Name: Ablación específico de hepatocitos en pez cebra para estudiar biliar impulsada regeneración hepática (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Aprende a inducir ablación específica de hepatocitos en larvas de Danio rerio mediante tratamiento con metronidazol para analizar la regeneración hepática impulsada por células biliares. Este método permite estudiar mecanismos de regeneración in vivo.

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Los autores agradecen a los Dres. Hukriede y Tsang por las discusiones. M.K. recibió el apoyo de una beca de capacitación de los NIH (T32EB001026). Este trabajo fue financiado en parte por subvenciones de la Fundación Americana del Hígado, la Fundación March of Dimes (5-FY12-39) y los NIH (DK101426) al D.S.

El pez cebra se plantearon y criado de acuerdo con el procedimiento estándar; experimentos fueron aprobados por la Universidad de Pittsburgh Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión. 1. Preparación de embriones / larvas <ol><li> Para llevar a cabo apareamientos cronometrados, creado varón adulto y hembra Tg (fabp10a: PPC-NTR) S931 peces hemizygous o homocigotos S / N y colocar un divisor entre ellos. Eliminar este divisor a la mañana siguiente cuando se desea apareamiento. Recoger los embriones por el esfuerzo del agua usando un colador de malla fina de plástico. </li><li> Gire el filtro al revés y enjuagar la superficie de malla con una fina corriente de agua de huevo dispensado desde un frasco. Transferir 100 embriones en un 100 mm placa de Petri con 25 ml de agua huevo. Mantenga no más de 100 embriones por placa de Petri y criarlos a 28 ° C. </li><li> Para inhibir la pigmentación, añada feniltiourea (PTU) en las placas de Petri antes de 10 horas después de la fecundación (HPF), y elevar embryos / larvas hasta 80 HPF. La concentración final de PTU es 0,2 mM. PRECAUCIÓN: La PTU es tóxico. Use de acuerdo con las directrices de manejo apropiadas. </li><li> Anestesiar las larvas mediante la adición de 3-amino éster etílico del ácido benzoico (tricaína), a una concentración final de 0,016%, en las placas de Petri. Luego, utilizando un microscopio de epifluorescencia, larvas de tipo PPC-positivo. Utilice las larvas con un tamaño de hígado similar y descartar aquellos con un hígado más pequeño o más grande. NOTA: cualquier larvas CFP-positiva, independientemente de la intensidad, se puede utilizar porque no hay diferencia en la extensión de la ablación de hepatocitos entre las larvas hemicigotos y homocigotos. PRECAUCIÓN: tricaína es tóxico. Use de acuerdo con las directrices de manejo apropiadas. </li><li> Eliminar el agua de huevo contiene tricaína y añadir agua huevo suplementado con 0,2 mM PTU. Mantenga el embriones / larvas a 28 ° C. </li></ol> 2. Tratamiento Mtz <ol><li> Preparar fresca solución mM Mtz 10 disolviendo 0,171 g de polvo Mtz en 1Agua de huevo 00 ml complementado con 0,2% mM PTU DMSO y 0,2. Para disolver completamente el Mtz, mezclar la solución a TA con agitación rápida durante 20-30 minutos. Para ayudar a solubilizar Mtz y para mejorar Mtz permeabilidad en las larvas, añada DMSO al preparar Mtz. PRECAUCIÓN: La exposición prolongada o aumento de la concentración de Mtz es tóxico. Use de acuerdo con las directrices de manejo apropiadas. </li><li> Separar las larvas en los grupos de control y experimentales mediante la transferencia de número deseado de larvas en dos diferentes 100 mm plato de Petri o placa de múltiples pocillos. Para el grupo experimental, mantener las larvas en 10 mM solución Mtz; para el grupo control, mantenerlos en agua huevo que contiene 0,2% de DMSO. </li><li> Cubrir las placas o platos de petri que contiene la solución Mtz con papel de aluminio para evitar la foto-inactivación de Mtz, y se incuba a 28 ° C. La duración del tratamiento Mtz depende de la etapa larval y la línea transgénica. </li><li> Observar la ablación hepatocitos severa similar en el <em&gt; Tg (fabp10a: PPC-NTR) de la línea, el tratamiento de las larvas con la solución Mtz ya sea 3,5 días después de la fertilización (dpf) (con una duración de 36 horas) o de 5 dpf (con una duración de 24 horas). </li></ol> 3. Análisis de la impulsada por biliar regeneración hepática <ol><li> Al final del periodo de ablación, eliminar la solución Mtz de las placas. Lavar las larvas tratadas-Mtz mediante la adición de 25 ml de agua huevo. Agitar la placa de 2-3 veces para lavar las larvas antes de desechar el agua de huevo. Repetir tres veces y luego sumergir las larvas una vez más en agua de huevo. Para evitar edema corazón y la muerte de las larvas en las larvas tratadas-Mtz, añadir una menor concentración de tricaína, a una concentración final de 0,008%, para inmovilizar las larvas. </li><li> Para el análisis de hígado, examinar el tamaño del hígado de las larvas tratadas con Mtz bajo un microscopio de epifluorescencia con el filtro de la PPC. Evaluar los niveles de ablación de hepatocitos en función del tamaño relativo del hígado: grande (no ablación; 0-10% larvas), medio (parcialmente ablación; 10-20%), y muy pequeña (totalmente ablación; 80-90%). </li><li> Retire las larvas con hígados no ablación parcial o ablación. Sólo mantener las larvas con una pequeña hígado, que es indicativa de la ablación de hepatocitos grave. Para el análisis de hígado en la regeneración 0 punto temporal hr (R0h), la cosecha de las larvas después de Mtz lavado y PPC clasificación. De lo contrario, mantenga las larvas ordenados en agua huevo suplementado con 0,2 mM PTU hasta el momento de la cosecha. </li><li> Traslado larvas recolectadas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y reemplazar el agua de huevo con la solución de fijación de 3% de formaldehído en tampón PEM. Incubar el tubo en un rotador O / N a 4 ° C. </li><li> Reemplazar la solución de fijación con 1 ml de PBSDT y girar el tubo que contiene las larvas en el rotador durante 5 min. </li><li> Transfiera las larvas fijo en una placa de Petri de 100 mm que contiene PBSDT y el uso de fórceps, quitar manualmente yema y aletas pectorales bajo un microscopio de disección. Traslado hasta TP 20 larvas diseccionado en un tubo de 1,5 ml. </li> &lt;li&gt; Sustituir solución PBSDT con 1 ml de solución de bloqueo y el rock el tubo en un rotador a temperatura ambiente durante 2 horas. </li><li> Reemplazar solución de bloqueo con 100 l de solución de bloqueo que contiene anticuerpos primarios. Poco a poco el rock el tubo en un rotador O / N a 4 ° C. </li><li> Retirar la solución de anticuerpo primario y lavar con PBSDT 5 veces durante 10 min cada vez. A continuación, añadir 100 ul de solución de bloqueo que contiene anticuerpos secundarios y el rock en un rotador a temperatura ambiente durante 2 horas. </li><li> Lavar 5 veces con PBSDT de 10 min cada vez a RT oscilando en un rotador. </li><li> Orientar las larvas lateralmente sobre un portaobjetos de microscopio y añadir una gota de medio de montaje. Cubrir con cuidado con una cubierta de vidrio y sellar la cubierta de vidrio con un pulidor de uñas. Ahora, está listo para la microscopía confocal. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Severa, pero no leve, la ablación de hepatocitos provoca la regeneración hepática biliar impulsada. Por lo tanto, después del tratamiento Mtz y de lavado, es importante para examinar el tamaño del hígado de las larvas tratadas-Mtz, que puede ser evaluada por fluorescencia intrínseca de la PPC fabp10a: CFP-NTR transgén. Desde un pequeño porcentaje de las larvas tratadas-Mtz mostrará no separada por ablación (0-5%) o parcialmente ablación (10-20%) hígados, es esencial para ordenar y sólo analizar las larvas con u...

El hígado es un órgano altamente regenerativa. Durante la regeneración del hígado, la regeneración de los hepatocitos, las células del parénquima del hígado, se derivan de los hepatocitos preexistentes (regeneración hepática hepatocitos impulsada) o BEC (regeneración hepática biliar impulsada) 1,2. La lesión hepática por lo general provoca la proliferación de los hepatocitos preexistentes; sin embargo, cuando se ve comprometida la proliferación de hepatocitos, las BEC puede contribuir a los hepatocitos 2-4. Estos dos modos de regeneración del hígado son clínicamente significativos. Tras la eliminación quirúrgica de una porción del hígado humano (por ejemplo, a causa de tumores en el hígado o donantes de hígado vivos), los hepatocitos en el hígado restante proliferan para recuperar la masa hepática perdido. Por el contrario, en pacientes con enfermedades hepáticas graves, la proliferación de hepatocitos se ve comprometida en gran medida, de modo que las BEC o células progenitoras del hígado (LPC) parecen contribuir a la regeneración de los hepatocitos 5,6. El modelo de roedor 2/3 hepatectomía parcial, en la quehepatocitos proliferan para recuperar la masa hepática perdido, ha contribuido de manera significativa a la comprensión actual de hepatocitos impulsada por la regeneración del hígado 7,8. Sin embargo, no existe un modelo de roedores válida en la que los hepatocitos en regeneración se derivan principalmente de las BEC. Aunque varios modelos de roedores de la toxina del hígado condujeron a la identificación de biliar impulsada por la regeneración del hígado 2-4, los estudios de linaje rastreo recientes en ratones indican una contribución mínima de las BEC a la regeneración de los hepatocitos en estos modelos 9,10. Algunos de los modelos de lesión del hígado de roedores, incluyendo la hepatectomía parcial 11-13 y daño hepático inducido por acetaminofeno-14,15, se han aplicado a pez cebra y llevado a la identificación de nuevos genes o vías implicadas en la regeneración del hígado. Sin embargo, impulsado hepatocitos, pero no conducido-BEC, la regeneración del hígado se produce en estos modelos de lesión de hígado de pez cebra. Por lo tanto, un modelo de lesión hepática novela en la que BEC contribuyen ampliamente a regenerating hepatocitos es necesario para una mejor comprensión de la regeneración del hígado impulsado por la BEC. Los objetivos generales del modelo de ablación hepatocitos describen aquí son (1) para generar un modelo de lesión hepática en la que BEC contribuyen ampliamente a los hepatocitos en regeneración, y (2) a dilucidar los mecanismos moleculares y celulares que subyacen a la regeneración del hígado impulsado por la BEC. La hipótesis de que la gravedad de la lesión determina el modo de regeneración del hígado; por lo tanto, predijo que la regeneración hepática biliar impulsada iniciaría tras la lesión del hepatocito severo. Para probar esta hipótesis, hemos desarrollado un modelo de lesión hepática pez cebra mediante la generación de una línea transgénica, Tg (fabp10a: PPC-NTR) S931, que expresa altamente nitrorreductasa bacteriana (NTR) fusionada con la proteína fluorescente cian (PPC) en el marco del fabp10a específico de hepatocitos promotor. Desde NTR convierte el profármaco no tóxico, metronidazol (Mtz), en un fármaco citotóxico, se extirpa sólo el destinado NTR-las células que expresan 16-18, en este caso, los hepatocitos. Mediante la manipulación de la duración del tratamiento Mtz, la extensión de la ablación de los hepatocitos puede ser controlada. El uso de este modelo, se informó recientemente que en caso de pérdida de hepatocitos grave, BEC ampliamente dan lugar a hepatocitos en regeneración 19, lo que fue confirmado por otros dos estudios independientes 20,21. Por lo tanto, en comparación con el roedor antes mencionado y modelos de lesión de hígado de pez cebra, nuestro modelo de ablación de hepatocitos es más ventajoso para el estudio de la regeneración del hígado impulsado por la BEC. Este protocolo se describe el procedimiento para llevar a cabo experimentos de regeneración hepática mediante el modelo de ablación hepatocitos pez cebra. Este modelo será apropiado para determinar los mecanismos subyacentes a la regeneración hepática biliar impulsada y para pantallas químicos para identificar pequeñas moléculas que pueden reprimir o aumentar la regeneración del hígado.

<table><tbody><tr><td>Polvo de éster etílico de ácido benzoico (tricaína) de 3 aminoácidos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td>Prepare un caldo de tricaína al 0,4% (15 mM): Lleve 0,4 g de tricaína a 100 ml con agua de huevo. Ajustar a pH 7.&nbsp;</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Metronidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1547</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de calcio dihidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3771</td><td></td></tr><tr><td>N-feniltiourea (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Medios de montaje (Vectashield)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm placa de Petri&nbsp;</td><td>Denville Científico Inc.</td><td>M5300</td><td></td></tr><tr><td>esmalte de uñas transparente</td><td>Fisher Scientific</td><td>50949071</td><td></td></tr><tr><td>pinzas finas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>Dumont #5&nbsp;</td></tr><tr><td>portaobjetos de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>cubreobjetos de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-540-A y 12-542-A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>zn-5 (ratón anti-Alcam)</td><td>ZIRC</td><td>zn-5</td><td>1:10 dilución</td></tr> de <tr><td>cabra anti-Hnf4a</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6556 (C-19)</td><td>1:50 dilución</td></tr><tr><td>rata anti-RFP</td><td>Allele Biotechnology</td><td>ACT-CM-MRRFP10</td><td>1:300 dilución</td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-cabra IgG (H+L)</td><td>Laboratorios Jackson</td><td>705-605-147</td><td>dilución 1:500</td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 AffiniPure Cabra Anti-ratón IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21240</td><td>Dilución 1:500</td></tr><tr><td>Cy3 burro anti-rata IgG Laboratorios</td><td>Jackson</td><td>712-165-150</td><td>dilución 1:500</td></tr><tr><td>microscopio de disección</td><td>Leica Microsystems</td><td>S6F</td><td></td></tr><tr><td>microscopio de epifluorescencia</td><td>Leica Microsystems</td><td>M205FA</td><td></td></tr><tr><td>microscopio confocal</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>agua</td><td></td><td></td> de huevo <td>0,3 g/L de sales marinas ' Océano instantáneo' y 0,5 mM de CaSO4 en agua destilada. 
&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; </td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>10X PBS</td><td></td><td></td><td>25.6 g Na2HPO4&middot; 7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4. Llevar a 1 L con agua destilada. Ajuste el pH 7. Autoclave durante 20 min a 121°C.</td></tr><tr><td>1X PBSDT,</td><td></td><td></td><td>0.2% Triton X-100 y 0.2% DMSO en 1 X PBS.</td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> PEM <td>30,2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4. Llevar a 1 L con agua destilada. Ajuste el pH 7.</td></tr><tr><td>Solución</td><td></td><td></td> bloqueante <td>Mezcle 1 ml de suero de caballo inactivado por calor con 9 ml de 1X PBSDT.</td></tr></tbody></table>

ablación específico de hepatocitos en pez cebra para estudiar biliar impulsada regeneración hepática

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

El hígado tiene una gran capacidad de regeneración. Los hepatocitos, las células parenquimatosas del hígado, se puede regenerar en una de dos maneras: la regeneración del hígado hepatocyte- o biliar impulsada. En la regeneración de los hepatocitos del hígado impulsada, los hepatocitos en regeneración se derivan de hepatocitos preexistentes, mientras que, en la regeneración biliar impulsada, los hepatocitos en regeneración se derivan de las células epiteliales biliares (BEC). Para la regeneración del hígado hepatocitos impulsada, hay excelentes modelos de roedores que han contribuido de manera significativa a la comprensión actual de la regeneración del hígado. Sin embargo, no existe tal modelo de roedores para la regeneración hepática biliar impulsada. Recientemente hemos informado en un modelo de lesión hepática pez cebra en el que las BEC ampliamente dan lugar a hepatocitos en caso de pérdida de hepatocitos grave. En este modelo, los hepatocitos se ablación específicamente por un medio de farmacogenéticos. Aquí presentamos en detalle los métodos para la ablación de los hepatocitos y analizar el proceso de regeneración del hígado impulsado por la BEC.Este modelo de ablación específico de hepatocitos se puede utilizar más para descubrir los mecanismos moleculares y celulares subyacentes de la regeneración hepática biliar impulsada. Además, estos métodos pueden ser aplicados a las pantallas químicos para identificar pequeñas moléculas que aumentan o inhiben la regeneración del hígado.

Tratamiento Mtz para 36 hr (A36h, A significa ablación) 3,5 a 5 dpf reducido drásticamente el tamaño del hígado (Figura 1B). Después Mtz lavado, considerado como el comienzo de la regeneración del hígado (R), fuerte fabp10a: PPC-NTR y fabp10a: Expresión dsRed reapareció dentro de 30 horas (Figura 1B). La red biliar intrahepático, como se evaluó por la expresión de Alcam que está presente en la membrana de las BEC 22, colapsado inicialmente pero fue restablec...

Para ayudar a evaluar los mecanismos moleculares que subyacen a la regeneración hepática biliar del pez cebra, establecimos un modelo de lesión hepática en el que los hepatocitos que expresan nitroreductasa se ablacionan genéticamente tras el tratamiento con metronidazol. En este protocolo, describimos cómo manipular, monitorizar y analizar hábilmente la ablación de hepatocitos y la regeneración hepática impulsada por la biliar.

Ablación específico de hepatocitos en pez cebra para estudiar biliar impulsada regeneración hepática

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

El objetivo general de este procedimiento es inducir la ablación de hepatocitos en pez cebra para el análisis de la regeneración hepática impulsada por el sistema biliar. Esto se logra primero exponiendo larvas transgénicas que expresan nitroreductasa en sus hepatocitos a metronidazol o MTZ. En el segundo paso, el grado de ablación de hepatocitos se evalúa en función del tamaño relativo del hígado.Después del tratamiento con MTZ en la etapa final, se recogen larvas con el hígado ablado y de tamaño reducido; finalmente, se miden el tamaño del hígado y la expresión de marcadores hepáticos en el hígado en regeneración mediante microscopía de epifluorescencia y microscopía confocal, respectivamente. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como los modelos de activación de células ovales en roedores, es que con este método, los hepatocitos regenerativos se derivan principalmente de células epiteliales biliares. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la regeneración hepática, como ¿cómo contribuyen las células progenitoras biliares o hepáticas a la regeneración del hígado? En general, las personas nuevas en este método suelen tener d

hepatocyte-specific-ablation-zebrafish-to-study-biliary-driven-liver

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

El artículo describe la ablación hepática dirigida, un método para inducir la muerte de hepatocitos con metronidazol en larvas transgénicas de pez cebra. El protocolo de muestra describe el proceso para generar, manipular y evaluar la ablación hepática dirigida en el pez cebra.

Ablación hepática dirigida: inducción de la muerte de hepatocitos con metronidazol en larvas transgénicas de pez cebra

La fibrosis sostenida con depósito excesivo de proteínas de la matriz extracelular conduce a la cirrosis. El abuso del alcohol es una de las principales causas de enfermedad hepática grave. Establecimos un modelo de hígado fibrótico de pez cebra inducido por etanol para estudiar los mecanismos y estrategias de promoción de la regeneración de hepatocitos tras la lesión inducida por el alcohol.

Desarrollo de un Modelo de hígado fibrótico inducida por etanol en el pez cebra para el Estudio de células progenitoras mediada por la regeneración de hepatocitos

Este protocolo describe el análisis histológico de los hígados de larvas de pez cebra que se han tratado con etanol al 2% durante 24 h. Este tratamiento agudo con etanol da lugar a esteatosis hepática ya hinchamiento de la vasculatura hepática.

Análisis histológicos de lesiones hepáticas alcohólicas agudas en peces cebra

La traducción de la purificación de afinidad ribosoma (TRAP) permite un aislamiento rápido y eficiente del ARNm de traducción específico del tipo de célula. Aquí, demostramos un método que combina la inyección hidrodinámica de cola-vena en un modelo de ratón de repoblación hepática y TRAP para examinar el perfil de expresión de los hepatocitos repoblados.

Perfilado de expresión génica específico del tipo de celda en el hígado del ratón

Aquí demostramos un método para cuantificar el tamaño del hígado en el pez cebra larval, proporcionando una manera de evaluar los efectos de las manipulaciones genéticas y farmacológicas en el crecimiento y desarrollo del hígado.

Cuantificación del tamaño del hígado en el pez cebra larvario mediante la microscopía Brightfield

Este protocolo describe el procedimiento para eliminar el lóbulo ventral del hígado en el pez cebra adulto para permitir el estudio de la regeneración hepática.

Hepatectomía parcial en pez cebra adulto

Aquí, presentamos cómo generar un modelo de pez cebra de carcinoma hepatocelular (HCC) asociado a la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) para estudiar el impacto del excedente de colesterol en el microambiente hepático y el paisaje de las células inmunes.

Análisis del microambiente hepático durante la progresión temprana del carcinoma hepatocelular asociado a la enfermedad del hígado graso no alcohólico en pez cebra

Aquí presentamos un método fiable para estudiar la regeneración renal adulta mediante la inducción de una lesión renal aguda mediante la inyección de gentamicina. Demostramos que la lesión depende de la dosis de gentamicina y de la temperatura ambiental utilizando hibridación in situ para marcar lhx1a+ desarrollando nuevas nefronas.

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Aquí describimos el flujo de trabajo para usar el sistema TetON para lograr la expresión génica específica del tejido en la aleta de la cola del pez cebra adulto en regeneración.

El uso del Sistema de Teton para estudiar los mecanismos moleculares de la regeneración de pez cebra

Este protocolo se muestra cómo extirpar consistentemente ojos planarias (tazas óptica) sin molestar a los tejidos circundantes. Usando una aguja de insulina y la jeringa, ya sea uno o ambos ojos pueden ser ablacionada para facilitar las investigaciones sobre los mecanismos que regulan la regeneración ojo, la evolución de la regeneración visual, y la base neural de la conducta inducida por la luz.

La ablación quirúrgica de ensayo para estudio de la regeneración de los ojos en planarias

Aprende a inducir ablación específica de hepatocitos en larvas de Danio rerio mediante tratamiento con metronidazol para analizar la regeneración hepática impulsada por células biliares. Este método permite estudiar mecanismos de regeneración in vivo.

Ablación específico de hepatocitos en pez cebra para estudiar biliar impulsada regeneración hepática

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