Aislamiento y caracterización de las células satélite de Músculos Rata Head Branchiomeric

El objetivo general de este procedimiento es aislar células satélite de músculos representativos que se originan en el primer, segundo y cuarto arco braquial para su cultivo en una matriz extracelular. Manchas de gel. Esto se logra diseccionando primero los músculos palatinos de masacre, digástrico y levada vli de una rata adulta joven.

En el segundo paso, las células satélite de cada muestra muscular se aíslan por enzimático, digestión y duración. A continuación, las células se cultivan en los geles de la matriz extracelular. En última instancia, el estado dinámico de la miogénesis de los cultivos celulares satélite se puede rastrear a través de la tinción de los marcadores musculares de interés.

El labio leporino y paladar hendido es una de las malformaciones craneofaciales más comunes en los seres humanos. Cuando hay una hendidura, se requiere una reparación quirúrgica para cerrar el defecto y permitir un desarrollo normal del habla, la fibrosis y la regeneración muscular defectuosa, sin embargo, pueden dificultar la recuperación funcional de los músculos del paladar blando. Después de la reparación del paladar hendido, puede demostrar un método innovador para el cultivo de células satélite recién aisladas utilizando recubrimientos de puntos de gel de matriz exo celular de solo un milímetro.

Esto evita la necesidad de expansión. Un día antes del lugar de aislamiento, la cámara de ocho pocillos se desliza en una placa de Petri de 100 milímetros y transfiere la placa a una superficie fría. Después de 10 minutos, use una micropipeta precargada para dispensar una sola gota de 10 microlitros de gel de matriz extracelular en cada pocillo.

Después de enfriar los portaobjetos durante otros siete minutos, retire por completo el gel restante y seque los pocillos a 37 grados centígrados durante la noche del día siguiente. Para diseccionar el músculo de la masacre, retira la piel de la cabeza de una rata de nueve semanas y usa agujas hipodérmicas para fijar la cabeza a su lado. En una almohadilla de silicona, aísle la glándula parótida y el nervio facial y extraiga la glándula.

A continuación, con una hoja de bisturí número 15, retire con cuidado el nervio facial. Identificar la cabeza superficial del músculo masetero. A continuación, utilice una pinza recta para separar el tendón de su origen en el proceso cigomático, seguido de un corte cuidadoso del tendón con tijeras de disección.

Con el bisturí, diseccionar la cabeza superficial de la masacre hasta su inserción en el ángulo y mitad inferior de la superficie lateral de la rama de la mandíbula. Para diseccionar el vientre posterior del músculo digástrico, fije la cabeza en posición supina con agujas y extraiga la grasa subcutánea que recubre las glándulas sublingual y submandibular. Exponga los vientres del músculo gástrico anterior y posterior, luego sujetando el tendón anterior del vientre posterior con una pinza recta cortada en diseccionar cuidadosamente el tendón hasta su origen en el toro timpánico.

Para diseccionar el músculo levada vli palatino, localice el músculo estilohaloides. Tira de él lateralmente y retira con cuidado el tejido muscular. A continuación, localizamos el tendón de la levada vli palatino que inserta el toro timpánico y lo diseccionamos cuidadosamente.

A continuación, levante el esófago por detrás de la tráquea. Identifique el área del paladar blando donde se inserta el paladar levada vli y corte el músculo. A continuación, sumerja el músculo en etanol al 70% y transfiéralo a un PBS helado suplementado con antibióticos.

Para aislar las células satélite, transfiera cada músculo a pocillos individuales de una placa de seis pocillos y corte los tejidos en pequeños trozos de dos milímetros. Teniendo cuidado de no picar demasiado los músculos. A continuación, incubar cuidadosamente los fragmentos de tejido en 2,5 mililitros de solución de pronasa al 0,1% por pocillo a 37 grados centígrados durante 60 minutos con una suave agitación cada 20 minutos.

Cuando los haces de fibra exhiben una apariencia aflojada a 2,5 mililitros de DMEM suplementado con suero de caballo y antibióticos en cada pocillo y transfieren los tejidos digeridos a tubos cónicos individuales de 15 mililitros. Gire los lodos de tejido y decante los sobrenadantes. A continuación, añada cinco mililitros de medio a cada tubo y homogeneice el tejido con una pipeta de plástico de 10 mililitros.

Vuelva a centrifugar los tejidos y transfiera los sobrenadantes a nuevos tubos cónicos de 15 mililitros. A continuación, añada cinco mililitros más de medio a los tubos y vuelva a tripular las piezas de tejido hasta que los fragmentos pasen fácilmente a través de la pipeta. Después de otra centrifugación, extraiga los sobrenadantes en los tubos correspondientes apropiados y filtre las suspensiones celulares a través de filtros de 40 micrómetros en tubos individuales de 50 mililitros.

Lave los filtros con un mililitro de DMEM para obtener la máxima recuperación celular. A continuación, centrifugar las células, volver a suspender los gránulos en fresco, medio, y contar las células para cultivar las células satélite aisladas. A continuación, diluir las suspensiones celulares a 1,5 veces 10 por las tres células por cada 10 microlitros de medio de cultivo.

A continuación, añada 10 microlitros de células en cada punto de gel de la matriz extracelular previamente preparado e incube los geles a 37 grados centígrados después de seis horas. Agregue con cuidado 400 microlitros de medio de cultivo a cada punto de gel y devuelva los portaobjetos a la incubadora. Después de tres días, iniciar la diferenciación de las células con la adición del medio de cultivo apropiado inmediatamente después del aislamiento.

Más del 90% de las células satélite recién aisladas expresan el paquete siete Para el cuarto día, el paquete siete y MyoD son expresados por las células satélite de todos los grupos musculares. Mi OG se expresa mucho al séptimo día en todos los grupos musculares. Cuatro días después de la siembra en la matriz extracelular, las células en fase de gel, las células en proliferación comienzan a fusionarse y a formar pequeños tubos de miosina multinucleados, que expresan la cadena pesada de miosina a los siete y 10 días.

Los miotubos largos y bien organizados son evidentes para el día 10. También se pueden observar espasmos del miotubo. Este protocolo permite el estudio de las células satélite originadas en los músculos de la cabeza brer y ofrece nuevas posibilidades para el tratamiento de la hendidura. Pacientes.