Name: Medición de la extracelular Ion fundentes Uso del referencias Ion selectivo microelectrodos Técnica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Aprende a medir flujos iónicos extracelulares in vivo mediante microelectrodos ionoselectivos autorreferenciados. Esta técnica no invasiva permite evaluar con precisión la dinámica de iones en células y tejidos vivos.

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Este trabajo fue apoyado por la subvención MCB-0951199 de la Fundación Nacional de Ciencias, y en parte por la subvención de los NIH EY01910, las subvenciones del Instituto de Medicina Regenerativa de California RB1-01417 y por la subvención de la Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) SFRH/BD/87256/2012.

1. Ion selectivo autorreferencia Preparación microelectrodos <ol><li> Preparación de microelectrodos selectivo de iones <ol><li> Heat tire delgadas capilares de borosilicato de paredes sin filamento (1,5 mm de diámetro exterior, 1,12 mm de diámetro interior) con un extractor de microelectrodos. Nota: Esto le da consejos de 3-4 m de diámetro. Consejos más pequeñas tienen mayor resistencia que hace microelectrodos más susceptibles al ruido electrónico y también está asociado con una respuesta más lenta a un cambio en la concentración de iones. Información útil se puede encontrar en el documento publicado por Smith et al. 26. </li><li> Silanizar los electrodos para hacer que la superficie interior hidrófobo para ayudar a la retención del cóctel ionóforo lipófilo. Colocar los microelectrodos en un bastidor de metal y el calor O / N en un horno a&gt; 100 ° C para secarlos. El bastidor es una placa de metal con agujeros de diámetro 2 mm perforado parte del camino a través. Coloque los electrodos en los agujeros inclinar hacia arriba con una 250 ml gvaso de precipitados lass sobre ellos. </li><li> Por la mañana, apague el horno y con guantes aislados, retire con cuidado la rejilla de metal con los electrodos y vaso de precipitados en el lugar. Cierre la puerta del horno para retener el calor. </li><li> Use guantes de látex o nitrilo, bata de laboratorio y protección para los ojos. Con un plástico pipeta Pasteur, colocar una gota de solución de silanización I en la base de cada electrodo (mantener el vaso en su lugar, el uso del pico vertedor para acceder pipeta). La solución de silanización se vaporiza por la placa caliente y silanizes el interior de los electrodos. Use una campana de extracción de extracción química para esta etapa. Coloque la parrilla / vaso / electrodos de nuevo en el horno caliente durante un par de horas para permitir que cualquier solución silanización restante se evapore. Nota: Por razones de seguridad, no encienda el horno de nuevo. Coloque una etiqueta en el horno que indica que no debe estar encendido, ya que puede contener vapores nocivos e inflamables. </li><li> Después de enfriar, almacenar los microelectrodos en un frasco de almacenamiento insi microelectrodoDe a desecador de vidrio con 400 g de desecante. Los microelectrodos pueden ser almacenados por lo tanto durante muchas semanas. Nota: Un método alternativo silanización se describe en Smith et al 26. </li><li> Volver a llenar el microelectrodo con 50 a 100 l (una longitud de aproximadamente 1 cm) de una solución que contiene 100 mM de ion a medir (ver Tabla 1 y la Figura 1B). Use un Pasteur de plástico térmico pipeta desechable tirado en un mechero Bunsen a una multa de filamento. Enjuague la pipeta en dH 2 O después para evitar el bloqueo. Nota: Como alternativa, ajustar la concentración de iones de la solución de relleno para que coincida con la concentración de iones en la solución externa 27. </li><li> Observar el microelectrodo bajo un microscopio de disección para asegurar la ausencia de burbujas de aire. <ol><li> Si las burbujas están presentes toque el microelectrodo ligeramente con la uña del dedo mientras se mantiene el electrodo verticalmente (la punta hacia abajo) y / o empujar la burbujas la punta aplicando contrapresión usando una jeringa modificada con un tubo de silicona de cambiar la aguja. </li></ol></li><li> Tip-llenar el microelectrodo con 15 a 20 nl (una longitud de 30-50 micras) de cóctel ionóforo específico de iones (véase la Tabla 1). Coloque una pequeña gota de cóctel ionóforo en el borde corto de un portaobjetos de microscopio. Observe la punta de microelectrodos bajo un microscopio de disección y moverlo hacia el portaobjetos de microscopio hasta que la punta de microelectrodos toca el cóctel ionóforo sólo alrededor de la mitad de un segundo. Dibuje el cóctel ionóforo en el microelectrodo por la presión capilar. Nota: evite una larga columna de cóctel ionóforo ya que esto aumenta la resistencia eléctrica de la sonda que puede hacer que sea susceptible a la interferencia electrónica (ruido) y también ralentiza el tiempo de respuesta. </li><li> Monte el microelectrodo en un soporte de microelectrodos recta con un conector macho de 1 mm de oro y AgCl (Ag +) cable (Figura 1B). &lt;/ Li&gt; <li> Coloque el soporte de microelectrodos a la etapa de la cabeza montado en un microposicionador electrónico controlado por ordenador en tres dimensiones (Figura 1). </li><li> Coloque la punta microelectrodo en la medición de solución adecuada para la muestra a medir (solución salina fisiológica, medio de cultivo, etc.) para permitir el microelectrodo se estabilice durante una hora o dos, o incluso durante la noche. </li></ol></li><li> Preparación del electrodo de referencia <ol><li> Los electrodos de referencia (Figura 1C) son los mismos capilares como anteriormente. Cortar el capilar con un lápiz de diamante en 5 cm de longitud y pulido al fuego en cada extremo de 1.2 seg en una llama de Bunsen. </li><li> Llenar estos electrodos con ~ 200 l de una solución de NaCl 3 M, CH 3 CO 2 K (acetato de potasio) o KCl con 2% de agarosa. Elige la solución en función del ion que se desea medir (el electrodo de referencia no debe contener el ion que se está midiendo; véase la Tabla 1). Mezclarla agarosa y la solución y el calor a casi hirviendo en un microondas. Agitar para disolver la agarosa (la solución pasa claro). </li><li> Conecte el electrodo de referencia a una pipeta Pasteur de plástico y extraer la solución caliente en el capilar. </li><li> La caída de la electrodo en frío M NaCl 3, CH 3 CO 2 K o solución de KCl y almacenar en esta solución 3 M en tubos sellados antes de su uso. Deseche todos los electrodos de referencia con burbujas de aire. </li><li> Monte el electrodo de referencia en un soporte de microelectrodos recta con un AgCl (Ag +) de pellets (con solución 3 M llenas pre) en el interior y un oro 2 mm conector macho (Figura 1C) y conecte el electrodo y el soporte en un micro-posicionador manual de montado en un soporte magnético. </li></ol></li></ol> 2. Ion selectivo autorreferencia microelectrodos Calibración <ol><li> Preparación de las soluciones de calibración que contienen el ion de interés como en la solución de referencia; véase la Tabla 1 </strong&gt;. Soporte de la concentración que se encuentra en la solución de la muestra estará en (por ejemplo, medios de cultivo, solución salina fisiológica). Es decir, una solución de calibración debe contener una menor concentración de iones que en la solución de medición, y uno más alto. <ol><li> Por ejemplo, usar una solución salina que contiene 1 mM de K +. Para esta concentración entre paréntesis, disolver polvo de KCl en agua desionizada a una concentración de 10, 1 y 0,1 mM en diluciones seriadas. Utilice estas soluciones de calibración. Alternativamente, utilizar al menos dos de estas soluciones. </li></ol></li><li> Sumergir el microelectrodo selectiva de iones y el electrodo de referencia en cada solución de calibración y dejar que el valor de la tensión se estabilice durante 1 a 3 min antes de grabar el voltaje correspondiente usando el software dedicado (véase la Tabla 1). </li><li> A medida que el software guarda los datos (salida del amplificador) como un archivo txt, copie los datos en un archivo de hoja de cálculo. Trazar la salida microelectrodo (mV) contra el logaritmo dela concentración de iones molar (Figura 2A). </li><li> Aplicar una regresión lineal y calcular la pendiente de Nernst, interceptar y R 2 valor. Acepte el microelectrodo si la pendiente de Nernst es de 58 ± 11 mV / década para iones monovalentes y 29 ± 11 mV / década para iones divalentes (por cationes, la pendiente de Nernst es positivo, por aniones es negativo). Además, las buenas microelectrodos deberían tener una fuerte correlación lineal (R 2&gt; 0,9; Figura 2B). Nota: La salida de mV del amplificador utilizado aquí da lectura mV con una ganancia de diez veces. Los valores tienen que ser dividido por un factor de diez. </li><li> Utilice la fórmula de regresión lineal para convertir la salida mV en bruto de la microelectrodo en la concentración de iones real (Figura 2B). </li></ol> 3. Validación de la técnica de microelectrodos de ion selectivo <ol><li> Preparación de una fuente artificial <ol><li> Capilares de origen artificiales son los mismos capilares comoarriba. Heat tire el capilar usando un extractor de microelectrodo como en el paso 1.1.1. </li><li> Rellene estos capilares con 200 l de una solución de NaCl, KCl 1 M, CaCl 2 2 H 2 O o tampón pH 4. Elija la solución fuente artificial en función del ion que se desea medir (véase la Tabla 1). Nota: Como alternativa, tire de electrodos con mayor diámetro de la punta (~ 20 m) y la punta de relleno con las mismas soluciones, pero que contiene 0,5 a 1% de agarosa (agarosa evitará cualquier flujo mayor de solución). </li><li> Montar el capilar fuente artificial en un micromanipulador y sumergirlo en la solución utilizada para medir el flujo de los iones en las muestras. Deja la fuente artificial en la solución durante 30 min a 1 h para permitir la estabilización del gradiente. </li></ol></li><li> Validación de la microelectrodo selectivo de iones <ol><li> Sumerja el microelectrodo selectivo de iones alrededor de un centímetro de distancia de la fuente artificial capilar en la solución utilizada para Measure el flujo de iones en las muestras y cerrar el circuito con el electrodo de referencia como antes. Que el valor de la tensión se estabilice durante 1 a 3 min antes de grabar el voltaje correspondiente usando el software dedicado para 1 a 2 min. Este valor corresponde al valor del buffer (en la literatura también se refirió como referencia, el fondo o valor en blanco). </li><li> Mueva el microelectrodo selectiva de iones a aproximadamente 5 micras de la fuente artificial y dejar que el valor de la tensión se estabilice durante 1 a 3 min antes de grabar el voltaje correspondiente utilizando el software durante 1 a 2 min. </li><li> Repetir el procedimiento anterior colocando el microelectrodo selectivo de iones en 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 y 1280 m de distancia de la fuente capilar artificial. </li><li> Extraer los datos como un archivo txt y copiar los valores en un archivo de hoja de cálculo. </li></ol></li><li> Calcular la concentración de iones correspondiente a los valores mV en la misma forma que para los valores de calibración. Trazar el valor. Note: Si un flujo de iones está presente, el microelectrodo detecta una diferencia en la concentración de iones entre las dos posiciones (Figura 3B). Si la fuente artificial contiene más iones de la especie medidos de la solución, la concentración debe ser más alta cerca de la fuente de lejos, la validación de la capacidad de la microelectrodo selectiva de iones para detectar correctamente la dirección de un flujo de iones (en este caso eflujo; para un fregadero artificial, con la concentración de iones específica más baja que la medición de medio, debe ser afluencia). <ol><li> Calcular el flujo de iones usando la ley de difusión de Fick: J = c μ (dc / dx) donde c es la concentración de iones en la solución (mol cm -3), μ es la movilidad de iones (mol cm N -1 s -1) , y DC es la diferencia de concentración a través de la distancia dx (cm) (Figura 2C). Datos de flujo de iones se presentan habitualmente en pmol cm -2 s-1 O -2 nmol cm seg -1. Nota:.. Un método alternativo de cálculo de flujo de iones descrito por Smith et al 26 se puede utilizar. Principales diferencias incluyen el uso del coeficiente de difusión en lugar de la movilidad de iones y la resta del flujo de iones de fondo (también variación de la tensión o factor de corrección) calculada a partir de la medición del flujo de iones en solución salina sin muestra. </li><li> Trazar la media de los flujos de iones de cada paso en contra de la distancia de la fuente (Figura 2D). Alejándose de la fuente, observar una disminución exponencial del valor de flujo de la validación de la capacidad de la microelectrodo selectiva de iones para detectar diferente magnitud de los flujos de iones. </li><li> Realice la validación fuente artificial una vez para cada ion específico destinado a ser grabada con el fin de validar sus mediciones de dirección y magnitud correctas con una gran relación señal-nrelación oise. Nota: la medición de flujo de iones del tampón sin muestras indica el nivel o el ruido de fondo. Por lo general, la medición de amortiguación no muestra fluctuaciones clara de la concentración de iones conduce a muy pequeña de flujo que muestra las direcciones variables. </li></ol></li></ol> 4. Preparación de medición Cámara Nota: Antes de los experimentos, considere la muestra a medir y cómo la muestra se va a montar y se inmoviliza para mediciones de microelectrodos. <ol><li> Para Xenopus laevis mediciones ovocitos cortar un cuadrado de 1 cm de una malla de nylon de 800 micras (malla Nitex) y péguelo en una placa Petri de plástico (Figura 1E). </li></ol> 5. Ion Flux Medición <ol><li> Medir la concentración de iones presente en el tampón usado para realizar las mediciones sobre la muestra de la misma manera que para la solución de calibración. X. ovocitos laevis requieren Ringer Modificado de Mark (MMR). Dissolve NaCl, KCl, CaCl, MgCl $ y HEPES en agua desionizada para alcanzar una concentración final de (mM): NaCl 100, KCl 2, CaCl 2, 1 de MgCl y 5 HEPES. Ajuste el pH del tampón a 7,5 utilizando NaOH. </li><li> Coloque la muestra en la cámara de medición y llevar el microelectrodo selectiva de iones cerca de la muestra (aproximadamente 10 m de distancia) utilizando el microposicionador para definir la posición de cierre de la microelectrodo (Figura 3A). </li><li> Iniciar la excursión de baja frecuencia (0,3 Hz) (100 m) de la microelectrodo entre la posición de cierre y una posición alejada de la muestra (distante) utilizando el software dedicado. Asegúrese de que el movimiento del microelectrodo es perpendicular a la superficie de la muestra. Nota: La excursión del microelectrodo se puede establecer en el software. Gran excursión aumenta el gradiente de leer lo que permite una detección más fácil de pequeños flujos durante la medición, mientras que alarga el intervalo de muestreo y disminuye la resolución temporal. Ver <strong&gt; Figura 3A para un ejemplo. </li><li> Inicie la grabación usando el software. El micro se detiene en cada posición y el potencial eléctrico en mV se registra en el equipo. Obtener mediciones durante al menos 2 min, lo que permite la estabilización de la señal. Para los experimentos de lapso de tiempo cortos, las variaciones posibles de registro en la posición de interés para todo el curso del tiempo. </li><li> Extraer los datos como un archivo txt y copiar los valores en un archivo de hoja de cálculo. </li><li> Calcular la concentración de iones correspondiente a los valores mV en la misma forma que para los valores de calibración. Trazar el valor. Nota: Si un flujo de iones está presente, el microelectrodo detecta una diferencia en la concentración de iones entre las dos posiciones (Figura 3B). </li><li> Calcular el flujo de iones usando la ley de Fick de la difusión como antes (etapa 3.3.1). </li><li> Repita la medición búfer antes de medir una nueva muestra y repita el procedimiento de medición de flujo y el cálculo para cada nuevomuestra. </li></ol> 6. Análisis Estadístico y Data Presentación <ol><li> Pon a prueba los efectos independientes de la posición y / o parte del tiempo en los flujos de iones bajo la condición de control utilizando un modelo ANCOVA con efectos mixtos 28. Nota: análisis de covarianza (ANCOVA) es un modelo lineal general que mezcla ANOVA regular y regresión permitiendo medidas tanto categóricas y continuas para ser utilizados como variables independientes. Además, en presencia de errores correlacionados inducidas por medidas repetidas por efectos anidados individuales y eventuales, se utilizan modelos de efectos mixtos para modelar estimaciones precisas de ambos efectos fijos y aleatorios. </li><li> Calcula las comparaciones por pares utilizando la t de Student-test entre los niveles de grupo con la corrección de Bonferroni para múltiples pruebas 28. </li><li> Generar diagramas de caja para resumir las mediciones de flujo de iones de acuerdo a la posición y el tiempo. Incluir los valores de p de la t de Student por pares descritaanteriormente (Figura 3D) e indican que los niveles de significación de los valores de p de la siguiente manera: *: p &lt;0,05; **: P &lt;0,01; ***: P &lt;0,001 29 </li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Los pasos más críticos para la medición exitosa de los flujos de iones extracelulares in vivo son: la reducción del ruido, la fabricación correcta de los microelectrodos y referencia selectivos de iones del electrodo, y el posicionamiento de la muestra y ambos electrodos. Con el fin de minimizar el ruido, el sistema de grabación debe estar en una puesta a tierra (puesta a tierra) jaula de Faraday preferiblemente con una mesa (aislamiento de vibraciones) de metal-rematada que también...

<html> Todas las células animales están rodeadas por una membrana de bicapa lipídica que separa el citoplasma del ambiente exterior. La célula mantiene un potencial de membrana eléctrica, negativa en el interior, por el transporte activo de iones 1. El potencial de membrana es una fuente de energía almacenada que la célula puede utilizar para operar diversos dispositivos moleculares en la membrana 2. Las neuronas y otras células excitables tienen grandes potenciales de membrana. Apertura rápida de los canales de sodio se colapsa el potencial de membrana (despolarización) y produce el potencial de acción que es transportado a lo largo de la longitud de la neurona 2. Aparte de estos rápidos cambios eléctricos, muchos tejidos y órganos generan y mantienen los potenciales eléctricos significativos a largo plazo. Por ejemplo, la piel y el epitelio corneal generar y mantener los potenciales de trans-epiteliales y corrientes eléctricas extracelulares por bombeo direccional de iones (principalmente sodio y cloruro) 3. tienda de campaña &quot;&gt; Mientras que las mediciones de corriente eléctrica extracelular endógena usando la sonda vibrante 4-6 y mediciones de la membrana o trans-epiteliales potenciales utilizando el sistema de microelectrodo 7-10 permitir la medición de los parámetros eléctricos de las membranas celulares y capas de células epiteliales, no dan indicación de las especies de iones implicados. Microelectrodos con ionóforo selectivo pueden medir la concentración de iones específicos en solución. Gradientes de iones o de flujo podrían ser medidos con dos o más electrodos en diferentes posiciones. Sin embargo, la variación de la tensión intrínseca de cada sonda sería diferente, provocando mediciones inexactas o incluso la detección de un gradiente de que no estaba presente. Un único electrodo utilizado en el modo de &quot;auto-referenciación&quot; por la cual se mueve a baja frecuencia entre dos puntos resuelve este problema. Ahora el flujo de iones puede ser visto en el contexto de una deriva de señal relativamente lento y estable (véase la Figura 3B). </p&gt; El sistema de medición sensible a los iones utiliza microelectrodos de autorreferencia selectivos de iones para detectar pequeños flujos extracelulares de iones cerca de los tejidos o células individuales. El sistema consta de un amplificador que procesa la señal desde el microelectrodo y un motor paso a paso y micro controlador para controlar el movimiento de la microelectrodo. El microelectrodo selectiva de iones y el electrodo de referencia que cerrar el circuito están conectados al amplificador a través de un cabezal de la platina pre-amplificador (Figura 1A). Software de ordenador determina los parámetros del movimiento microelectrodo (frecuencia, distancia) y también registra la salida del amplificador. El motor paso a paso controla el movimiento a través de un microelectrodo microposicionador tridimensional. Una baja frecuencia de vibración de microelectrodos selectivo de iones fue desarrollado por primera vez en 1990 para medir el flujo de calcio específico 11. Así como el calcio, cócteles ionóforos comercialmente accesibles ahora están disponibles para hacer microelectrodes sensible al sodio, cloruro, potasio, hidrógeno, magnesio, nitrato, amonio, fluoruro, litio o mercurio. Básicamente, la técnica de microelectrodo selectiva de iones de autorreferencia convierte la actividad de un ion específico disuelto en una solución en un potencial eléctrico, que puede ser medida por un voltímetro. El cóctel de ionóforo es un líquido inmiscible fase (orgánica, lipófilo) con propiedades de intercambio iónico. El ionóforo complejos selectivamente (se une) iones específicos reversible y los transfiere entre la solución acuosa contenida en el microelectrodo (electrolito) y la solución acuosa en la que se sumerge el microelectrodo (Figura 1D). Esta transferencia de iones conduce a un equilibrio electroquímico y una variación del potencial eléctrico entre el microelectrodo y el electrodo de referencia se mide por el voltímetro. El voltaje es proporcional al logaritmo de la actividad del ión específico de acuerdo con la Nernst equation permitiendo el cálculo de la concentración de iones (Figura 2A y B). En la actualidad, varios sistemas permiten la medición del flujo de iones usando un concepto o principio similar. Por ejemplo, la técnica de electrodo de exploración de ion selectivo (SIET) 12,13 o la técnica de microelectrodos Ion Flux Estimation (MIFE) desarrollado por Newman y Shabala 14-16 están comercialmente disponibles y ampliamente utilizados por la comunidad de investigación con el fin de determinar ion específica fundentes que ocurre en la membrana celular y el tejido a través de una variedad de modelos de células vivas individuales animal, vegetal y. Microelectrodos selectivos de iones se han utilizado para medir hidrógeno, potasio y flujo de calcio a través de raíces de la planta 17, cloruro de flujo en las arterias cerebrales de rata 18 y 19 en los tubos de polen, flujo de hidrógeno en células de la retina del patín 20, el flujo de calcio en el hueso del ratón 21, vario ion flujos de hifas fúngicas 22 y en ren la córnea 23, y finalmente el flujo de calcio en las células sola herida de curación 12,24. Ver también la siguiente revisión para obtener información detallada sobre autorreferencia microelectrodos selectivos de iones 25. El siguiente artículo describe con detalle cómo preparar y llevar a cabo la medición de los flujos de iones extracelulares endógenos mediante la técnica de microelectrodos autorreferencia selectivo de iones a nivel de células individuales.

<table><tbody><tr><td>IonAmp&nbsp;</td><td>&nbsp; Centro de Investigación BioCurrents, Woods Hole, MA, EE. UU</td><td>. ninguno</td><td>amplificador creado por el Centro de Investigación BioCurrents, Woods Hole, MA, EE. UU.; Un sistema similar se puede comprar en " La función XBL importa" (http://www.xuyue.org/) o de " YoungerUSA" (http://www.youngerusa.com/) o de Electrónica Aplicable(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>IonAmp32&nbsp;</td><td>&nbsp; BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, EE.UU</td><td>. ninguno</td><td>software creado por el BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, EE.UU.; Un sistema similar se puede comprar en " La función XBL importa" (http://www.xuyue.org/) o de " YoungerUSA" (http://www.youngerusa.com/) o de la electrónica aplicable(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>Preamplificador de etapa de cabeza</td><td>&nbsp; Centro de Investigación de BioCorrientes, Woods Hole, MA, EE. UU</td>. Seguidor de voltaje <td>INA116</td><td>BSR INA116, diseñado por el Centro de Investigación de BioCorrientes, Woods Hole, MA, EE. UU.; Un sistema similar se puede comprar en " La función XBL importa" (http://www.xuyue.org/) o de " YoungerUSA" (http://www.youngerusa.com/) o de la electrónica aplicable(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>Controlador MicroStep</td><td>&nbsp; Centro de Investigación de BioCurrents, Woods Hole, MA, EE.UU</td><td>. no</td><td>se requieren tres controladores MicroStep para el posicionamiento X, Y y Z; creado por el Centro de Investigación de BioCurrents, Woods Hole, MA, EE.UU.; Un sistema similar se puede comprar en " La función XBL importa" (http://www.xuyue.org/) o de " YoungerUSA" (http://www.youngerusa.com/) o de la electrónica aplicable(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>Microposicionador manual&nbsp; &nbsp;</td><td>Instrumentos de Precisión Mundial&nbsp;</td><td>Modelo KITE-R</td><td>Un sistema similar se puede comprar en Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>Soporte magnético&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>Modelo M10</td><td>Un sistema similar se puede comprar en Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)Tabla de aislamiento de</td></tr> <tr><td>vibraciones&nbsp; &nbsp;</td><td>Newport Inc.&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Modelo VW-3036-OPT-023040</td><td>Se puede comprar un sistema similar en Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>Parte de tres microposicionadores dimensionales: soporte angular, 90 grados, caras ranuradas</td><td>Newport Inc. &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Modelo 360-90</td><td>El ensamblaje de los tres microposicionadores dimensionales también requiere Tres motores rotativos eléctricos para el control X, Y, Z, brazo de montaje MPH-1 con poste de ángulo ajustable MCA-2 y Varios conectores y tornillos Newport para atornillar a la mesa de vibración</td></tr><tr><td>Parte de tres microposicionadores dimensionales: Etapa de cola de milano de unión de clavijas de 0,5 pulgadas X Travel</td><td>Newport Inc. &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>460PD-X</td><td>ninguno</td></tr><tr><td>Parte de tres microposicionadores dimensionales: Platina lineal de montaje rápido, 0,5 pulgadas XY Travel</td><td>Newport Inc.</td><td>460A-XY</td><td>ninguno</td></tr><tr><td>Kwik-Fil capilares de vidrio de borosilicato de pared delgada sin filamento&nbsp;</td><td>Instrumentos de Precisión Mundial&nbsp;</td><td>TW150-4</td><td>ninguno</td></tr><tr><td>Extractor de electrodos&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>&nbsp; PC-10</td><td>ninguno</td></tr><tr><td>Bastidor metálico</td><td>Fabricado internamente</td><td>ninguno</td><td>Portaelectrodos metálico fabricado internamente perforando agujeros de 2 mm de ancho espaciados medio centímetro en una base rectangular de acero de 10 cm por 15 cm</td></tr><tr><td>Horno</td><td>QL</td><td>Modelo 10 Horno de laboratorio</td><td>ninguno</td></tr><tr><td>Solución de silanización I&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85126</td><td>Peligroso, maneje según lo recomendado por el proveedor&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa de Petri de vidrio; Pyrex</td><td>Fisher Scientific</td><td>316060</td><td>none</td></tr><tr><td>Tarro de almacenamiento de electrodos/micropipetas</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>E215</td><td>none</td></tr><tr><td>Desecador de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-595E</td><td>Contiene desecante de drierita (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, EE. UU.). Coloque vaselina en el sello para hacerlo hermético.</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur de plástico&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>11597722</td><td>ninguno</td></tr><tr><td>Mechero Bunsen</td><td>Fisher Scientific</td><td>S97329</td><td>ninguno</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8902</td><td>ninguno</td></tr><tr><td>Soporte de microelectrodo recto</td><td>Warner Instruments</td><td>QSW-A15P</td><td>con conector macho dorado de 1 mm y cable Ag/AgCl</td></tr><tr><td>Soporte de microelectrodo recto&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>MEH3S</td><td>con un pellet de AgCl(Ag+) en el interior y un conector macho dorado de 2 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa de Petri de 6 cm</td><td>VWR</td><td>60872-306</td><td>ninguna</td></tr><tr><td>Malla Nitex</td><td>Dynamic Aqua-Supply Ltd.</td><td>NTX750</td><td>ninguno</td></tr><tr><td>Pegamento; Loctite epoxi</td><td>VWR</td><td>500043-451</td><td>Mezcle el pegamento y el endurecedor a partes iguales en un recipiente de pesaje de plástico y mezcle bien. Se fija rápidamente pero se deja en RT durante 24 h para un curado completo.</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>99053</td><td>ninguno</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>ninguno</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>ninguno</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>ninguno</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>ninguno</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>ninguno</td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>ninguno</td></tr><tr><td>Acetato de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1190</td><td>ninguno</td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>ninguno</td></tr></tbody></table>

medición de la extracelular ion fundentes uso del referencias ion selectivo microelectrodos técnica

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Las células de animales, plantas y células individuales están encerradas por una barrera llamada la membrana celular que separa el citoplasma desde el exterior. Capas de células tales como epitelios también forman una barrera que separa el interior del exterior o diferentes compartimentos de organismos multicelulares. Una característica clave de estas barreras es la distribución diferencial de iones a través de membranas celulares o capas de células. Dos propiedades permiten esta distribución: 1) membranas y epitelios presentan permeabilidad selectiva a iones específicos; 2) iones son transportados a través de bombas a través de las membranas celulares y capas de células. Estas propiedades juegan un papel crucial en el mantenimiento de la fisiología del tejido y actúan como una señal de señales después de los daños, durante la reparación, o bajo condición patológica. La referencia a sí misma microelectrodo selectiva de iones permite mediciones de flujos específicos de iones tales como calcio, potasio o sodio en los niveles de células y tejidos individuales. El microelectrodo contiene un cóctel ionóforo que espermeable selectivamente a un ion específico. La solución de relleno interna contiene una concentración conjunto de los iones de interés. El potencial eléctrico de la microelectrodo se determina por la concentración fuera del ión. Como la concentración de iones varía, el potencial de la microelectrodo cambia como una función del logaritmo de la actividad de los iones. Cuando se mueve hacia atrás y adelante cerca de una fuente o sumidero del ion (es decir, en un gradiente de concentración debido a flujo de iones) el potencial microelectrodo fluctúa a una amplitud proporcional al flujo de iones / gradiente. El amplificador amplifica la señal de microelectrodos y la salida se registra en el ordenador. El flujo de iones se puede calcular entonces por la ley de difusión de Fick usando la fluctuación electrodo de potencial, la excursión de microelectrodo, y otros parámetros tales como la movilidad de iones específico. En este trabajo se describe en detalle la metodología para medir los flujos de iones extracelulares utilizando la autorreferencia microelectrodo un ion-selectivod presentar algunos resultados representativos.

Hemos demostrado anteriormente que la entrada de calcio aparece después de una sola célula hiriendo a 24. Por lo tanto, preguntamos si otros flujos de iones se producen en una sola herida celular. Utilizamos la X. laevis ovocito, un modelo bien establecido para celular herida única curación 30-34 y registro electrofisiológico 24,35-39. Curiosamente, los iones de potasio son más concentrada dentro de X. laevis (aproximadamente 110 mm) 40 que en la solución ext...

Los transportadores en las membranas celulares permiten la segregación diferencial de iones a través de las membranas celulares o capas celulares y desempeñan un papel crucial durante la fisiología, reparación y patología de los tejidos. Describimos el microelectrodo autorreferencial selectivo de iones que permite la medición de flujos de iones específicos en células individuales y tejidos in vivo.

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Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

El objetivo general de este procedimiento es medir los flujos iónicos extracelulares in vivo utilizando la técnica de microelectrodos autorreferentes selectivos para iones. Esto se logra primero ensamblando los microelectrodos selectivos para iones y el microelectrodo de referencia. El segundo paso consiste en calibrar y validar los microelectrodos autorreferentes selectivos para iones.A continuación, se realizan mediciones del flujo específico de iones en la muestra biológica en forma de grabaciones de voltaje. Finalmente, la grabación de voltaje se convierte en flujo de iones. En última instancia, esta técnica permite la medición precisa y no invasiva de flujos iónicos extracelulares específicos en células o tejidos vivos.Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en fisiología y envejecimiento, así como en regeneración o patología. Por ejemplo, este método permite la identificación de flujos iónicos específicos, que controlan procesos biológicos como la morfogénesis, el crecimiento o la diferenciación tisular. El procedimiento será demostrado por el Dr. Gim Ardi, investigador posdoctoral, y el laboratorio del Dr. Benjas. Antes de montar la calibración del electrodo, coloque un electrodo selectivo de iones previamente llenado en un porta-electrodos microequipado con un conector macho de oro de un milímetro y un alambre de plata recubierto de cloruro de plata.Luego, fije el portaelectrodo microscópico a un microposicionador electrónico controlado por computadora de tres ejes. El electrodo selectivo de iones debe contener previamente el electrolito y la solución de cóctel de iones correspondiente a los iones de interés. Una vez montado, el electrodo debe sumergirse en una solución que contenga un milimolar de cloruro de potasio.Además, monte el electrodo de referencia en un porta-electrodo microscópico recto que contenga una solución salina de tres moles en agar, una pepita de plata recubierta con cloruro de plata y un conector macho de oro de dos milímetros para el electrodo de referencia. La elección de la solución salina depende de la especie iónica que se va a medir. Después de preparar el electrodo de referencia, fije el porta-electrodo a un microposicionador manual que esté previamente montado en un soporte magnético.Una vez montado, el electrodo debe sumergirse en una solución que contenga cloruro de potasio de un milimolar. Antes de comenzar, el sistema de electrodo selectivo de iones debe tener preparada una serie de diluciones de estándares de calibración de electrolitos que contengan los iones de interés. Por ejemplo, si se van a detectar cationes de potasio a una concentración fisiológica de aproximadamente un milimolar, prepare una serie de tres órdenes de magnitud de soluciones de cloruro de potasio en diez, uno y 0,1 milimolar.Esto maximiza el rango dinámico de detección que requiere el ensayo. Para calibrar el electrodo selectivo de iones, comience por sumergir tanto el electrodo selectivo de iones como el electrodo de referencia en la solución de calibración menos concentrada, en este caso, 0,1 milimolar. Después de un breve período de estabilización de uno a tres minutos a temperatura ambiente, mida y registre el voltaje en estado estable.Repita las mediciones de voltaje para el resto de los estándares de calibración, representando los voltajes medidos frente al logaritmo de las concentraciones molares de iones. Para cada solución estándar, aplique una regresión lineal para determinar la pendiente N, el intercepto y los valores de R² de la curva de calibración. Para calcular la pendiente de Nernst, recuerde dividir los voltajes medidos por la ganancia total del amplificador de voltaje.Para demostrar el protocolo de medición, se caracterizará el flujo de iones potasio desde un ovocito de rana perforado utilizando un microelectrodo sensible al potasio. Antes de comenzar el montaje del electrodo selectivo de iones, corte un parche de un centímetro de una malla de nailon de 800 micrones y péguelo a una placa de Petri de plástico. Además, prepare previamente la solución de Ringer modificada de Mark con la siguiente formulación: 100 milimolares de cloruro de sodio, dos milimolares de cloruro de potasio, dos milimolares de cloruro de calcio, un milimolar de cloruro de magnesio y cinco milimolares de HEPES. Ajuste el pH del tampón a 7,5 con hidróxido de sodio y añada una alícuota del tampón preparado a la placa de Petri.Coloque cuidadosamente la célula de rana, el electrodo selectivo de iones y el electrodo de referencia en la placa de Petri. Luego, perfore la célula y accione el microposicionador, de modo que el electrodo selectivo de iones quede aproximadamente a 10 micrómetros de distancia de la muestra. En cuanto a la nomenclatura, la distancia actual entre la muestra y el electrodo se denominará posición cercana.A continuación, accione el microposicionador de modo que el electrodo selectivo de iones atraviese periódicamente desde la posición cercana de 10 micrómetros hasta una posición más distante de 100 micrómetros, y luego regrese a la posición cercana a una frecuencia de 0,3 hercios, es decir, tres trayectos completos cada 10 segundos. Durante la accion del microposicionador, verifique que el movimiento del electrodo sea verdaderamente perpendicular a la superficie tangencial lesionada del citoplasma, y active el software de medición y registro de voltaje. El microposicionador está programado para detenerse brevemente en las posiciones cercana y distante mientras se recopilan los datos de voltaje.Los datos se registran continuamente durante la cicatrización de la herida en el ovocito, lo que tarda aproximadamente 15 minutos; en experimentos más largos, como la observación de procesos de varios días durante las mediciones de regeneración de la cola de renacuajos de opus, se registran datos durante dos minutos en diferentes puntos temporales. Por ejemplo, a las 1, 3, 6, 12 y 24 horas. Al finalizar el experimento, extraiga los datos de voltaje como un archivo de texto y copie los valores en una hoja de cálculo.Utilice la curva de calibración determinada previamente para convertir los valores de voltaje medidos en sus concentraciones iónicas correspondientes. Represente gráficamente las concentraciones iónicas extrapoladas en función de la distancia respecto a la muestra biológica. Finalmente, calcule el flujo iónico utilizando la ley fija de difusión.Donde C es la concentración de iones en la solución, MU es la movilidad iónica, y DC DX es la diferencia de concentración sobre la distancia dx. Antes de realizar experimentos biológicos, el valor de la intersección de la pendiente del NER y toda la curva de calibración del electrodo selectivo de iones pueden validarse frente a un gradiente iónico artificial generado a partir de una fuente iónica de un molar colocada en una placa de Petri. Cuando se grafican los cambios en las concentraciones de iones de potasio a una distancia cercana o lejana al sitio de la herida de annu.Los datos sugieren que ocurre un evento masivo de flujo de potasio al inicio de la lesión celular; a medida que avanza la cicatrización, el flujo de potasio disminuye gradualmente hasta niveles de reposo después de 15 minutos, cuando la herida está completamente curada. Además, cuando las concentraciones medidas de iones de potasio se convierten en flujo iónico, el aumento repentino y la disminución gradual del flujo de potasio tras la lesión parece ser un efecto estadísticamente significativo en comparación con un ovocito control intacto. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la marcación fluorescente de bioelectricidad, para responder preguntas adicionales sobre las características de los flujos iónicos intercelulares y subcelulares.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este protocolo proporciona un enfoque bioquímico para medir la tasa de acidificación extracelular (ECAR) y la tasa de consumo de oxígeno (OCR) de células leucémicas primarias con ensayo de flujo extracelular. La evaluación del perfil metabólico de estas células ayuda a caracterizar sus demandas, lo que conduce a una terapia personalizada.

Ensayo de flujo extracelular: un método para medir el perfil metabólico de las células

En este video, los cultivos de células embrionarias de riñón que expresan proteínas de canal iónico dependientes de la luz fusionadas con un reportero fluorescente demuestran el efecto de la luz en el movimiento de los iones. La pinza de parche de celda completa se utiliza para monitorear el movimiento de iones.

Registro de electrofisiología optogenética de células con canales iónicos dependientes de la luz

Este video demuestra cómo caracterizar el espacio extracelular en un corte de cerebro mediante el uso de microelectrodos selectivos de iones e iontoforesis para medir y comparar señales eléctricas. Este proceso ayuda a determinar el volumen, la fracción y el grado de torsión del espacio.

Caracterización del espacio extracelular en un corte de cerebro utilizando microelectrodos selectivos de iones e iontoforesis

La primera parte de este artículo muestra cómo seleccionar líneas celulares mutantes que expresan intercambiadores vesiculares de Na+/H+ en su membrana plasmática. La segunda parte proporciona protocolos basados en mediciones de pH intracelular y absorción rápida de iones, que se utilizan para determinar la selectividad de iones y los parámetros cinéticos de estos intercambiadores.

Caracterización funcional de Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Intercambiadores de compartimentos intracelular usando selección Protón-matanza para expresarlos a la membrana plasmática

Demostramos la fabricación, calibración y propiedades de dos tipos de microelectrodos selectivos de iones (de doble cañón y concéntricos) para la medición de concentraciones de iones en el tejido cerebral. A continuación, se utilizan en la preparación del corte del hipocampo del ratón para demostrar que la actividad excitatoria cambia las concentraciones extracelulares de potasio y sodio.

Los microelectrodos de dos cañones y concéntricos para la medición de extracelular Ion señales en el tejido cerebral

Este protocolo describe el uso del ensayo de Ramsay para medir las tasas de secreción de fluidos aislados de Malpighi (renal) túbulos de Drosophila melanogaster. Además, el uso de electrodos de ión específico para medir las concentraciones de sodio y potasio en el líquido secretado, lo que permite el cálculo del flujo de iones transepitelial, se describe.

El uso del ensayo de Ramsay medir la secreción de fluidos y de iones Flux tarifas en el<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Túbulo de Malpighi

Este artículo describe cómo se determina la selectividad iónica de la canalrodopsina con registros electrofisiológicos de patch-clamp de células completas utilizando células HEK293. Aquí, se demuestra el procedimiento experimental para investigar la selectividad del cloruro de una canalrodopsina selectiva de aniones. Sin embargo, el procedimiento es transferible a otras rodopsinas de clara selectividad.

Grabaciones con abrazadera de parche de células enteras para la determinación electrofisiológica de la selectividad iónica en canalrhodopsins

Este manuscrito describe las aplicaciones de electrodos selectivos de protón y parche sujeción métodos para medir la actividad de los sistemas de transporte de protones. Estos métodos superaran algunas limitaciones de las técnicas comúnmente utilizadas para estudiar la actividad de transporte de protones, como sensibilidad moderada, resolución de tiempo y control insuficiente medio intracelular.

Aplicación de medición de electrofisiología para estudiar la actividad de transportadores de Electro-neutro

Iones del potasio contribuyen al reclinación potencial de la membrana de las células y la concentración extracelular de K+ es un regulador crucial de excitabilidad celular. Describimos cómo realizar, calibrar y utilizar monopolar K+-microelectrodos selectivos. Uso de tales electrodos permite la medición de la dinámica de concentración de K+ eléctricamente evocado en rebanadas de hipocampales adulto.

Fabricación, pruebas y uso de microelectrodos selectivos de Ion potasio en rebanadas del tejido del cerebro adulto

Demostrado aquí son protocolos para el aislamiento (1) recién endoteliales cerebrales intactos "tubos" y mediciones (2) simultáneas de calcio endotelial y la membrana potencial durante la hiperpolarización derivados del endotelio. Además, estos métodos permiten ajuste farmacológico de calcio de la célula endotelial y señalización eléctrica como variables experimentales individuales o interactivas.

Medidas simultáneas de calcio intracelular y el potencial de membrana en el endotelio Cerebral de ratón recién aislado e intacto

Este protocolo describe las metodologías detrás del ensayo de Ramsay, los microelectrodos selectivos de iones, la técnica de electrodo selectivo de iones de barrido (SIET) y los ensayos de contracción in vitro, aplicados para estudiar el sistema excretor de mosquitos adultos, compuesto por los túbulos de Malpighian y el intestino posterior, para medir colectivamente las tasas de secreción de iones y líquidos, la actividad contráctil y el transporte de iones transepiteliales.

Estudio de la actividad de los neuropéptidos y otros reguladores del sistema excretor en el mosquito adulto

Aprende a medir flujos iónicos extracelulares in vivo mediante microelectrodos ionoselectivos autorreferenciados. Esta técnica no invasiva permite evaluar con precisión la dinámica de iones en células y tejidos vivos.

Medición de la extracelular Ion fundentes Uso del referencias Ion selectivo microelectrodos Técnica

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