Caracterización de tímico Instalarse Progenitores en el embrión de ratón Uso En Vivo Y In Vitro Ensayos

El objetivo general de este procedimiento es analizar la cinética del fenotipo de generación y el número de células T producidas por los progenitores de sedimentación tímica E 13 o E 18. Esto se logra aislando primero los lóbulos tímicos de embriones de ratón E 13, E 14 y E 18. En el segundo paso, los lóbulos tímicos E 14 se irradian y luego se colonizan con células E 13 o E 18 clasificadas por flujo durante 48 horas en una gota colgante.

En el paso final, los lóbulos colonizados se injertan debajo de la cápsula renal de ratones adultos CD tres knockout. En última instancia, la citometría de flujo se puede utilizar para evaluar la presencia de la progenie progenitora del asentamiento tímico E 13 y E 18 en la sangre de los animales quiméricos. La principal ventaja de esta técnica de nuestros métodos existentes, como el cultivo in vitro de células T en células inso, es que esta técnica combina los métodos que permiten la maduración completa de las células T a partir de progenitores definidos en un ensayo tridimensional con el injerto de cultivos de órganos tímicos en ratones receptores intactos, lo que permite evaluar la diferenciación y la función de los progenitores del corte tímico y la progenie.

Como ingeniero de investigación con experiencia en cirugía de roedores, demostraré el procedimiento Dos días antes del experimento de injerto en una campana de flujo laminar, lo que el abdomen de una rata hembra embarazada con etanol al 70% y hacer una incisión longitudinal en la piel en la línea media, separar la piel para abrir la incisión y luego usar pinzas y tijeras para abrir el peritoneo sin tocar el tracto digestivo. A continuación, extraiga el útero bífido y use unas tijeras para separarlo de la vagina. Luego coloque el útero en una placa de Petri de 90 por 15 milímetros que contenga de 40 a 50 mililitros de DPBS y corte transversalmente entre la decidua de cada embrión.

Use un par de tijeras de punta fina y pinzas finas para quitar la membrana muscular del útero, cortando entre la placenta y el saco vitelino para extraer cada embrión. A continuación, retire la amnia que retiene los embriones y coloque los embriones en una nueva placa de Petri que contenga HBSS más 1% de FCS. Para aislar el timo, coloque los embriones uno a la vez en posición supina bajo una lente de aumento binocular.

A continuación, inserte una pinza longitudinalmente a lo largo del cartílago del esternón y apriete y abra la rejilla torácica con pinzas curvas. Tire de la pared torácica a un lado para visualizar los lóbulos tímicos a cada lado de la tráquea. A continuación, pellizque por debajo del timo con una pinza fina para extraer con cuidado cada lóbulo y colóquelos en una placa de Petri que contenga un mililitro de HBSS más un 1% de FCS.

A continuación, utilice dos pinzas finas para extraer el tejido conectivo circundante sin dañar los lóbulos. A continuación, lavar los lóbulos en tres mililitros de HBSS más 1% de FCS para eliminar los glóbulos rojos y comenzar la irradiación del cultivo de órganos tímicos fetales. E 14 lóbulos tímicos aislados de embriones CD 45.2 como se acaba de demostrar.

Deja reposar los lóbulos durante unas tres horas. A continuación, centrifugar los progenitores de sedimentación tímica E 13 o E 18 recién seleccionados. Vuelva a suspender el pellet en medio de cultivo hasta una concentración final de 500 células por 35 microlitros de medio.

A continuación, coloque una gota de 35 microlitros de suspensión celular en cada dos pocillos de una placa terasaki de 60 pocillos y coloque un lóbulo irradiado en la superficie de cada gota. Cierre la placa y gírela boca abajo para permitir que las células alcancen el polo apical de la gota por gravedad, golpeando suavemente la parte superior de la placa invertida para forzar a los lóbulos a deslizarse hacia el borde apical de la gota. A continuación, incubar la placa invertida en una incubadora humidificada durante 48 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.

Después de que los lóbulos tímicos han sido colonizados, verificar el nivel de anestesia del animal receptor por falta de respuesta refleja. A continuación, coloque una gota de ungüento ocular en cada ojo y coloque el ratón en su lado derecho debajo de una campana de flujo laminar. A continuación, afeita la zona quirúrgica justo por encima de la articulación de la pata trasera.

A continuación, se colocan un par de guantes estériles y se esteriliza el campo quirúrgico con etanol al 70% y una solución de DY DER al 10% de IOD. Use un bisturí para hacer una incisión de 1,5 centímetros a través del tejido cutáneo, seguida de una incisión a través del tejido muscular. Ahora aplique una ligera presión a ambos lados de la incisión para forzar el riñón fuera de la cavidad abdominal y mantener el riñón húmedo con solución salina.

Mantenga el riñón con un bastoncillo de algodón fuera de la cavidad retroperitoneal y use dos pinzas finas para hacer un orificio de dos a tres milímetros en la cápsula. Luego, manteniendo abierta la pared de la cápsula, deslice cuidadosamente hasta seis injertos de lóbulo tímico hacia el borde del polo del riñón y vuelva a colocar el riñón en la cavidad retroperitoneal. Suturar el músculo una neurosis seguida de una sutura de piel con nudos individuales del cirujano.

A continuación, humedece la herida con una solución de povidona con yoduro al 10% y coloca al ratón en una almohadilla térmica de 37 grados centígrados, controlando el animal y la herida quirúrgica hasta que ambas se recuperen por completo para determinar el mejor método de depleción de timocitos endógenos para el desarrollo de progenitores colonizadores. En este experimento, se compararon los niveles de reconstitución de las células T en un lóbulo tímico colonizado después de una radiación o un tratamiento de cinco días con desoxiguina. Si bien no se evidenció ninguna diferencia en el número de linfocitos colonizadores en el noveno día de cultivo, los lóbulos irradiados contenían más células T que los tratados con desoxiguina en el día 12, lo que hace que la irradiación sea el tratamiento preferido para facilitar el desarrollo de las células T después de la colonización tímica para estudiar el potencial de desarrollo de los progenitores de sedimentación tímica E 13 y E 18 aquí. Los lóbulos tímicos irradiados con E 14 fueron colonizados con un número igual de los dos tipos de progenitores observados, los progenitores de sedimentación tímica E 13 dieron lugar a menos timocitos y células T dobles positivas que los progenitores de sedimentación tímica E 18.

Sin embargo, se incrementó la frecuencia de células CD tres positivas maduras y se detectó la producción de células T epiteliales dendríticas solo en la progenie de los progenitores de sedimentación tímica E 13 para analizar el potencial in vivo de los progenitores de sedimentación tímica E 13 y E 18, los lóbulos tímicos colonizados con cada tipo de progenitores se injertaron debajo de la cápsula renal de los receptores knockout de CD tres. Tan demostrado como se esperaba. Los progenitores de sedimentación tímica E 13 dieron lugar a células T más rápidamente que los progenitores E 18, aunque el número de células T circulantes fue significativamente menor en los animales colonizados por los progenitores de sedimentación tímica E 13 en general. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la inmunología del desarrollo exploraran las propiedades del subconjunto de células T, algunos de los cuales son de origen embrionario estricto en un modelo de mamífero.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo rastrear las vías diferenciales y funcionales de los progenitores de asentamiento de Timex y su progenie en un entorno natural incluso y en condiciones competitivas.