técnica de enriquecimiento está optimizada para el aislamiento relativamente sencillo de fagos de Arthrobacter a partir de la especie Arthrobacter KY 3 9 0 1.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos de enriquecimiento existentes es la adición de una muestra de suelo finamente filtrada a un cultivo puro de bacterias hospederas para evitar el crecimiento de bacterias competidoras. Aunque este método ha demostrado ser eficaz para el aislamiento de fagos de Arthrobacter, debería ser aplicable para el aislamiento de fagos de otros hospedadores bacterianos. Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando supimos que otros investigadores tenían dificultades para encontrar fagos de Arthrobacter.Con técnicas tradicionales de enriquecimiento. Mis estudiantes demostrarán las técnicas utilizadas para aislar exitosamente fagos de Arthrobacter. Las células de Arthrobacter se cultivan a partir de colonias rayadas en una placa de agar LB, incubadas a 30 grados Celsius durante dos o tres días.Utilice un asa estéril para seleccionar una colonia y añádala a 50 mililitros de caldo LB. En un matraz con aletas, incube el matraz en un incubador agitador a 225 RPM a 30 grados Celsius durante aproximadamente 24 horas para obtener células en fase exponencial o en fase estacionaria temprana para experimentos de infección con fagos.Monitore cuidadosamente el estado del crecimiento bacteriano para evitar que las células entren en la fase estacionaria media a tardía. El valor de DO 600 ideal para el aislamiento de fagos se encuentra entre 0,5 y 0,7. Dado que las bacterias del género Arthrobacter son bacterias del suelo comunes, ellas y los fagos que las infectan pueden encontrarse en la mayoría de los tipos de suelo.Recolecte de 200 a 400 gramos de suelo del lugar deseado. Añada al menos 400 mililitros de tampón para fagos al suelo en un vaso de precipitados suficientemente grande para que al menos 200 mililitros de tampón para fagos queden en el sobrenadante y puedan extraerse, mezclando suavemente mediante agitación o agitado en círculos hasta que el suelo quede suspendido, y deje que el sedimento del suelo se sedimente generalmente durante 30 minutos. A continuación, elimine los restos de sedimento del suelo pasando el extracto de suelo a través de un papel filtro mediante filtración al vacío.Agregue cuatro gramos de polvo de LB a 200 mililitros del extracto de suelo filtrado y mezcle para obtener una solución al 2%. Pase la solución a través de un filtro de 0,22 micrones mediante filtración al vacío para obtener un filtrado estéril. Si es posible, continúe inmediatamente con el siguiente paso.No obstante, si es necesario, las muestras filtradas pueden almacenarse a cuatro grados Celsius durante hasta una semana antes de continuar. Sin embargo, el número de partículas de fago viables se reducirá utilizando técnicas asépticas para aliquotar múltiples porciones de 50 mililitros de la mezcla de extracto de suelo LB filtrado estéril en frascos individuales de 250 mililitros. Añada solución estéril de cloruro de calcio 2,0 M a los frascos de cultivo estériles con placas deflectoras para alcanzar las concentraciones finales deseadas.Dado que diferentes fagos de Arthrobacter crecen de forma óptima bajo distintas condiciones de cloruro de calcio, inicie este procedimiento añadiendo de uno a 2,5 mililitros de cultivo bacteriano en fase exponencial tardía o fase estacionaria temprana a cada uno de los matraces que contienen la mezcla de extracto de suelo LB esterilizada por filtración. Si la DO 600 del cultivo está entre 0,5 y 0,7, utilice un mililitro. Si la DO 600 es superior a 0,7, utilice 2,5 mililitros.Agite los frascos a 250 RPM a 30 grados Celsius durante aproximadamente 24 horas en un incubador con agitación. Después del período de incubación de 24 horas, retire los frascos de enriquecimiento del incubador con agitación. Diluya las muestras de enriquecimiento diez veces en tampón de fagos.Prepare tubos de cultivo con 0,5 mililitros de cultivo bacteriano en fase exponencial tardía o estacionaria temprana. Añada diversas cantidades, desde cinco microlitros hasta 500 microlitros, del cultivo de enriquecimiento diluido a los tubos de cultivo.Añada cloruro de calcio a los tubos de cultivo para obtener una concentración final en cinco mililitros igual a la concentración presente en el matraz original de enriquecimiento. Utilice un rango de diferentes concentraciones de cloruro de calcio para seleccionar muchos fagos con distintas dependencias del cloruro de calcio. Añada 4,5 mililitros de agar LB superior a cada tubo de cultivo y vierta la mezcla sobre una placa de agar LB.Agite suavemente para distribuir de manera uniforme sobre la placa y deje que el agar superior se solidifique durante aproximadamente 15 minutos. Invierta las placas e incube a 30 grados Celsius durante la noche hasta 48 horas. Varíe los tiempos de incubación para optimizar según los fagos presentes; después de una incubación de 24 horas, revise la formación de placas en las placas.La mayoría de los fagos aislados provienen de placas incubadas a 30 grados Celsius con una concentración de cloruro de calcio de uno a 2,5 milimolar tras un período de incubación de 24 horas, purificando los fagos deseados a partir de placas claramente aisladas utilizando un palillo de madera como la parte más difícil de este procedimiento. Se requiere experiencia técnica para extender suavemente las placas sobre la placa de agar para producir una placa de estría uniforme. Esterilice un palillo de madera pasándolo por una llama y dejándolo enfriar.Toque brevemente una placa con el palillo de madera estéril y frote el palillo sobre la placa de agar en un movimiento suave como se muestra. Repita este procedimiento utilizando un palillo limpio para cada paso. Una vez que la placa de agar LB haya sido rayada al menos tres veces, marque el área con la menor concentración de partículas putativas de fagos.Aplique suavemente 0,5 mililitros de arthrobacter y 4,5 mililitros de agar LB superior fundido al área marcada, y deje que se extienda uniformemente por la placa. Deje que el agar superior solidifique durante al menos una hora; una vez que la placa haya solidificado, inviértala e incúbela durante la noche. Repita la técnica de estría de placas al menos tres iteraciones para asegurar el aislamiento de una especie pura de fago.Las placas pueden almacenarse a cuatro grados Celsius durante hasta una semana según sea necesario entre siembras, sin pérdida significativa de viabilidad de los fagos. Una vez que se hayan desarrollado y aislado las placas deseadas en la placa final de siembra, toque una placa bien aislada con la punta de una pipeta micrométrica y resuspenda en 100 microlitros de tampón para fagos. Diluya seriamente esta solución hasta la dilución 10 a la menos ocho, transfiriendo 20 microlitros de la muestra a 180 microlitros de tampón fresco para fagos. Añada 10 microlitros de cada dilución a 0,5 mililitros de *Arthrobacter* cultivado en un tubo de ensayo durante cinco a 10 minutos a temperatura ambiente.Luego, siembre mezclando las bacterias infectadas con 4,5 mililitros de agar superior LB fundido que contenga la misma concentración de cloruro de calcio utilizada para aislar el fago de la muestra original de suelo. Incube las placas durante la noche. Guarde todas las diluciones realizadas a cuatro grados Celsius hasta el día siguiente.Determine la dilución de fagos en caldo necesaria para formar un patrón de red mediante el ensayo tradicional de titulación por placas. Identifique una placa con patrón de red como aquella que carece principalmente de bacterias, pero que contiene restos de bacterias que aún no han sido lisadas por los fagos. Añada cinco mililitros de cultivo de Arthrobacter en fase exponencial tardía o estacionaria temprana a un matraz de cultivo estéril de 50 mililitros.Añada 100 microlitros de la dilución que produjo un patrón de red al cultivo de arthrobacter y permita que los fagos infecten las células bacterianas durante cinco a 10 minutos. A temperatura ambiente, añada al frasco agar lb superior fundido que contenga la misma concentración de cloruro de calcio utilizada inicialmente para identificar la placa de fagos. Coloque cinco mililitros de esta mezcla sobre cada una de 10 placas frescas de LB.Después de permitir que el agar superior se solidifique, invierta e incube las placas a 30 grados Celsius durante la noche al día siguiente, inunde las placas con el patrón de red con cinco mililitros de tampón de fagos por placa y almacénelas durante la noche a cuatro grados Celsius. Filtre el lisado de fagos a través de un filtro de jeringa de 0,22 micrones. Almacene este stock final de fagos a cuatro grados Celsius para conservación a largo plazo.Añada una cantidad igual del lisado de fagos a glicerol estéril en viales pequeños para el archivo de stocks a menos 80 grados Celsius. En el procedimiento de enriquecimiento demostrado en este video, el método de rayado de placas para aislar poblaciones puras de fagos después del enriquecimiento inicial y siembra en agar LB, se muestran resultados representativos del aislamiento de placas para el fago DI a temperatura ambiente, 30 grados Celsius y 37 grados Celsius. Los círculos rojos en dos de las placas delimitan placas claramente aisladas. El fago Dylan produce placas similares a tres temperaturas diferentes.Alternativamente, puede utilizarse un ensayo tradicional de titulación por placas para aislar un aislado de fago puro. Este ensayo se utilizó aquí para determinar empíricamente los números de título de fago y el número de unidades formadoras de placas necesarias para formar un patrón de red en una placa. Se muestra un conjunto de diluciones seriadas para el fago banana, junto con un ejemplo de cómo debería verse un buen patrón de red.Estas son imágenes micrográficas electrónicas de 20 fagos de Arthrobacter aislados mediante la técnica de enriquecimiento. De los 25 fagos aislados actualmente, 23 de ellos son virus cifo con colas bastante largas. Dos de los fagos aislados son virus mio que contienen diámetros de cabeza similares en longitud a la de sus colas.Una vez dominada, la placa de enriquecimiento debería permitir el aislamiento exitoso de fagos de Arthrobacter a partir de una variedad de muestras de suelo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo purificar fagos mediante el método de rayado por pintado a partir de una muestra de suelo ambiental.

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Investigación

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Aislamiento y enriquecimiento de vesículas extracelulares derivadas de la membrana externa de bacterias

Fuente: Cross, T., et al., Técnica de enriquecimiento optimizada para el aislamiento de especies de bacteriófagos de artrobacter a partir de muestras de suelo. J. Vis. Exp.(2015)Este vídeo muestra la preparación de un cultivo bacteriano para la producción de bacteriófagos. Cubre los pasos de inoculación de una bacteria del suelo en un matraz con concierto, promoviendo un crecimiento uniforme mediante aireación y agitación, y monitorizando la densidad celular mediante mediciones ópticas de...

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Source: Cross, T., et al. An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the isolation of Arthrobacter bacteriophages from a soil sample using enrichment and plaque assay techniques. It highlights the infection, amplification, and visualization of phages as clear lysis zones formed on a bacterial lawn.

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