Caracterización de tímico Instalarse Progenitores en el embrión de ratón Uso

El objetivo general de este procedimiento es analizar la cinética fenotípica de la generación y el número de linfocitos T producidos por progenitores que colonizan el timo en embriones de ratón en el día E13 o E18. Esto se logra primero aislado los lóbulos timicos de embriones de ratón E13, E14 y E18. En una segunda etapa, los lóbulos timicos E14 son irradiados y luego colonizados con células E13 o E18 ordenadas por citometría de flujo, durante 48 horas en una gota colgante.

En el paso final, los lóbulos colonizados se injertan bajo la cápsula renal de ratones adultos CD tres knockout. En última instancia, la citometría de flujo puede utilizarse para evaluar la presencia de los progenitores colonizadores del timo en estadios E13 y E18 y su descendencia en la sangre de los animales quiméricos. La principal ventaja de esta técnica frente a nuestros métodos existentes, como el cultivo in vitro de linfocitos T sobre células ine so, es que combina los métodos que permiten la maduración completa de linfocitos T a partir de progenitores definidos en un ensayo tridimensional, junto con el injerto de cultivos de órganos tímicos en ratones receptores intactos, lo que permite evaluar la diferenciación y función de los progenitores y su descendencia del timo.

Como ingeniero de investigación con experiencia en cirugía de roedores, demostraré el procedimiento. Dos días antes del experimento de injerto, en una cabina de flujo laminar, limpiaré el abdomen de una hembra de ratón preñada con etanol al 70 % y realizaré una incisión longitudinal en la piel a lo largo de la línea media, separaré la piel para abrir la incisión y luego usaré pinzas y tijeras para abrir el peritoneo sin tocar el tracto digestivo. A continuación, extraeré el útero bifurcado y usaré tijeras para separarlo de la vagina. Luego colocaré el útero en una placa de Petri de 90 por 15 milímetros que contenga de 40 a 50 mililitros de DPBS y realizaré cortes transversales entre la decidua de cada embrión.

Utilice un par de tijeras de punta fina y pinzas finas para retirar la membrana muscular del útero, cortando entre la placenta y el saco vitelino, para extraer cada embrión. Luego retire el amnios conservando los embriones y coloque los embriones en una nueva placa de Petri que contenga HBSS más 1 %FCS. Para aislar el timo, coloque los embriones uno por uno en posición supina bajo una lente binocular de aumento.

Luego, inserte una pinza longitudinalmente a lo largo del cartílago del esternón y pellizque y abra la rejilla torácica utilizando pinzas curvas. Retire la pared torácica hacia un lado para visualizar los lóbulos tímicos en cada lado de la tráquea. A continuación, pellizque debajo del timo con una pinza fina para extraer cuidadosamente cada lóbulo y colóquelos en una placa de Petri que contenga un mililitro de HBSS más 1 %FCS.

A continuación, utilice dos pinzas finas para eliminar el tejido conectivo circundante sin dañar los lóbulos. Luego lave los lóbulos con tres mililitros de HBSS más 1 %FCS para eliminar los glóbulos rojos y comenzar la cultura de órgano tímico fetal irradiado. Lóbulos tímicos de E14 aislados de embriones CD45.2 tal como se acaba de demostrar.

Deje reposar los lóbulos durante aproximadamente tres horas. Luego, centrifugue los precursores de asentamiento tímico recién clasificados E13 o E18. Re suspenda el sedimento en medio de cultivo hasta una concentración final de 500 células por 35 microlitros de medio.

Luego, coloque una gota de 35 microlitros de la suspensión celular en cada otro pocillo de una placa terasaki de 60 pocillos y coloque un lóbulo irradiado sobre la superficie de cada gota. Cierre la placa y colóquela boca abajo para permitir que las células alcancen el polo apical de la gota por gravedad; golpee suavemente la parte superior de la placa invertida para forzar a los lóbulos a deslizarse hacia el borde apical de la gota. A continuación, incube la placa invertida en un incubador humedecido durante 48 horas a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono.

Después de que las lóbulos tímicos hayan sido colonizados, verifique el nivel de anestesia del animal receptor mediante la ausencia de respuesta refleja. Luego, coloque una gota de pomada ocular en cada ojo y coloque al ratón sobre su lado derecho bajo una cabina de flujo laminar. A continuación, afeite el área quirúrgica justo por encima de la articulación de la pata trasera.

A continuación, póngase un par de guantes estériles y esterilice el campo quirúrgico con etanol al 70 % y una solución de IOD DY DER al 10 %. Utilice un bisturí para realizar una incisión de 1,5 centímetros a través del tejido cutáneo, seguida de una incisión a través del tejido muscular. Aplique ahora una ligera presión sobre ambos lados de la incisión para hacer salir el riñón de la cavidad abdominal y mantenga el riñón húmedo con solución salina.

Mantenga el riñón con un bastoncillo de algodón fuera de la cavidad retroperitoneal y use dos pinzas finas para hacer un orificio de dos a tres milímetros en la cápsula. Luego, sosteniendo la pared de la cápsula abierta, deslice cuidadosamente hasta seis injertos de lóbulo tímico debajo de la cápsula hacia el borde del polo renal y coloque el riñón de nuevo en la cavidad retroperitoneal. Suture el músculo con una neurotoma y luego la piel con puntos quirúrgicos individuales en nudos de cirujano.

Luego humedezca la herida con una solución de povidona yodada al 10 % y coloque al ratón sobre una almohadilla calefactora de 37 grados Celsius, monitoreando al animal y a la herida quirúrgica hasta que ambos se recuperen completamente para determinar el mejor método para agotar los timocitos endógenos destinado al desarrollo de precursores colonizadores. En este experimento, se compararon los niveles de reconstitución de linfocitos T en un lóbulo tímico colonizado tras un tratamiento con radiación o con desoxiguanidina durante cinco días. Aunque no se observó diferencia en el número de linfocitos colonizadores al noveno día de cultivo, los lóbulos irradiados contenían más linfocitos T que aquellos tratados con desoxiguanidina al día 12, por lo que la irradiación resultó ser el tratamiento preferido para facilitar el desarrollo de linfocitos T tras la colonización tímica, con el fin de estudiar el potencial de desarrollo de precursores tímicos colonizadores E13 y E18. Aquí, lóbulos tímicos irradiados E14 fueron colonizados con un número igual de ambos tipos de precursores; como se observó, los precursores tímicos colonizadores E13 generaron menos timocitos y linfocitos T doble positivos que los precursores tímicos colonizadores E18.

La frecuencia de células maduras positivas para CD tres, sin embargo, aumentó y la producción de células T epiteliales dendríticas se detectó únicamente en la descendencia de los precursores que colonizan el timo en E 13 para analizar el potencial in vivo de los precursores que colonizan el timo en E 13 y E 18. Los lóbulos tímicos colonizados con cada tipo de precursor se trasplantaron bajo la cápsula renal de receptores knockout para CD tres. Como acaba de demostrarse, tal como se esperaba, los precursores que colonizan el timo en E 13 dieron origen a células T más rápidamente que los precursores en E 18, aunque el número de células T circulantes fue significativamente menor en los animales colonizados por los precursores que colonizan el timo en E 13 en general. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que investigadores en el campo de la inmunología del desarrollo exploraran las propiedades de subpoblaciones de células T, algunas de las cuales tienen un origen estrictamente embrionario en un modelo de mamífero.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión sobre cómo rastrear las vías diferenciales y funcionales de los precursores que se establecen de Timex y su descendencia en un entorno natural, incluso en condiciones competitivas.