Ablación específico de hepatocitos en pez cebra para estudiar biliar impulsada regeneración hepática

El objetivo general de este procedimiento es inducir la ablación de hepatocitos en pez cebra para el análisis de la regeneración hepática impulsada por la biliar. Esto se logra exponiendo primero a las larvas transgénicas que expresan nitro reductasa en sus hepatocitos a metrona o MTZ. En el segundo paso, se evalúa el nivel de ablación de hepatocitos en función del tamaño relativo del hígado.

Después del tratamiento con MTZ, en el paso final, se recolectan larvas ablacionadas con un hígado diminuto, finalmente se mide el tamaño del hígado y la expresión de marcadores hepáticos en el hígado en regeneración mediante epifluorescencia y microscopía confocal, respectivamente. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como los modelos de activación de células ovaladas en roedores es que con esta técnica, los hepatocitos regenerativos se derivan principalmente de células epiteliales biliares. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la regeneración hepática, como por ejemplo, cómo contribuyen las células biliares o progeneradoras del hígado a la regeneración del hígado. Por lo general, desde individuos hasta principiantes en este método, tendrán dificultades porque el tamaño del hígado en el laboratorio de plomo y degeneración es variable.

Para llevar a cabo apareamientos cronometrados, configure peces hemicigotos u homocigotos machos y hembras adultos durante la noche con un divisor entre ellos. Retire el divisor a la mañana siguiente cuando desee aparearse, usando un colador de malla de plástico fino para cosechar los embriones, voltee el colador boca abajo y use una botella exprimible para enjuagar la superficie de la malla con un chorro fino de agua de huevo. Luego, transfiera hasta 100 embriones a una placa de Petri de 100 milímetros que contenga 25 mililitros de agua de huevo y coloque la placa a 28 grados centígrados para inhibir la pigmentación.

Agregue PTU al cultivo hasta por 10 horas. Post fecundación a las 80 horas. Después de la personalización, anestesiar las larvas con trica y usar un microscopio de epifluorescencia para recolectar las larvas positivas para CFP, manteniendo solo los animales con hígados de tamaño similar.

A continuación, sustituya el agua de huevo trica por agua de huevo fresca suplementada con PTU y devuelva las larvas de pez cebra positivas para CFP a la incubadora a 28 grados centígrados. Para tratar primero las larvas de pez cebra con MTZ, divida el número adecuado de larvas en dos recipientes de cultivo diferentes. Mantener el grupo de larvas experimentales en una solución de MTZ recién preparado y el grupo de control en agua de huevo.

Complementado con DMSO. Cubrir el grupo experimental con papel de aluminio para evitar la fotoinactivación de la MTZ e incubar ambos grupos de larvas de pez cebra a 28 grados centígrados al final del período de ablación. Retire la solución de MTZ de las placas y lave las larvas tratadas con MTZ dos o tres veces con 25 mililitros de agua de huevo y remolino, desechando el agua de huevo después de cada lavado.

Después del último lavado, inmovilizar las larvas con la mitad de la concentración de trica utilizada anteriormente para evitar el edema cardíaco y la muerte en las larvas tratadas con MTZ. A continuación, utilice el filtro CFP en un microscopio de epifluorescencia para evaluar los niveles de ablación de hepatocitos en función del tamaño relativo del hígado de las larvas tratadas con MTZ. Considere el pez cebra con hígados grandes que representan del cero al 5% de las larvas no ablacionadas.

Aquellos con hígados de tamaño mediano que representan del 10 al 20% de las larvas a ablacionar parcialmente y aquellos con hígados muy pequeños que representan el 80 al 90% de las larvas a ablacionar completamente. Después de clasificar a todos los animales, descubra las larvas con hígados no ablacionados o parcialmente ablacionados, conservando solo el pez cebra con hígados diminutos, lo que indica una ablación severa de hepatocitos para el análisis del hígado. En el punto de tiempo de la hora cero de regeneración, transfiera las larvas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Inmediatamente después del lavado de MTZ y el abastecimiento de CFP, reemplace el agua de huevo con tampón MPEM de formaldehído al 3% para una fijación nocturna en un rotor de cuatro grados centígrados. A la mañana siguiente, reemplace la solución de fijación con un mililitro de P-B-S-D-T y rote las larvas durante cinco minutos más. A continuación, todas las larvas fijadas en una placa de Petri de 100 milímetros que contiene P-B-S-D-T fresco bajo un microscopio de disección y use pinzas para quitar manualmente la yema y las aletas pectorales cuando todas las larvas hayan sido cortadas.

Transfiera hasta 20 animales a un tubo de 1,5 mililitros y reemplace el P-B-S-D-T con un mililitro de solución de bloqueo. Después de dos horas en el rotador a temperatura ambiente, reemplace la solución de bloqueo con 100 microlitros del cóctel de anticuerpos primarios para una incubación nocturna a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, retire la solución de anticuerpos primarios y lave el pez cebra con P-B-S-D-T durante cinco lavados de 10 minutos.

Después del último lavado, añadir 100 microlitros del anticuerpo secundario para una incubación de dos horas a temperatura ambiente con balanceo. Finalmente, lave las larvas cinco veces en P-B-S-D-T como se acaba de demostrar. Oriente las larvas lateralmente en un portaobjetos de microscopio y agregue una gota de medio de montaje.

Luego, cubra con cuidado cada pez cebra con un cubreobjetos y selle el cubreobjetos con esmalte de uñas. El tratamiento con MTZ durante 36 horas de 3,5 a cinco días después de la fertilización reduce drásticamente el tamaño del hígado. Después del lavado de la MTZ, una fuerte expresión de CFP y rojo reaparece dentro de las 30 horas, de hecho, según lo evaluado por la expresión de LCAM en la membrana de las células epiteliales biliares.

La red biliar intrahepática colapsa inicialmente, pero luego se restablece 54 horas después del lavado, lo que indica una rápida regeneración y recuperación del hígado. En estas imágenes se muestran hepatocitos transgénicos en regeneración para una proteína fluorescente roja nuclear expresada exclusivamente en las células epiteliales biliares del hígado, la mayoría de estas células H dos BM cereza positivas en el hígado en regeneración expresan HNF cuatro alfa en la regeneración, hora cero, en la regeneración, hora cuatro, C, ocho. Los hepatocitos positivos para CFP tratados con MTZ aún conservan su expresión de cereza H dos BM, lo que indica la conversión de las células epiteliales biliares en hepatocitos tras una pérdida severa de hepatocitos.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar seleccionar el tratamiento con ablación completa después del tratamiento con MTT para la posterior regeneración hepática en la acción de lisis después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la regeneración hepática exploraran los mecanismos subyacentes al progenitor del hígado, la regeneración hepática impulsada por células. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar este modelo de operación específico de citos geográficos para estudios de degeneración hepática impulsada por bilios.