Medición de la extracelular Ion fundentes Uso del referencias Ion selectivo microelectrodos Técnica

El objetivo general de este procedimiento es medir los flujos iónicos extracelulares in vivo utilizando la técnica de microelectrodos autorreferentes selectivos para iones. Esto se logra primero ensamblando los microelectrodos selectivos para iones y el microelectrodo de referencia. El segundo paso consiste en calibrar y validar los microelectrodos autorreferentes selectivos para iones.

A continuación, se realizan mediciones del flujo específico de iones en la muestra biológica en forma de grabaciones de voltaje. Finalmente, la grabación de voltaje se convierte en flujo de iones. En última instancia, esta técnica permite la medición precisa y no invasiva de flujos iónicos extracelulares específicos en células o tejidos vivos.

Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en fisiología y envejecimiento, así como en regeneración o patología. Por ejemplo, este método permite la identificación de flujos iónicos específicos, que controlan procesos biológicos como la morfogénesis, el crecimiento o la diferenciación tisular. El procedimiento será demostrado por el Dr. Gim Ardi, investigador posdoctoral, y el laboratorio del Dr. Benjas. Antes de montar la calibración del electrodo, coloque un electrodo selectivo de iones previamente llenado en un porta-electrodos microequipado con un conector macho de oro de un milímetro y un alambre de plata recubierto de cloruro de plata.

Luego, fije el portaelectrodo microscópico a un microposicionador electrónico controlado por computadora de tres ejes. El electrodo selectivo de iones debe contener previamente el electrolito y la solución de cóctel de iones correspondiente a los iones de interés. Una vez montado, el electrodo debe sumergirse en una solución que contenga un milimolar de cloruro de potasio.

Además, monte el electrodo de referencia en un porta-electrodo microscópico recto que contenga una solución salina de tres moles en agar, una pepita de plata recubierta con cloruro de plata y un conector macho de oro de dos milímetros para el electrodo de referencia. La elección de la solución salina depende de la especie iónica que se va a medir. Después de preparar el electrodo de referencia, fije el porta-electrodo a un microposicionador manual que esté previamente montado en un soporte magnético.

Una vez montado, el electrodo debe sumergirse en una solución que contenga cloruro de potasio de un milimolar. Antes de comenzar, el sistema de electrodo selectivo de iones debe tener preparada una serie de diluciones de estándares de calibración de electrolitos que contengan los iones de interés. Por ejemplo, si se van a detectar cationes de potasio a una concentración fisiológica de aproximadamente un milimolar, prepare una serie de tres órdenes de magnitud de soluciones de cloruro de potasio en diez, uno y 0,1 milimolar.

Esto maximiza el rango dinámico de detección que requiere el ensayo. Para calibrar el electrodo selectivo de iones, comience por sumergir tanto el electrodo selectivo de iones como el electrodo de referencia en la solución de calibración menos concentrada, en este caso, 0,1 milimolar. Después de un breve período de estabilización de uno a tres minutos a temperatura ambiente, mida y registre el voltaje en estado estable.

Repita las mediciones de voltaje para el resto de los estándares de calibración, representando los voltajes medidos frente al logaritmo de las concentraciones molares de iones. Para cada solución estándar, aplique una regresión lineal para determinar la pendiente N, el intercepto y los valores de R² de la curva de calibración. Para calcular la pendiente de Nernst, recuerde dividir los voltajes medidos por la ganancia total del amplificador de voltaje.

Para demostrar el protocolo de medición, se caracterizará el flujo de iones potasio desde un ovocito de rana perforado utilizando un microelectrodo sensible al potasio. Antes de comenzar el montaje del electrodo selectivo de iones, corte un parche de un centímetro de una malla de nailon de 800 micrones y péguelo a una placa de Petri de plástico. Además, prepare previamente la solución de Ringer modificada de Mark con la siguiente formulación: 100 milimolares de cloruro de sodio, dos milimolares de cloruro de potasio, dos milimolares de cloruro de calcio, un milimolar de cloruro de magnesio y cinco milimolares de HEPES. Ajuste el pH del tampón a 7,5 con hidróxido de sodio y añada una alícuota del tampón preparado a la placa de Petri.

Coloque cuidadosamente la célula de rana, el electrodo selectivo de iones y el electrodo de referencia en la placa de Petri. Luego, perfore la célula y accione el microposicionador, de modo que el electrodo selectivo de iones quede aproximadamente a 10 micrómetros de distancia de la muestra. En cuanto a la nomenclatura, la distancia actual entre la muestra y el electrodo se denominará posición cercana.

A continuación, accione el microposicionador de modo que el electrodo selectivo de iones atraviese periódicamente desde la posición cercana de 10 micrómetros hasta una posición más distante de 100 micrómetros, y luego regrese a la posición cercana a una frecuencia de 0,3 hercios, es decir, tres trayectos completos cada 10 segundos. Durante la accion del microposicionador, verifique que el movimiento del electrodo sea verdaderamente perpendicular a la superficie tangencial lesionada del citoplasma, y active el software de medición y registro de voltaje. El microposicionador está programado para detenerse brevemente en las posiciones cercana y distante mientras se recopilan los datos de voltaje.

Los datos se registran continuamente durante la cicatrización de la herida en el ovocito, lo que tarda aproximadamente 15 minutos; en experimentos más largos, como la observación de procesos de varios días durante las mediciones de regeneración de la cola de renacuajos de opus, se registran datos durante dos minutos en diferentes puntos temporales. Por ejemplo, a las 1, 3, 6, 12 y 24 horas. Al finalizar el experimento, extraiga los datos de voltaje como un archivo de texto y copie los valores en una hoja de cálculo.

Utilice la curva de calibración determinada previamente para convertir los valores de voltaje medidos en sus concentraciones iónicas correspondientes. Represente gráficamente las concentraciones iónicas extrapoladas en función de la distancia respecto a la muestra biológica. Finalmente, calcule el flujo iónico utilizando la ley fija de difusión.

Donde C es la concentración de iones en la solución, MU es la movilidad iónica, y DC DX es la diferencia de concentración sobre la distancia dx. Antes de realizar experimentos biológicos, el valor de la intersección de la pendiente del NER y toda la curva de calibración del electrodo selectivo de iones pueden validarse frente a un gradiente iónico artificial generado a partir de una fuente iónica de un molar colocada en una placa de Petri. Cuando se grafican los cambios en las concentraciones de iones de potasio a una distancia cercana o lejana al sitio de la herida de annu.

Los datos sugieren que ocurre un evento masivo de flujo de potasio al inicio de la lesión celular; a medida que avanza la cicatrización, el flujo de potasio disminuye gradualmente hasta niveles de reposo después de 15 minutos, cuando la herida está completamente curada. Además, cuando las concentraciones medidas de iones de potasio se convierten en flujo iónico, el aumento repentino y la disminución gradual del flujo de potasio tras la lesión parece ser un efecto estadísticamente significativo en comparación con un ovocito control intacto. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la marcación fluorescente de bioelectricidad, para responder preguntas adicionales sobre las características de los flujos iónicos intercelulares y subcelulares.