Name: Caracterización de tímico Instalarse Progenitores en el embrión de ratón Uso En Vivo Y In Vitro Ensayos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Aprende a caracterizar progenitores tímicos en embrión de ratón mediante ensayos in vivo e in vitro. Este método permite analizar la cinética de generación y fenotipo de células T.

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Apoyado por el Instituto Pasteur, INSERM, Agence Nationale de Recherche ANR (Grant &#39;linfopoyesis&#39;), el Programa de Inversión REVIVE Futuro y &quot;La Ligue contre le Cancer&quot;.

Declaración de Ética: todos los experimentos se realizaron de acuerdo a la Carta Ética del Instituto Pasteur, aprobado por el Ministerio de Agricultura francés, ya las directrices de la UE. Un manipulador con el entrenamiento en cirugía de pequeños roedores, certificada por el Ministerio de Agricultura francés, lleva a cabo todas las intervenciones quirúrgicas. NOTA: Vea en el anexo Tabla 1 muestra el procedimiento del plan de 5 pasos. 1. La selección de los embriones <ol><li> Utilice 36 hembras C57BL / 6 CD45.2, 12 hembras CD45.1, 12 C57BL / 6 machos CD45.1 y 12 C57BL / 6 machos CD45.2. Cruzando las hembras, ya sea con genotipo masculino producirá embriones CD45.1 / 2 y CD45.1 utilizan como una fuente de TSP o CD45.2 utilizado como fuente de receptores lóbulos tímicos. Casa todos los hombres individualmente. </li><li> Para obtener embriones para el aislamiento E18 TSP, coloque 2 hembras en una jaula con un CD45.1 masculina a las 6 pm, 21 días antes del experimento injerto. Compruebe la presencia de un tapón vaginal al día siguiente, antes del mediodía. Sepaevaluar las hembras enchufados. </li><li> Para obtener embriones E14 a ser colonizada por TSP, repita el procedimiento anterior (1.2), utilizando machos CD45.2, 17 días antes del experimento injerto. </li><li> Para obtener embriones para aislar E13 TSP, repita el procedimiento anterior (1.2), utilizando machos C57BL / 6 CD45.1, 16 días antes del experimento injerto. </li></ol> 2. Disección de los embriones Bajo un Horizontal de Flujo Laminar Capucha NOTA: Dos días antes del experimento injerto. <ol><li> Sacrificar las mujeres embarazadas por dislocación cervical o por administración progresiva de CO 2 de gas durante al menos 5 minutos, en una cámara cerrada saturando. Asegúrese de muerte por paro definitivo de movimientos cardio-respiratorio. Moje el abdomen con etanol al 70%. </li><li> Haga una incisión longitudinal en la piel en el abdomen en la línea media y abrirlo tirando de la piel a pedazos. Abra el peritoneo con pinzas y tijeras sin tocar el tracto digestivo. Saque el uter bífidanosotros y separarla de la vagina con las tijeras. </li><li> Coloque el útero en un plato de 90 x 15 mm de Petri que contiene 40 a 50 ml de DPBS y cortar transversalmente entre decidua de cada embrión. </li><li> Con el par de tijeras de punta fina y unas pinzas finas quitar la membrana muscular del útero, sacar los embriones cortando entre la placenta y el saco vitelino, y quitar el amnios, que está reteniendo los embriones. </li><li> Coloque los embriones en un plato de Petri 90 x 15 mm que contienen HBSS + 1% de suero de ternera fetal (FCS). Para los embriones mayores de E15, retire las cabezas con un par de tijeras antes de la disección más. </li></ol> 3. Aislamiento del timo <ol><li> Bajo la lupa binocular, colocar el embrión, tumbado en posición supina (vista ventral), en una ropa de cama de gasa húmeda. </li><li> Inserte un fórceps longitudinalmente a lo largo del cartílago del esternón, pellizcar y abra la rejilla torácica. Con pinzas curvas, tire de la pared torácica a un lado para visualizar el thymic lóbulos en cada lado de la tráquea. </li><li> Sostenga con cuidado cada lóbulo pellizcando debajo con una pinzas finas y colocarlas en una placa de Petri que contiene 1 ml de HBSS + 1% de FCS. Aislar los lóbulos y eliminar el tejido conectivo que rodea con dos jeringas de 1 ml + 26 G ⅜ &quot;agujas, sin dañar la cápsula. </li><li> Lavar los lóbulos en 3 ml de HBSS + 1% de FCS para eliminar las células sanguíneas. NOTA: Antes de E15, lóbulos tímicos se encuentran en cada lado de la tráquea y el fusible más tarde en el medio para constituir un órgano bi-lobar. </li></ol> 4. Las suspensiones celulares <ol><li> Desmenuzar los lóbulos bajo la lupa binocular, con dos agujas 26 G montados en 1 ml jeringas, en HBSS + 1% de FCS. Se filtra la suspensión celular a través de una malla de nylon. </li></ol> 5. La tinción con anticuerpos fluorescentes y clasificación de células NOTA: Todos los anticuerpos se titulan previamente para obtener la definición óptima de las poblaciones (la titration puede variar con el lote de anticuerpo). <ol><li> Incubar los timocitos (E13 o E18) durante 15-30 min a 4 ° C con 100 l de un cóctel de anticuerpos biotinilados para teñir las células de linaje positivos (anti-CD19, anti-Gr1, anti-Ter119, anti-NK1.1 , CD11c anti-, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25). </li><li> Para lavar el exceso de anticuerpos giran por los tubos con 4 ml de HBSS + 1% de FCS a 280 xg durante 7 minutos, eliminar el sobrenadante y volver a suspender el sedimento en fresco HBSS + 1% de FCS. Repetir la centrifugación. </li><li> Se incuban las células marcadas con biotina E18 con microperlas de estreptavidina durante 15 min a 4 ° C y se lavan las células dos veces en HBSS 1% de FCS. Vuelva a suspender las células en 2 ml de HBSS + 1% de FCS. La mayoría de los timocitos E13 son linaje negativo y por lo tanto no necesitan MACS enriquecimiento antes de la clasificación de células. </li><li> Pasar las células en la columna de la LS, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cuando toda la suspensión de células entró en la columna de añadir 2 ml de HBSS + 1% de FCS. Recuperar el4 ml de la columna de flujo a través y centrifugar las células durante 7 min a 280 x g. </li><li> Vuelva a suspender el sedimento de cualquiera empobrecido E18 o E13 timocitos totales en 50 l de la mezcla de anticuerpos TSP (anti-CD117 de APC, anti-CD135 PE, anti-CD127 PECy7, anti-CD24 FITC, anti-CD44 APCCy7 y estreptavidina Pacific Blue ) y se incuba durante 20 min a 4 ° C en la oscuridad. </li><li> Lavar las células con 4 ml de HBSS + 1% de FCS y volver a suspender las células en 1 ml de HBSS + 1% de FCS con yoduro de propidio. </li><li> Ordenar la TSP Lin - CD44 + CD117 + CD24 + CD135 baja CD127 + células en un FACS (con 4 lasers) sobre un tubos de 1,5 ml que contienen 200 l medio completo + 20% FCS. Gate primero las células en función de su tamaño y granularidad de FSC y SSC canales. Elimina las células muertas (tinción con yoduro de propidio), puerta a cabo dobletes y anotar la fluorescencia en las escalas exponenciales. Alrededor de 100 o 600 TSP se pueden obtener de uno E13 o E18 uno timo, respectively. </li></ol> 6. La colonización de E14 tímico lóbulos con Progenitores: Colgante Técnica gota <ol><li> Irradiar (30 Grays = 30 Gy) E14 lóbulos tímicos a partir de embriones CD45.2, 3 hr antes del cultivo. NOTA: E14 o E15 lóbulos tímicos se han utilizado con éxito como receptor de células T progenitoras. El uso de receptores lóbulos tímicos de posteriores días de gestación produce necrosis prematura debido al mayor tamaño del órgano, mientras que los lóbulos del timo en días anteriores gestacional desarrollan mal, probablemente debido a un desarrollo incompleto de las células epiteliales. </li><li> Centrifugar ordenadas TSP y resuspender las células en medio de cultivo (medio completo OPTI-MEM con 10% de FCS, penicilina (50 unidades / ml), estreptomicina (50 mg / ml) y 2β-mercaptoetanol (50 M)) tal que 35 l contiene 500 TSP. </li><li> Coloque una gota 35 l de suspensión de células cada otro pocillo de una placa Terasaki bien 60. NOTA: 35 gotas mu l pueden fusionarse si se colocan en pozos contiguos. </li><li> Coloque un lóbulo irradiado en la superficie de cada gota. Cierre la placa Terasaki y girar la placa boca abajo para permitir que las células alcanzan el polo apical de la caída por gravedad. </li><li> Hit suavemente el lado superior de la placa invertida para forzar a los lóbulos a deslizarse hacia el borde apical de la gota. Incubar la placa Terasaki invertida en un incubador humidificado durante 48 horas a 37 ° C + 5% de CO 2. Después de la colonización, ya sea cultura E14 timos en FTOC 7, o injerto bajo la cápsula renal de un receptor de ratón adulto 8. </li></ol> 7. fetal timo Órgano Cultura <ol><li> Coloque 3 ml de medio completo en un plato de 35 mm Petri. Publicar un filtro de membrana isopore flotando en el medio. Coloque los lóbulos reconstituidos en el borde de la membrana con un fórceps (no más de 8 lóbulos en una membrana). </li><li> Colocar las placas de Petri que contienen los lóbulos tímicos dentro de un plato Petri de 90 mm, junto con un plato de 35 mm, sin cubierta, que contiene 2 ml de water, para asegurar la humedad óptima. Incubar 12 días a 37 ° C + 5% de CO 2. </li></ol> 8. Injertos bajo la cápsula renal Bajo estériles Condiciones NOTA: El parénquima renal está rodeado por tejido conectivo formando una cápsula. La región sub-capsular es particularmente rica en vasos sanguíneos y linfáticos, proporcionando así un ambiente adecuado para el desarrollo de injertos (por ejemplo, los lóbulos del timo, islotes pancreáticos o corazones de recién nacidos). Los injertos se realizan generalmente en el riñón izquierdo debido a que es más accesible que el riñón derecho. CD3 - / - ratones machos fueron utilizados como receptores evitando así reacción injerto contra huésped, debido a los antígenos de histocompatibilidad menores vinculados con el cromosoma Y porque la determinación del sexo antes del E15 no es fácil de hacer. <ol><li> Esterilizar los instrumentos y usar guantes estériles a lo largo de la cirugía. Anestesiar al ratón mediante inyección intraperitoneal de una solución de ketamina 10 mg / ml + xilazina 1 mg /ml diluido en PBS: (50 a 100 l por 10 g de peso corporal), usando una jeringa de 1 ml. Verificar la anestesia mediante la comprobación de falta de reflejos interdigitales. Coloque una gota de hidro-Optimune gel en cada ojo para evitar la sequedad durante la anestesia. NOTA: La solución debe ser preparada extemporáneamente y se calentó a temperatura ambiente antes de la inyección. La anestesia dura por lo menos 20 min. El grado de la anestesia debe ser controlada a lo largo de la cirugía. La anestesia puede ser prolongada por inyección intra peritoneal de media dosis cada 20 min. </li><li> Coloca el ratón sobre su lado derecho, bajo una campana de flujo lamina horizontal. Esterilizar el campo quirúrgico con etanol al 70% y 10% de solución de yoduro de dérmica. Con una parte fórceps el pelo del ratón a lo largo de una longitud de 2 cm justo por encima de la articulación de la pata trasera. Afeitarse el área quirúrgica. </li><li> Con un bisturí, hacer una incisión de 1,5 cm de longitud de primera, el tejido cutáneo, a continuación, con las tijeras cortan el tejido muscular. Aplicar una ligera presión a ambos lados de la incisión, Lo que obligará al riñón fuera de la cavidad abdominal. </li><li> Aplicar una solución salina con un algodón yema para mantener el riñón húmedo. Si tiene dificultades para exponer el órgano, utilice unas pinzas planas para sacar el tejido que rodea los adipocitos a la que se adjunta el riñón. Mantener el riñón fuera de la cavidad retroperitoneal por un bastoncillo de algodón colocado debajo del órgano. </li><li> Con dos pinzas finas, hacer un agujero de 2-3 mm en la cápsula (evite tocar el parénquima para prevenir el sangrado). Durante todo el procedimiento quirúrgico mantener la cápsula renal expuestos humedecido continuamente. </li><li> Inserte cuidadosamente los lóbulos bajo la cápsula renal, mediante el mantenimiento de la pared de la cápsula se abrió y deslice el injerto bajo la cápsula hacia el polo borde. Coloque hasta 6 lóbulos por riñón. </li><li> Vuelva a colocar el riñón en la cavidad retroperitoneal. Suturar la aponeurosis del músculo, entonces la piel con nudos cirujano individuales. Moje la herida con una solución de povidona yoduro de 10%. Coloque el ratón en un pa climatizadad a 37 ° C. </li><li> Encuesta del ratón trasplantado hasta la recuperación total de la anestesia por el control del cardiacas, respiratorias y bigotes movimientos, colores de la mucosa hasta la recuperación total visto por uno mismo contenía movimientos. NOTA: Se recomienda la inyección de solución analgésica (buprenorfina, 0,1 mg / kg) de músculo intra justo después de la cirugía y los 2 días después de la cirugía para prevenir el dolor después de la cirugía. </li><li> Mantenga el animal operado de manera aislada hasta que se recupere totalmente. Inspeccionar cada otro día los puntos de sutura de la herida para verificar y prevenir la infección. Nunca observado infección de la herida después de este procedimiento. NOTA: análisis semanal de las células de sangre periférica de la CD3 - / - ratones injertados nos permiten detectar el timo poblaciones derivadas originó a partir de cualquiera de E13 o E18 progenitores utilizando el marcador alotípica CD45 y el linaje de células T anticuerpos específicos (Figura 3). </li></ol> 9. Análisis de la progenie TSP por citometría de flujo <ol><li&gt; Tease los FTOCs individualmente para obtener suspensiones de células individuales (ver sección protocolo 4). </li><li> Suspensiones celulares de manchas de lóbulos individuales con una mezcla de anticuerpos que contiene anticuerpos que reconocen CD45.1 PECy7, CD45.2 AmCyan, CD4 APCCy7, CD8 APC, CD3 Pacific Blue, Vγ5 FITC, PE Vδ1 e incubar como se describe en la sección 5. </li><li> Vuelva a suspender las células en HBSS + 1% de FCS + yoduro de propidio y analizar en un citómetro de flujo (ver resultados en la Figura 2). </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Dos ensayos principales pueden ser utilizados para analizar la diferenciación de células T ex vivo. El es la más reciente informó el co-cultivo de células progenitoras hematopoyéticas con células estromales de BM, OP9, expresando los ligandos de Noth1, delta como 1 o 4 12. Este ensayo 2-D es fácil de realizar, altamente eficiente y sensible, lo que permite el análisis en el nivel de células individuales. Sin embargo, no apoya el desarrollo de células T más allá de la etapa de DP ni la generación de γ...

Linfocitos T, que lleva el αβ o γδ receptor de células T (TCR), se diferencian en un órgano especializado, el timo. El timo plenamente desarrollado está organizado en dos regiones distintas: la corteza, donde se desarrollan los progenitores del timo y en timocitos que productivamente reorganizan los β TCR y genes de la cadena α son rescatados de la muerte programada (un proceso conocido como selección positiva); y la médula, donde selecciona timocitos con demasiado fuerte reactividad a auto-ligandos se borran (selección negativa) 1,2. El timo se origina en la capa endodérmico de la tercera bolsa faríngea que más tarde se encuentra rodeada por las células mesenquimales 3. Se colonizada por progenitores hematopoyéticos a partir de día embrionario E12 y, a partir de entonces, se requiere el reclutamiento continuo para el desarrollo de células T normales 4. Inmigrantes tímicos evolucionan a través de sucesivas etapas de desarrollo, orquestada por un programa estrictamente regulados, iniciado y maintained por la activación de la vía de señalización Notch en los timocitos tras la interacción con su ligando, como delta 4, expresado en las células epiteliales del timo (TEC) 5. Desarrollo de los timocitos comienza en la llamada CD4 - CD8 - (DN) etapas doble negativos. Timocitos DN pueden subdividirse de acuerdo con la expresión de CD25 y CD44 en DN1 (CD25 - CD44 +), DN2 (CD25 + CD44 +), DN3 (CD25 + CD44 -) y DN4 (CD25 - CD44 -). CD24 (HSA) y CD117 (c-Kit) subdivide aún más el compartimento DN1 en 5 subgrupos donde DN1A ayb corresponden a los progenitores tímicas tempranas (PTE). Timocitos reorganizar las δ, β y α cadenas de TCR en la etapa de DN y se someten a pre-TcR selección (etapas DN3-DN4). Ellos aún más el tránsito a la doble positivo (DP) compartimento CD4 + CD8 + en la cadena α TcR reorganiza antes de la sele positivo y negativocción. En esta etapa la mayoría de los timocitos se eliminan y sólo un pequeño porcentaje (3-5%) llegan a la CD4 + o CD8 + T maduras compartimento celular. La vía de diferenciación linfoide progresa a través de las etapas de las CMH que generan progenitores multipotentes (MPP) y progenitores multipotentes linfoides cebado (LMPP) que perdieron la eritrocitos y megacariocitos potencial 6. LMPP son fenotípicamente define por la ausencia de marcadores de células de la sangre diferenciadas (linaje negativo, Lin -), la expresión de c-Kit (CD117), Sca-1 y Flt3 / Flk2 (CD135) y la ausencia de niveles detectables de la interleucina ( IL) -7 receptores α cadena (IL-7rα o CD127). LMPPs diferenciar aún más en progenitores linfoides comunes (CLP) 7 que por esa etapa han perdido la capacidad de generar células mieloides. CLP retener de linfocitos (B y células T), células NK, DC y células linfoides innata (ILC) potencial, y difieren de LMPP por la expresión de CD127 y la ausencia de altos niveles de Sca-1. Aunque la naturaleza de los progenitores del timo de sedimentación (PST) se ha debatido ampliamente 8, que recientemente se convirtió en claro que el cambio TSP fenotipo, el potencial y la función de la diferenciación, a través del desarrollo 9. Se realizó in vitro y en ensayos in vivo para caracterizar el TSP, aislado por FACS de células de clasificación de cualquiera de E13 (primera onda) o E18 (segunda onda). Culturas timo fetales de órganos (FTOC) con lóbulos tímicos irradiados colonizados por un número igual de E13 y E18 progenitores, teniendo diferentes marcadores alotípicos, se admiten después de su progenie en un entorno de desarrollo similar y reveladas propiedades intrínsecas celulares, diferentes entre ambos tipos de progenitores. Lóbulos tímicos colonizados por cualquiera E13 o E18 TSP permite el desarrollo sin la selección debido a la competencia entre ambos progenitores. In vivo el trasplante de los lóbulos tímicos colonizados mostró además que también tque la progenie madura de E13 y E18 TSP tiene diferentes propiedades biológicas in vivo. TSP de la primera ola generan rápidamente las células T, pero dan lugar a un bajo número de αβ y γδ células T. Entre estos últimos se detectaron células dendríticas Vγ5Vδ1 epiteliales T (LTED), que tienen un TcR invariante, migrar a la epidermis donde ejercen una función en la cicatrización de heridas y sólo se producen durante el desarrollo embrionario 10. Por el contrario, TSP de la segunda ola de tomar más tiempo para generar un gran número de células T TcR + y son incapaces de generar DETC.

<table><tbody><tr><td>Placas de Petri de cultivo de tejidos plásticos de 90 x 15 mm y 35 x 15 mm.</td><td>TPP</td><td>T93100/T9340</td><td>Muestreo</td></tr><tr><td>26 g y frac38; " Jeringas de 0,45 x 10 mm con agujas</td><td>BD Plastipak</td><td>300015</td><td>Cell suspensión</td></tr> de <tr><td>malla de nylon, paño de pernos esterilizado 50/50 mm.</td><td>SEFAR NITEX</td><td>03-100/32</td><td>Filtración de células</td></tr><tr><td>Etanol 70%.</td><td>VWR</td><td>83801.36</td><td>Acciones de esterilidad</td></tr><tr><td>Yoduro Povidona 10% (Betadine)</td><td>MEDA Pharma</td><td>314997.8</td><td>Acciones de esterilidad</td></tr><tr><td>Ketamina 100 mg/ml (solución madre)</td><td>MERIAL</td><td></td><td>Anesthesic</td></tr><tr><td>Xilacina 100 mg/ml en PBS (solución madre)</td><td>Sigma</td><td>X1251-1G</td><td>Anestésico y relajante muscular</td></tr><tr><td>Buprenorfina 0,3 mg/ml solución madre</td><td>AXIENCE</td><td></td><td>Analgésico morfínico</td></tr><tr><td>Gel oftálmico (0,2% de ciclosporina)</td><td>Schering-Plough Animal Health</td><td></td><td>Protección ocular</td></tr><tr><td>DPBS (+ CaCl2, MgCl2)</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>14040-174</td><td>para aislar embriones</td></tr><tr><td>HBSS Hanks' Solución salina equilibrada (+ CaCl2, MgCl2)</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>24020-091</td><td>para lavar la sangre y diseccionar los embriones</td></tr><tr><td>OPTI-MEM I GlutaMAX I</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>51985-026</td><td>Medio para cultivos</td></tr><tr><td>Suero fetal para terneros</td><td>Aditivo EUROBIO</td><td>CVFSVF00-0U</td><td>para cultivos</td></tr><tr><td>Penicilina y estreptomicina</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>15640-055</td><td>Antibióticos para cultivos</td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>31350010</td><td>aditivo para cultivos</td></tr><tr><td>LEICA MZ6 Microscopio de disección</td><td>LEICA</td><td>MZ6 10445111</td><td>Occular W-PL10x/23</td></tr><tr><td>Fuente de lámpara fría</td><td>SCHOTT VWR</td><td>KL1500 compact</td><td>Dos fibras de cuello de cisne adaptadas</td></tr><tr><td>Elastómero de silicona</td> World <td>Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>Almohadilla de disección</td></tr><tr><td>Cuchara, redonda y perforada</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-18 Herramientas de</td><td>disección</td></tr><tr><td>Finas tijeras de iris</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09 Herramientas de</td><td>disección</td></tr><tr><td>Tijeras de resorte Vannas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15018-10 Herramientas de</td><td>disección</td></tr><tr><td>Pinzas: Dumont #5/45 Inox 11 cm</td><td>F.S.T.</td><td>11253-25 Herramientas de</td><td>disección</td></tr><tr><td>2 pares de pinzas de relojero rectas y finas Dumont #5 puntas finas de 11 cm.</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-20 Herramientas de</td><td>disección</td></tr><tr><td>Hilo de poliamida con aguja 6-0 C-3 3/8c</td><td>ETHICON</td><td>F2403</td><td>para suturas</td></tr><tr><td>Portaagujas</td><td>MORIA/F.S.T.</td><td>12060-02</td><td>para suturas</td></tr><tr><td>Almohadilla térmica</td><td>VWR</td><td>100229-100</td><td>Para mantener la temperatura del ratón durante la anestesia</td></tr><tr><td>Membrana Isopore RTTPO2500</td><td>DUTSCHER</td><td>44210</td><td>Para FTOC</td></tr><tr><td>Terasaki 60 placas de pocillos</td><td>FISHER</td><td>1x270 10318801</td><td>Para la técnica de gota colgante</td></tr><tr><td>Hisopos de gasa estériles 7,5 x 7,5 cm</td><td>Hydrex</td><td>11522</td><td>Para aplicar solución desinfectante</td></tr><tr><td>Anticuerpos marcados con fluorescencia o biotina</td><td>BD Biosciences, Biolegend o e-Biocsiences&nbsp;</td><td>Número de clones, consulte la tabla a continuación</td><td>Células de tinción</td></tr><tr><td>Columnas MACS/Microperlas de estreptavidina</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401/130-048-101</td><td>Agotamiento</td>celular</tr><tr><td>Ratones</td><td>Charles Rivers Laboratories (CD45.1) y Janvier Labs&nbsp; (CD45.2)</td><td>C57BL/6 CD45.1 O CD45.2</td><td>Fuente de células y lóbulos tímicos</td></tr><tr><td>Ratones</td><td>CDTA Orl&eacute; ans, Francia</td><td>CD 3 epsilon Ko CD45.2</td><td>Experimento de injerto</td></tr></tbody></table>

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Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

La caracterización del timo resolver progenitores es importante comprender las etapas de pre-timo de desarrollo de las células T, esencial para diseñar estrategias para el reemplazo de las células T en pacientes lymphopenic. Estudiamos timo resolver progenitores desde el día embrionario murino 13 y 18 timos por dos complementarios in vitro e in vivo técnicas, ambos basados ​​en el método de la &quot;gota colgante&quot;. Este método permitió colonizar lóbulos tímicos fetales irradiados con E13 y / o E18 progenitores timo que se distinguen por CD45 marcadores alotípicos y por lo tanto después de su progenie. La colonización con poblaciones mixtas permite analizar las diferencias autónomas celulares en propiedades biológicas de los progenitores, mientras que la colonización, ya sea con la población elimina posibles presiones selectivas competitivos. Los lóbulos tímicos colonizados también pueden ser injertados en ratones receptores masculinos inmunodeficientes que permiten el análisis de la madura progenie de células T in vivo, como la dinámica de la población de tél periférica sistema inmunológico y colonización de diferentes tejidos y órganos. Cultivos de órganos del timo fetal revelaron que los progenitores E13 desarrollaron rápidamente en todos maduran las células CD3 + y dieron lugar al subconjunto de células T γδ canónica, conocidas como células T epiteliales dendríticas. En comparación, los progenitores E18 tienen una diferenciación retardada y no fueron capaces de generar células epiteliales T dendríticas. El seguimiento de sangre periférica de timo-injertado CD3 - / - ratones mostró además que los progenitores E18 tímico de sedimentación generan, con el tiempo, un mayor número de células T maduras que sus contrapartes E13, una característica que no se pudo apreciar en el corto plazo del timo fetal cultivos de órganos.

Con el fin de elegir un método para agotar lóbulos tímicos de timocitos endógenas que permitan el mejor desarrollo de los progenitores que colonizan, se compararon los niveles de reconstitución de células T en los lóbulos tímicos colonizados después de la irradiación o un desoxi-guanosina 5 días de tratamiento (d-Gua). Los resultados muestran que, si bien no hay ninguna diferencia en el día 9 de la cultura, lóbulos irradiados contenían más células T que los tratados con d-Gua, en el día 12. Así, la irradiación es más ap...

Este artículo describe la metodología in vivo e in vitro para caracterizar los progenitores de sedimentación tímica mediante el análisis de la cinética de generación, fenotipo y número de su progenie de células T.

Caracterización de tímico Instalarse Progenitores en el embrión de ratón Uso<em&gt; En Vivo</em&gt; Y<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensayos

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

El objetivo general de este procedimiento es analizar la cinética fenotípica de la generación y el número de linfocitos T producidos por progenitores que colonizan el timo en embriones de ratón en el día E13 o E18. Esto se logra primero aislado los lóbulos timicos de embriones de ratón E13, E14 y E18. En una segunda etapa, los lóbulos timicos E14 son irradiados y luego colonizados con células E13 o E18 ordenadas por citometría de flujo, durante 48 horas en una gota colgante.En el paso final, los lóbulos colonizados se injertan bajo la cápsula renal de ratones adultos CD tres knockout. En última instancia, la citometría de flujo puede utilizarse para evaluar la presencia de los progenitores colonizadores del timo en estadios E13 y E18 y su descendencia en la sangre de los animales quiméricos. La principal ventaja de esta técnica frente a nuestros métodos existentes, como el cultivo in vitro de linfocitos T sobre células ine so, es que combina los métodos que permiten la maduración completa de linfocitos T a partir de progenitores definidos en un ensayo tridimensional, junto con el injerto de cultivos de órganos tímicos en ratones receptores intactos, lo que permite evaluar la diferenciación y función de los progenitores y su descendencia del timo.Como ingeniero de investigación con experiencia en cirugía de roedores, demostraré el procedimiento. Dos días antes del experimento de injerto, en una cabina de flujo laminar, limpiaré el abdomen de una hembra de ratón preñada con etanol al 70 % y realizaré una incisión longitudinal en la piel a lo largo de la línea media, separaré la piel para abrir la incisión y luego usaré pinzas y tijeras para abrir el peritoneo sin tocar el tracto digestivo. A continuación, extraeré el útero bifurcado y usaré tijeras para separarlo de la vagina. Luego colocaré el útero en una placa de Petri de 90 por 15 milímetros que contenga de 40 a 50 mililitros de DPBS y realizaré cortes transversales entre la decidua de cada embrión.Utilice un par de tijeras de punta fina y pinzas finas para retirar la membrana muscular del útero, cortando entre la placenta y el saco vitelino, para extraer cada embrión. Luego retire el amnios conservando los embriones y coloque los embriones en una nueva placa de Petri que contenga HBSS más 1 %FCS. Para aislar el timo, coloque los embriones uno por uno en posición supina bajo una lente binocular de aumento.Luego, inserte una pinza longitudinalmente a lo largo del cartílago del esternón y pellizque y abra la rejilla torácica utilizando pinzas curvas. Retire la pared torácica hacia un lado para visualizar los lóbulos tímicos en cada lado de la tráquea. A continuación, pellizque debajo del timo con una pinza fina para extraer cuidadosamente cada lóbulo y colóquelos en una placa de Petri que contenga un mililitro de HBSS más 1 %FCS.A continuación, utilice dos pinzas finas para eliminar el tejido conectivo circundante sin dañar los lóbulos. Luego lave los lóbulos con tres mililitros de HBSS más 1 %FCS para eliminar los glóbulos rojos y comenzar la cultura de órgano tímico fetal irradiado. Lóbulos tímicos de E14 aislados de embriones CD45.2 tal como se acaba de demostrar.Deje reposar los lóbulos durante aproximadamente tres horas. Luego, centrifugue los precursores de asentamiento tímico recién clasificados E13 o E18. Re suspenda el sedimento en medio de cultivo hasta una concentración final de 500 células por 35 microlitros de medio.Luego, coloque una gota de 35 microlitros de la suspensión celular en cada otro pocillo de una placa terasaki de 60 pocillos y coloque un lóbulo irradiado sobre la superficie de cada gota. Cierre la placa y colóquela boca abajo para permitir que las células alcancen el polo apical de la gota por gravedad; golpee suavemente la parte superior de la placa invertida para forzar a los lóbulos a deslizarse hacia el borde apical de la gota. A continuación, incube la placa invertida en un incubador humedecido durante 48 horas a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono.Después de que las lóbulos tímicos hayan sido colonizados, verifique el nivel de anestesia del animal receptor mediante la ausencia de respuesta refleja. Luego, coloque una gota de pomada ocular en cada ojo y coloque al ratón sobre su lado derecho bajo una cabina de flujo laminar. A continuación, afeite el área quirúrgica justo por encima de la articulación de la pata trasera.A continuación, póngase un par de guantes estériles y esterilice el campo quirúrgico con etanol al 70 % y una solución de IOD DY DER al 10 %. Utilice un bisturí para realizar una incisión de 1,5 centímetros a través del tejido cutáneo, seguida de una incisión a través del tejido muscular. Aplique ahora una ligera presión sobre ambos lados de la incisión para hacer salir el riñón de la cavidad abdominal y mantenga el riñón húmedo con solución salina.Mantenga el riñón con un bastoncillo de algodón fuera de la cavidad retroperitoneal y use dos pinzas finas para hacer un orificio de dos a tres milímetros en la cápsula. Luego, sosteniendo la pared de la cápsula abierta, deslice cuidadosamente hasta seis injertos de lóbulo tímico debajo de la cápsula hacia el borde del polo renal y coloque el riñón de nuevo en la cavidad retroperitoneal. Suture el músculo con una neurotoma y luego la piel con puntos quirúrgicos individuales en nudos de cirujano.Luego humedezca la herida con una solución de povidona yodada al 10 % y coloque al ratón sobre una almohadilla calefactora de 37 grados Celsius, monitoreando al animal y a la herida quirúrgica hasta que ambos se recuperen completamente para determinar el mejor método para agotar los timocitos endógenos destinado al desarrollo de precursores colonizadores. En este experimento, se compararon los niveles de reconstitución de linfocitos T en un lóbulo tímico colonizado tras un tratamiento con radiación o con desoxiguanidina durante cinco días. Aunque no se observó diferencia en el número de linfocitos colonizadores al noveno día de cultivo, los lóbulos irradiados contenían más linfocitos T que aquellos tratados con desoxiguanidina al día 12, por lo que la irradiación resultó ser el tratamiento preferido para facilitar el desarrollo de linfocitos T tras la colonización tímica, con el fin de estudiar el potencial de desarrollo de precursores tímicos colonizadores E13 y E18. Aquí, lóbulos tímicos irradiados E14 fueron colonizados con un número igual de ambos tipos de precursores; como se observó, los precursores tímicos colonizadores E13 generaron menos timocitos y linfocitos T doble positivos que los precursores tímicos colonizadores E18.La frecuencia de células maduras positivas para CD tres, sin embargo, aumentó y la producción de células T epiteliales dendríticas se detectó únicamente en la descendencia de los precursores que colonizan el timo en E 13 para analizar el potencial in vivo de los precursores que colonizan el timo en E 13 y E 18. Los lóbulos tímicos colonizados con cada tipo de precursor se trasplantaron bajo la cápsula renal de receptores knockout para CD tres. Como acaba de demostrarse, tal como se esperaba, los precursores que colonizan el timo en E 13 dieron origen a células T más rápidamente que los precursores en E 18, aunque el número de células T circulantes fue significativamente menor en los animales colonizados por los precursores que colonizan el timo en E 13 en general. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que investigadores en el campo de la inmunología del desarrollo exploraran las propiedades de subpoblaciones de células T, algunas de las cuales tienen un origen estrictamente embrionario en un modelo de mamífero.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión sobre cómo rastrear las vías diferenciales y funcionales de los precursores que se establecen de Timex y su descendencia en un entorno natural, incluso en condiciones competitivas.

characterization-thymic-settling-progenitors-mouse-embryo-using-vivo

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Se presenta paso a paso las instrucciones para la generación de quimeras neonatal, así como la disección y preparación de la timo para la ex vivo de imágenes de 2-fotones microscopía.

En imágenes in situ del timo de ratón utilizando 2-Photon Microscopía

Hemos desarrollado nuevas herramientas de laboratorio y protocolos para la adquisición de imágenes intravital del timo. Nuestra técnica debería ayudar en la identificación de "nichos" en el timo en el desarrollo de células T se produce.

Imagen intravital del timo de ratón utilizando 2-Photon Microscopy

Este video muestra un protocolo para generar linfocitos T funcionales específicos de antígeno a partir de linfocitos T inmaduros derivados de iPSC utilizando un sistema de cultivo tímico tridimensional. El cocultivo de las células T inmaduras derivadas de iPSC con lóbulos tímicos fetales de ratones con depleción de linfocitos endógenos dio lugar a una maduración exitosa de las células T para formar emigrantes tímicos (iTE) derivados de iPSC CD8αβ+ MHC clase I+.

Sistema de cultivo tímico tridimensional para generar emigrantes tímicos derivados de iPSC

Las células madre embrionarias de ratón pueden diferenciarse a células T in vitro utilizando el sistema de cocultivo OP9-DL1. El éxito en este procedimiento requiere una atención cuidadosa al mantenimiento del reactivo/célula y a los pasos sensibles de la técnica clave. Aquí discutimos estos parámetros críticos y proporcionamos un protocolo detallado para fomentar la adopción de esta tecnología.

Derivación de células T In Vitro De células madre embrionarias de ratón

El estudio de las células epiteliales tímicas medulares in vitro ha sido en gran medida infructuoso, ya que los sistemas de cultivo 2D actuales no imitan el escenario in vivo. El sistema de cultivo 3D descrito en este documento, un modelo de cultivo organotípico de piel modificada, ha demostrado ser superior en la recapitulación de la proliferación de mTEC, la diferenciación y el mantenimiento de la expresión génica promiscua.

3D organotípicos Co-cultura de apoyo medular tímica epitelial proliferación celular, la diferenciación y la Expresión Génica Promiscuo Modelo

Este protocolo presenta un método para llevar a cabo cuantitativa, de una sola célula en el análisis in situ de la expresión de la proteína a estudiar especificación linaje en embriones de preimplantación ratón. Los procedimientos necesarios para la recogida de los blastocistos, todo el montaje de detección de inmunofluorescencia de las proteínas, se describen las imágenes de las muestras en un microscopio confocal, y la segmentación nuclear y análisis de imágenes.

Análisis cuantitativo de la expresión de la proteína para el Estudio de la especificación del linaje de ratón de preimplantación de embriones

Mientras que los macrófagos infiltrados son continuamente reclutados en tejidos adultos a partir de precursores circulantes, los macrófagos residentes sembran su tejido durante el desarrollo, donde se mantienen sin más aportación de los progenitores. Recientemente se identificaron los progenitores de macrófagos residentes. Aquí, presentamos métodos para el mapeo de destino genético de los progenitores de macrófagos residentes.

Identificación de progenitores eritromioideos y su progenie en el embrión de ratón por citometría de flujo

En este artículo se describe un protocolo para caracterizar las respuestas de isotipo de inmunoglobulina (Ig) T dependientes y T independientes en ratones usando ELISA. Este método se usa solo o en combinación con el flujo cytometry permitirá a los investigadores identificar las diferencias en las respuestas de isotipo de Ig mediada por células B en ratones después de la inmunización de antígenos T dependientes y T independientes.

Caracterización de las respuestas de isotipo de inmunoglobulina dependiente del timo y timo-independiente en ratones usando el análisis enzima-ligado del inmunosorbente

El objetivo del protocolo es mostrar longitudinal intravital seguimiento en tiempo real de los timocitos por microscopía en implantes tímicos en la cámara anterior del ojo de ratón del laser. La transparencia de la córnea y la vascularización del injerto permiten grabar continuamente reclutamiento de células progenitoras y salida de células T madura.

Seguimiento en Vivo de los timocitos en el compartimiento Anterior del ojo mediante láser, microscopía en tiempo real

Este artículo describe un método novedoso para generar antígenos tumorales inducidos por células madre pluripotentes inducidas por antígenos timáticos (iTE) por un sistema de cultivo timico tridimensional (3D). iTE son un subconjunto homogéneo de células T estrechamente relacionadas con células T ingenuas con la capacidad de proliferación, formación de la memoria y supresión tumoral.

Un sistema de cultivo timático tridimensional para generar emigrantes timémicos específicos de células madre pluripotentes inducidos por la murino

Este artículo proporciona un método para aislar puros tejidos embrionarios de embriones de codorniz y pollo que pueden combinarse para formar ex vivo quimérica órganos.

Aislamiento de los tejidos embrionarios y formación de órganos quiméricas pollo codorniz utilizando el ejemplo de timo

Aprende a caracterizar progenitores tímicos en embrión de ratón mediante ensayos in vivo e in vitro. Este método permite analizar la cinética de generación y fenotipo de células T.

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