Atímicos Rata Modelo de Evaluación de Ingeniería de ligamento cruzado anterior injertos

El objetivo general del siguiente procedimiento es utilizar un modelo de roedor para evaluar injertos de tejido regenerado para el reemplazo del ligamento cruzado anterior. Esto se logra primero fabricando un andamio de polímero biodegradable. En el segundo paso, el andamio se implanta en la rodilla de una rata.

Después de 16 semanas, se extraen los ligamentos neoformados a partir del andamiaje para su análisis histológico. En última instancia, se evalúa la resistencia biomecánica del colágeno para determinar la calidad de estos injertos de tejido ingenierilizado destinados a la reconstrucción del LCA. Las principales ventajas de esta técnica frente a otros métodos de evaluación de andamiajes son que este modelo expone el andamiaje a un entorno complejo in vivo, a la vez que resulta rentable y más sencillo de manipular que los modelos animales más grandes.

Este modelo puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la ingeniería de tejidos, como, ¿cómo se integrará un andamio diseñado con el entorno in vivo para formar un neo ligamento? Esta técnica puede conducir a nuevos tratamientos y a la reconstrucción del LCA. Dado que los modelos de animales pequeños son el primer paso hacia la traslación clínica, este método puede utilizarse para evaluar nuestro andamio particular.

También puede aplicarse a otros injertos diseñados con tejidos, como aquellos que contienen células y factores de crecimiento. Optimizamos la técnica quirúrgica modificando los métodos empleados por el Dr. Scott Rodeo y colegas en el hospital para cirugía especial en Nueva York. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de electrohilado y los procedimientos quirúrgicos pueden ser difíciles de aprender únicamente mediante instrucciones escritas.

Al electrohilasar andamios de policaprolactona, se necesitará una caja grande de acrílico con puntos de entrada para la solución de policaprolactona, un mandril recolector accionado por un motor y un puerto de vacío impulsado por una fuente de voltaje, todo colocado dentro de una campana extractora de gases, que servirá como medio de vacío aislado para el proceso de electrohilado. Antes de comenzar el procedimiento, limpie la caja cuidadosamente con etanol al 70 % y cubra todas las superficies con láminas de papel parafilm para eliminar cualquier impureza que pueda comprometer la calidad del producto electrohilado.

Luego encienda el ventilador y cargue tres mililitros de polímero de policaprolactona recién preparado en una jeringa de 10 mililitros con una aguja roma de calibre 18. Después de eliminar cualquier burbuja de aire, fije la solución en una bomba de jeringa programable e introduzca la aguja en la caja de acrílico a través del puerto de entrada, dejando aproximadamente medio centímetro de la aguja fuera de la caja. A continuación, envuelva firmemente el mandril giratorio con una tira delgada de papel de aluminio y fije el mandril al motor en el lado opuesto de la caja, a unos 15 centímetros de distancia de la aguja de la jeringa para que actúe como colector; inserte una manguera de plástico en el puerto de vacío.

Luego, conecte la manguera a la fuente de vacío de la campana extractora y enciéndala. Ahora, cubra la caja de acrílico con la tapa y ajuste la velocidad de infusión de la bomba de jeringa programable a 2,5 mililitros por hora. Luego, conecte a tierra el cable negativo, encienda el motor para hacer funcionar el mandril a 3 450 rpm y utilice una pinza cocodrilo para conectar el cable positivo de la fuente de voltaje a la punta de la aguja ubicada fuera de la caja.

Una vez que comience la infusión de la solución de policaprolactona, encienda la fuente de voltaje y ajústela a un voltaje de operación de 20 kilovoltios. Después de 12 minutos de infusión, se habrá formado una funda homogénea a partir de 0,5 mililitros de la solución de policaprolactona. Apague todo el equipo, incluidos el voltaje, la fuente, el motor, el vacío y la bomba de jeringa.

Retire el mandril del motor, retire la funda de polímero del mandril y realice un corte transversal único para obtener una matriz rectangular de material electrohilado. Luego, corte la matriz con láser para formar varias láminas pequeñas, que posteriormente se cortarán en tiras apiladas en cuatro capas de espesor y se coserán juntas para formar andamios antes de comenzar la cirugía. Primero, confirme una anestesia adecuada mediante la ausencia de respuesta a la presión en la pata trasera.

A continuación, realice una incisión vertical de dos centímetros de longitud medial a la rodilla, centrada a nivel de la rótula, y retraja la piel lateralmente según sea necesario. A continuación, use un bisturí para realizar una artrotomía medial para-rotuliana justo medial a la rótula, extendiéndose proximalmente hasta el nivel de la unión músculo-tendinosa del cuádriceps y distalmente hasta el nivel de la inserción del tendón rotuliano en la tuberosidad tibial. Ahora, realice una incisión vertical de un centímetro a través de la cápsula articular de la rodilla justo lateral al tendón rotuliano para liberar lateralmente la rótula.

Luego, asegurándose de que la rodilla esté extendida, pase un par de tijeras finas por debajo de la rótula desde el lado lateral al medial, y abra las tijeras varias veces para que el mecanismo extensor pueda desplazarse hacia un lado u otro durante la flexión de la rodilla. Desplace la rótula lateralmente para exponer el interior de la articulación de la rodilla, confirmando una visualización clara de la escotadura intercondílea y los cóndilos femorales. A continuación, seccione el LCA y el LCP en la escotadura.

Ahora coloque la punta de un alambre K de 1,6 milímetros conectado a un taladro eléctrico sobre el origen del LCA en la escotadura intercondílea y perfore hacia arriba y lateralmente mientras un ayudante estabiliza la rodilla. Luego pase el alambre K hacia dentro y hacia fuera varias veces para asegurar un paso claro para el injerto. Visualice el punto de salida en la cara lateral del fémur, eliminando cualquier tejido blando necesario con un escalpelo.

Cuando el túnel esté despejado, coloque el alambre de Kirschner sobre la huella del LCA en la meseta tibial y realice una perforación lateralmente mientras un asistente estabiliza la rodilla. Luego visualice el punto de salida en la tibia proximal anterolateral utilizando el bisturí para eliminar el tejido blando según sea necesario, de modo que el punto donde el alambre de Kirschner sale de la tibia sea completamente visible, y pase una aguja de Keith acortada de no más de dos pulgadas de longitud a través del túnel óseo femoral. Ahora pase los dos extremos de la sutura desde un extremo del injerto a través del ojo de una aguja y utilice la aguja para introducir un extremo del injerto a través del túnel femoral.

Luego, use la aguja para pasar el otro extremo del injerto a través del túnel tibial utilizando un hilo de Vicryl de calibre cuatro cero. A continuación, fije el extremo femoral del injerto al tejido blando circundante con un punto en ocho, manteniendo la rodilla en extensión para crear tensión manual en el injerto. Utilice otro punto en ocho para fijar el extremo tibial del injerto al tejido blando circundante, cortando el exceso de injerto en ambos extremos con un par de tijeras y dejando uno o dos milímetros en cada extremo más allá del punto.

Finalmente, extienda la rodilla y reduzca la rótula. Luego, utilizando una sutura de Vicryl 4-0, coloque una sola puntada en figura de ocho para cerrar la cápsula articular medial, evitando la subluxación lateral de la rótula, y cierre la piel con una sutura subcuticular continua de Monocryl o Vicryl 5-0. A las 16 semanas posteriores a la reconstrucción, el análisis histológico de la sección de la rodilla demuestra que la matriz del andamiaje se encuentra ampliamente infiltrada por fibroblastos, que secretan colágeno eosinófilo con buena integración en los túneles óseos.

En este experimento, las propiedades biomecánicas de la articulación se evaluaron inmediatamente después del sacrificio. Todas las muestras analizadas fallaron en la sustancia media, utilizando curvas de bajo desplazamiento generadas a partir de pruebas de tracción. Se calcularon la carga de falla y la rigidez para cada grupo.

A las 16 semanas posteriores al implante, el injerto de polímero electroesponja había duplicado aproximadamente la carga máxima y la rigidez del injerto analizado inmediatamente después del implante. Aunque estos valores aún eran más bajos que los del LCA nativo, una vez dominada la cirugía en animales, esta puede realizarse en aproximadamente 15 minutos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar realizar un buen cierre en el que no se vea ninguna sutura desde el exterior.

Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros análisis finales, como tinciones adicionales y ensayos bioquímicos. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la ingeniería de tejidos evaluaran múltiples opciones de injertos para la reconstrucción del LCA. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo fabricar un andamio polimérico para su implantación en un modelo roedor de reconstrucción del LCA.

No olvide que trabajar con animales vivos puede ser peligroso, y que en todo momento durante este procedimiento se deben tomar precauciones como seguir las recomendaciones veterinarias y usar equipo de protección personal.