Una técnica de enriquecimiento optimizado para el aislamiento de Arthrobacter Bacteriófago Especies de Aísla Muestra de Suelo

El objetivo general de este procedimiento es aislar las fases de la bacteria arthrobacter de las muestras de suelo utilizando un protocolo de enriquecimiento. Esto se logra recolectando primero muestras de suelo y aislando las partículas de fagos viables de los microorganismos contaminantes del suelo. El segundo paso es infectar las células bacterianas del huésped arthrobacter con las partículas de fagos aisladas.

A continuación, las células bacterianas infectadas se colocan en placas de barrena para identificar los fagos, como lo demuestra la formación de placa. El paso final es purificar los fagos deseados a partir de placas claramente aisladas utilizando el método de la placa de rayas. En última instancia, esta técnica de enriquecimiento está optimizada para el aislamiento relativamente fácil de los fagos de arthrobacter de la especie arthrobacter KY 3 9 0 1.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos de enriquecimiento existentes es la adición de una muestra de suelo finamente filtrada a un cultivo puro de bacterias huésped para evitar el crecimiento de bacterias competidoras. Aunque se ha demostrado que este método es eficaz para el aislamiento de fagos de arthrobacter, debería ser aplicable para el aislamiento de fagos de otras bacterias hospederas. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando nos enteramos de que otros investigadores tenían dificultades para encontrar fagos de arthrobacter.

Con técnicas tradicionales de enriquecimiento. Mis estudiantes demostrarán las técnicas utilizadas para aislar con éxito los fagos de arthrobacter. Las células de Arthrobacter se cultivan a partir de colonias rayadas en una placa barrena LB, incubadas a 30 grados centígrados durante dos o tres días.

Use un asa estéril para elegir una colonia y agréguela a 50 mililitros de caldo de libras. En un cultivo con deflectores, incube el matraz en una incubadora agitadora a 225 RPM a 30 grados Celsius durante aproximadamente 24 horas. Obtener células de fase estacionaria exponencial o temprana para experimentos de infección por fagos.

Vigile de cerca el estado del crecimiento bacteriano para evitar que las células entren en el crecimiento estacionario medio a tardío. Estado. El OD 600 ideal para el aislamiento de fagos está entre 0,5 y 0,7. Dado que las bacterias del género arthrobacter son bacterias comunes del suelo, ellas y los fagos que las infectan se pueden encontrar en la mayoría de los tipos de suelo.

Reúna de 200 a 400 gramos de tierra del lugar deseado. Agregue al menos 400 mililitros de tampón de fagos al suelo en un vaso de precipitados lo suficientemente grande como para que al menos 200 mililitros de tampón de fagos estén en el sobrenadante y se puedan extraer mezclados agitando o girando suavemente hasta que el suelo esté suspendido y permita que el sedimento del suelo se asiente, generalmente durante 30 minutos. A continuación, elimine los restos de sedimentos del suelo pasando el extracto de suelo a través de un papel de filtro por filtración al vacío.

Agregue cuatro gramos de polvo LB a 200 mililitros del extracto de tierra filtrado y mezcle para hacer una solución al 2%. Pase la solución a través de un filtro de 0,22 micras por filtración al vacío para obtener un filtrado estéril. Si es posible, continúe con el siguiente paso de inmediato.

Sin embargo, si es necesario, las muestras filtradas pueden almacenarse a cuatro grados centígrados hasta una semana antes de continuar. Sin embargo, el número de partículas de fagos viables se reducirá utilizando como técnicas sépticas alícuotas múltiples porciones de 50 mililitros de la mezcla de extracto de suelo LB esterilizada por filtro en 250 mililitros individuales. Los matraces de cultivo esterilizados y con deflectores agitados añaden una solución estéril de cloruro de calcio molar 2.0 a las concentraciones finales deseadas.

Dado que los diferentes fagos de arthrobacter crecen de manera óptima en diferentes condiciones de cloruro de calcio, comience este procedimiento agregando de uno a 2,5 mililitros de cultivo de bacterias en fase exponencial tardía o estacionaria temprana a cada uno de los matraces que contienen una mezcla de extracto de suelo LB esterilizado por filtro. Si el diámetro exterior 600 del cultivo es de 0,5 a 0,7, use un mililitro. Si el diámetro exterior de 600 es superior a 0,7, utilice 2,5 mililitros.

Agite los matraces a 250 RPM a 30 grados centígrados durante aproximadamente 24 horas en una incubadora agitadora. Después del período de incubación de 24 horas, retire los matraces de enriquecimiento de la incubadora agitadora. Diluya las muestras de enriquecimiento diez veces en tampón de fagos.

Configure tubos de cultivo con 0,5 mililitros de exponencial tardío o estacionario temprano. Fase de cultivo de bacterias. Agregue varias cantidades, desde cinco microlitros hasta 500 microlitros del cultivo de enriquecimiento diluido a los tubos de cultivo.

Añadir cloruro de calcio a los tubos de cultivo para obtener una concentración final en cinco mililitros igual a la concentración presente en el matraz de enriquecimiento original. Utilice un rango de diferentes concentraciones de cloruro de calcio para seleccionar muchos fagos con diferentes dependencias de cloruro de calcio. Agregue 4.5 mililitros de barrena superior LB a cada tubo de cultivo y vierta la mezcla en una placa de barrena LB.

Revuelva suavemente para distribuir uniformemente por todo el plato y deje que la barrena superior se solidifique durante aproximadamente 15 minutos. Invierta las placas e incube a 30 grados centígrados durante la noche hasta las 48 horas. Varíe los tiempos de incubación para optimizar los fagos presentes después de un control de incubación de 24 horas para la formación de placa en las placas.

La mayoría de los fagos aislados provienen de placas incubadas a 30 grados Celsius a una concentración de cloruro de calcio de uno a 2,5 milimolares después de un período de incubación de 24 horas, purificando los fagos deseados a partir de placas claramente aisladas utilizando un palo de madera como la parte más desafiante de este procedimiento. Se requiere experiencia técnica para esparcir suavemente las placas a través de la placa de la barrena para producir una placa de rayas uniforme. Esteriliza un palo de madera pasándolo por una llama y dejando que se enfríe.

Toque brevemente una placa con el palo de madera estéril y frote el palo en la placa de la barrena con el movimiento suave que se muestra. Repita esto con un palo limpio para cada pasada. Una vez que la placa de la barrena LB esté rayada al menos tres veces, marque el área con la concentración más baja de partículas de fagos putativas.

Aplique suavemente 0,5 mililitros de arthrobacter y 4,5 mililitros de barrena superior LB fundida en el área marcada y deje que se extienda uniformemente por la placa. Deje que la barrena superior se solidifique durante al menos una hora, cuando la placa se haya solidificado, invierta e incube durante la noche. Repita la técnica de la placa de rayas durante al menos tres iteraciones para asegurarse de que se aísla una especie de fago pura.

Las placas se pueden almacenar a cuatro grados centígrados durante un máximo de una semana, según sea necesario, entre rayas sin pérdida significativa de la viabilidad de los fagos. Una vez que se hayan cultivado y aislado las placas deseadas en la placa de rayas final, toque una placa bien aislada con una punta de micropipeta y vuelva a suspender en 100 microlitros de tampón de fagos en serie Diluya esta solución hasta la dilución de 10 a menos octavo pasando 20 microlitros de la muestra a 180 microlitros de tampón de fagos frescos. Agregue 10 microlitros de cada dilución a 0,5 mililitros de arthrobacter cultivado en un tubo de cultivo durante cinco a 10 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, mezcle las bacterias infectadas con 4,5 mililitros de barrena superior LB fundida que contenga la misma concentración de cloruro de calcio que se utiliza para aislar el fago de la muestra de suelo original. Incuba las placas durante la noche. Guarde toda la dilución hecha a cuatro grados centígrados hasta el día siguiente.

Determine la dilución de cereal de fagos necesaria para crear un patrón de red utilizando el ensayo tradicional de título de placa. Identifique una placa de patrón de red como en su mayoría desprovista de bacterias, pero que contiene restos de bacterias que aún no han sido mezcladas por los fagos. Añada cinco mililitros de cultivo exponencial tardío o estacionario temprano de Arthrobacter a un matraz de cultivo estéril de 50 mililitros.

Agregue 100 microlitros de la dilución que dio un patrón de red al cultivo de arthrobacter y deje que los fagos infecten las células de la bacteria durante cinco a 10 minutos. A temperatura ambiente, agregue al matraz un sinfín superior de lb fundidas que contenga la misma concentración de cloruro de calcio que se usó inicialmente para identificar la placa de fago. Cinco mililitros de esta mezcla en cada uno de los 10 platos de LB frescos.

Después de permitir que el sinfín superior se solidifique, invierta e incube las placas a 30 grados centígrados durante la noche del día siguiente, inunde las placas con patrón de red con cinco mililitros de tampón de fagos por placa y almacene durante la noche a cuatro grados centígrados. Filtre el lisado de fagos a través de un filtro de jeringa de 0,22 micras. Almacene este stock final de fagos a cuatro grados centígrados para su almacenamiento a largo plazo.

Agregue una cantidad igual de lisado de fagos al glicerol estéril en viales pequeños para el archivo de existencias a menos 80 grados Celsius en el procedimiento de enriquecimiento demostrado en este video, el método de rayado de placa para aislar poblaciones de fagos puros después del enriquecimiento inicial y la siembra en el sinfín LB se muestran como resultados representativos del aislamiento de placas para FAGO DI a temperatura ambiente, 30 grados centígrados y 37 grados centígrados. Los círculos rojos en dos de las placas rodean placas claramente aisladas. El fago Dylan produce placas similares a tres temperaturas diferentes.

Alternativamente, se puede utilizar un ensayo de título de placa estándar tradicional para aislar un fófago aislado puro. Este ensayo se utilizó aquí para determinar empíricamente el número de títulos de fagos y el número de unidades formadoras de placa para formar un patrón de membranas en una placa. Se muestra un conjunto de diluciones en serie para el plátano de fagos con un ejemplo de cómo debería verse un buen patrón de banda.

Se trata de imágenes de micrografía electrónica de 20 fagos de arthrobacter aislados mediante la técnica de enriquecimiento. De los 25 fagos actualmente aislados, 23 de ellos son virus cifo con colas bastante largas. Dos de los fagos aislados son miovirus que contienen diámetros de cabeza similares en longitud a la de sus colas.

Una vez dominado, el recubrimiento de enriquecimiento debería permitir el aislamiento exitoso de los fagos de arthrobacter de una variedad de muestras de suelo. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo purificar el fago que se usa en el método de pintura de rayas a partir de una muestra de suelo ambiental.