Name: Administración intranasal de vacunas contra la influenza recombinante en modelos de ratón quimérico para el Estudio de la mucosa Inmunidad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Aprende a evaluar la inmunidad adaptativa inducida por vacunas en modelos de ratón quimérico mediante genética inversa y análisis de flujo. Este método permite estudiar la migración de células dendríticas y la proliferación de linfocitos T CD8 positivos.

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Agradecemos a Sergio Gómez-Medina por su excelente apoyo técnico con experimentos con ratones. Este trabajo fue apoyado por fondos de la Asociación Leibniz y el Centro de Infección Leibniz. A.L. es beneficiario de una beca predoctoral de la Escuela de Graduados Leibniz.

Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo a los protocolos aprobados y siguiendo las directrices de la ley alemana de protección de los animales. Todo el personal que llevan a cabo experimentos con animales pasaron los programas de capacitación de acuerdo a la categoría B o C de la Federación de Asociaciones Europeas de animales de laboratorio de ciencias. 1. Generación de recombinante viva atenuada Vacunas contra la Influenza por genética inversa NOTA: El protocolo detallado para la generación de virus de la gripe recombinantes mediante genética inversa ha sido descrito por estudios anteriores 5 y está fuera del alcance de este informe. En pocas palabras, el rescate de las vacunas antigripales adaptadas al frío (CAV) se lleva a cabo en un gabinete de seguridad biológica de clase II bajo nivel de bioseguridad 2 (BSL2) contención, e implica los pasos que se detallan a continuación. El protocolo de transfección y la infección se deduce que de Martínez-Sobrido et al. 5. <ol><li> Generar una gripe adaptada al frío reassortantvacuna utilizando como fondo la cepa adaptada al frío A / Ann Arbor / 6/60 (H2N2), así como la hemaglutinina (HA) y neuraminidasa un modificado (NA) de la / PR / 8/34 (H1N1) cepa A ( Figura 1A). La modificación en el gen de NA consiste en una sustitución basada en PCR de una secuencia conservada en el tallo de la proteína (residuos 65 a 72) por una secuencia de ADNc corto que codifica la ovoalbúmina de pollo (OVA) péptido SIINFEKL -derivado (Figura 1B). El péptido SIINFEKL es un péptido altamente inmunodominante en el contexto de la H-2b MHC de clase de respuesta de ratones C57BL / 6 12 I-restringido. </li><li> Placa 10 6 293T células por pocillo en placas de 6 pocillos utilizando DMEM 10% de suero bovino fetal (FBS) suplementado con 1% de penicilina / estreptomicina (P / E). </li><li> Preparar la mezcla de transfección del plásmido: Añadir 1 g de cada uno de los plásmidos que codifican los ADNc de PB2, PB1, PA, NP, M, NS de la gripe A / Ann Arbor / 6/60 cepa y 1 g de los plásmidos que codifican para la NA -SIINFEKL yHA de la gripe A / PR / 8/34. Agregar pre-calentado OptiMEM (15 l para un volumen final de 100 l / pocillo). </li><li> Incubar la mezcla de transfección durante 30 min a TA. </li><li> Añadir 100 l de mezcla de transfección / pocillo y se incuba durante 16 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Cambie medio celular por DMEM 0,3% de BSA 1% P / E a 33 ° C y 5% de CO 2 durante 5 horas. </li><li> Añadir 10 6 influenza células MDCK permisivas en DMSO que contiene 1 mg / ml de tripsina de páncreas bovino tratado con L-1-tosilamida-2-feniletil clorometil cetona (TPCK-tripsina). Mantener los co-cultivos 293T-MDCK de 2 - 3 días a 33 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Recoger los sobrenadantes de células MDCK-293T co-cultivos y clara por centrifugación a 260 xg durante 5 min. </li><li> Inocular 9-10 días de edad huevos embrionados de pollo en condiciones estériles. Para ello, hacer un agujero en la parte superior de la cáscara del huevo, como se indica por Martínez-Sobrido et al. 5. </li><li> Cubra el ingenio de la cáscara de huevoh derritió la cera utilizando un hisopo de algodón e incubar los huevos de gallina inoculados durante 3 días a 33 ° C. </li><li> Recoger el líquido alantoideo de los huevos embrionados infectados: Lávese las cáscaras de huevo con 70% de etanol. Abra el huevo con una grieta muy suavemente en la parte superior y retirar la membrana alantoideo usando pinzas estériles. Utilice una pipeta de 10 ml para recoger la mayor cantidad de líquido posible (normalmente 6-10 ml). Centrifugar a 260 xg durante 10 min a 4 ° C y transferir el fluido alantoideo aclarado a tubos nuevos. </li></ol> Inmunidad 2. Seguimiento de Vacunas específicas <ol><li> Seguimiento de las células dendríticas péptido-cojinete (PED) <ol><li> Para la vacunación de ratón, anestesiar los ratones con 5% de isoflurano en oxígeno utilizando un vaporizador de precisión. Usar una pipeta de 200 l para administrar 50 l de PBS que contienen 10 3 unidades formadoras de placa (pfu) de la vacuna que expresa el péptido SIINFEKL a través de gotitas directamente a las fosas nasales del ratón. </li><li> Tres días después de la vacunación, euthanizratones E a través de la anestesia con isoflurano seguido por dislocación cervical. </li><li> Levante la piel del ratón en la línea media justo debajo de la caja torácica con pinzas y cortar una pequeña incisión a través de la piel con unas tijeras. Desde el punto de incisión, hacen unos 3-5 cm de largo cortar a través de la piel hacia la cabeza y la cola, a continuación, dos incisiones 2 cm de la línea media lateralmente desde cada extremo. Pele la piel para revelar las cavidades peritoneal y torácica. Corte cuidadosamente a través de las membranas que rodean el peritoneo para exponer el tórax. </li><li> Para acceder a la mediastino cortó el diafragma y la parte inferior de la caja torácica. Encontrar y eliminar 2 ganglios linfáticos mediastínicos (MLN), ligeramente dorsal y lateralmente adyacente a la timo, medialmente adyacente a la arteria braquiocefálica, cerca del lado ventral de la tráquea. </li><li> Para cosechar los MLNs utilizan pinzas curvas. Coloque fórceps debajo de los ganglios linfáticos y tirar de ellos suavemente. Coloca los ganglios linfáticos en una placa de 6 pocillos que contienen 1 ml de DMEM y quitar cualquier connecticinco o tejido graso que rodea el nodo. <ol><li> Se burlan de cada muestra a fondo con dos agujas 26 G unidas a 1 ml jeringas. Para burlarse de los ganglios linfáticos, mantenga hacia abajo con una aguja mientras que romper abierto el ganglio linfático con la otra aguja. Cuando esto se hace correctamente, las células concentradas de ruptura del ganglio linfático se observan fácilmente en los medios. Pasar todo el material de tejido a través de un filtro de nylon de 70 micras para obtener suspensiones de células individuales. </li></ol></li><li> Suspensiones de células individuales Centrifugar durante 10 min a 260 xg en una centrífuga refrigerada. Resuspender el pellet de células en 2 ml de glóbulos rojos lisis (RbCl) Buffer para lisar las células rojas de la sangre. Permitir la lisis de proceder durante 3 min a RT. </li><li> Neutralizar tampón rbcL a través de centrifugación y resuspensión de células en 2 ml de PBS enfriado en hielo. </li><li> Células de la placa en placas de 96 pocillos en forma de U a una concentración de 10 7 células / ml en un volumen final de 100 microlitros. </li><li> Para el análisis de citometría de flujo, teléfonos bloque de receptores Fc usando1 g de anticuerpos anti-ratón CD16 / CD32 por 10 6 células para 15 min en hielo. </li><li> Placas de centrífuga y descartan los sobrenadantes por placa parpadeo. Incubar los pocillos individuales con la combinación anticuerpo de superficie de la elección. Típicamente, para la detección de células dendríticas en los ganglios linfáticos, el cóctel de anticuerpos debe incluir: 0,25 g de anti-CD11c, 0,25 g de CD11b, 0,5 g de MHC de clase II, 0,25 g de CD103 y 0,15 g de CD8a en un volumen final de 100 l. </li><li> Para gating negativo, añadir 0,25 g de anti-CD3, CD19, NK1.1 o un cóctel linaje (Figura 2A). Estrategias de compuerta alternativos, así como los protocolos de indemnización adecuada de múltiples tintes fluorescentes se pueden encontrar en la página web del Proyecto Genoma inmunológica. Además de los marcadores de superficie de elección, añadir 1 g de un anticuerpo contra H-2K b unido a SIINFEKL al cóctel. Este anticuerpo disponible comercialmente permitirá la visualización de países en desarrollo in el que el péptido SIINFEKL se une a la superficie de MHC de clase I. </li><li> Se incuban las células con anticuerpos de superficie durante 30 min en hielo. Proteja la placa de la luz. Placas centrifugar a 260 xg durante 5 minutos y lavar con 2 ml de PBS dos veces. Transferir las células a tubos de citometría de flujo para el análisis. </li></ol></li><li> Evaluación de la vacuna específica de la proliferación de células T <ol><li> Obtener células T del donante disponible comercialmente a partir de ratones transgénicos TCR (ratones OT-I) (C57BL / 6-Tg (TCR aTcrb) 1100Mjb / J) en la que todas las células T CD8 generados son específicos para el péptido SIINFEKL. La eutanasia a los ratones por la anestesia con isoflurano seguido por dislocación cervical. Cosecha bazo mediante la realización de una incisión en la cavidad abdominal. Coloque bazo / s en 2 ml de DMEM / bazo y eliminar el tejido conectivo y grasa. </li><li> Generar suspensiones de células individuales de bazo tras el procedimiento descrito en 2.1.2 y 2.1.3. </li><li> Para enriquecer aún más la suspensión de células individuales en las células T, aplicar protocolos de separación de cuentas magnéticautilizando cualquiera de los procedimientos de selección positivos o negativos 12. Para diferenciar donante de células receptoras, utilice congenic ratones modo que por ejemplo los ratones receptores expresan el marcador leucocitario CD45.1 mientras que las células T del donante expresan CD45.2 12. </li><li> Para etiquetar las células T, se incuban en 1 ml de PBS que contenía 5 mM de carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) en una densidad óptima de la célula de 5 x 10 6 células / ml. Se incuban las células durante 20 min a 37 ° C protegido de la exposición a la luz. Después de la incubación, centrifugar las células a 260 xg durante 5 min, el sobrenadante de descarte, y Resuspender las células en 3 ml de suero fetal bovino (FBS) para neutralizar CFSE. </li><li> Centrifugar las células a 260 xg durante 10 min y resuspender en el volumen adecuado de PBS de manera que 100 l de solución contiene 2 x 10 6 células. Infundir congenic ratones receptores con 2 x 10 6 células / ratón a través de la inyección seno retro-orbital 13. </li><li> La eutanasia a los ratones receptores en los días 3, 4 y 5 post-vacunación usando anestesia con isoflurano, seguido por dislocación cervical. Cosecha de los ganglios linfáticos del mediastino y preparar suspensiones de células individuales para citometría de flujo como se indica en 2.1.2-2.1.5. </li><li> Identificar las células del donante por tinción de las suspensiones de células individuales en 100 l de un cóctel de anticuerpos que contiene: 0,25 g de anti-CD3 de ratón, anticuerpos CD4 y CD8; 0,5 g de anti-ratón CD45.1 o anticuerpo CD45.2 (dependiendo del fenotipo de las células del donante). Deje el canal FL-1 del citómetro de flujo abierto (FITC) para determinar el perfil de dilución de CFSE 12 (Figura 2B). </li></ol></li></ol> 3. Los ratones quiméricos para diseccionar Respuestas vacuna-Gene específica NOTA: La generación de quimeras de médula ósea competitivos utilizando modelos de ratón con sede en DTR permite la discriminación de las funciones de las células específicas durante la respuesta inmune a las vacunas. Aquí mostramos una estrategia adicional por el cual combinación de DTR-expresión de los donantes cells con células de ratones knockout permisos para estudiar las funciones específicas de genes durante la inmunidad en compartimentos celulares específicos. En el ejemplo que generamos ratones con deleción específica de Toll-like receptor 3 (TLR3) en Langerin + CD103 + DC. <ol><li> Preparación de células de donante de médula ósea <ol><li> Trabajar bajo un gabinete de bioseguridad de nivel II. Evite la contaminación mediante el uso de instrumentos autoclave exclusivamente. </li><li> Para generar ratones quiméricos de la médula ósea, utilizar CD45.1 + congenic C57BL / 6 ratones hembra como receptores, y el uso de TLR3 - / -, Langerin-DTR / EGFP, o peso de los ratones que expresan CD45.2 + como donantes. El uso de donantes y receptores ratones congenic permite la diferenciación de las células donantes y receptores a través de citometría de flujo y esto permite que el injerto a ser evaluado. </li><li> Para obtener células de médula ósea de donantes, la eutanasia a los ratones donantes con anestesia con isoflurano seguido por dislocación cervical. Con unas tijeras afiladas realizan incisiones alrededor de los tobillos para que el mmusculatura ouse está expuesto. </li><li> Uso de fórceps romos tirar la piel del ratón y de la piel con suavidad desde el tobillo hacia las caderas de manera que los músculos de las piernas son visibles. </li><li> Con unas tijeras afiladas cortar las piernas del ratón a la altura de las caderas y por encima de la cabeza del fémur. </li><li> Coloque las piernas en una placa de Petri y en hielo. Trabaja rápido y eliminar todos los músculos para exponer los huesos. </li><li> Fémures y tibias independientes. Coloque los huesos en una solución de etanol al 70% durante 5 min para eliminar posibles bacterias y colocarlos inmediatamente en otra placa de Petri que contiene 5 ml de DMEM libre de suero. Termina el hueso Cortar con unas tijeras afiladas y lave la médula ósea en el DMEM. Para ello, a ras 1 ml de DMEM en el hueso mediante la inserción de una aguja de 26 G unida a una jeringa de 5 ml. Asegúrese de que los huesos se ven de color blanco (vacío) después de lavado. </li><li> Recoger todas las células de médula ósea de ratones donantes en 10 ml de DMEM. Generar suspensiones de células individuales de células de médula ósea pasando la cosecha a través de un filtro de células de 70 micras. </li><li> Cloído suspensiones de células individuales de células de médula ósea por centrifugación a 260 xg durante 10 min a 4 ° C en una centrífuga refrigerada. Resuspender el sedimento celular en 10 ml de PBS. Agotar las células rojas de la sangre utilizando solución RbCl como se describe en 2.1.3 y 2.1.4. </li><li> Recuento de células de médula ósea utilizando un hemocitómetro o un contador de células automatizado. Evaluar la viabilidad celular mediante la determinación de las células muertas mediante tinción con azul de tripano 13. De manera óptima, los rendimientos de uno de los animales individuales alrededor de 3 x 10 7 células blancas de la sangre / ratón con una viabilidad de por lo menos 80%. </li><li> En el caso de quimeras de médula ósea totales, preparar TLR-3 - células o en peso de donantes - /. La concentración celular óptima es de 2 x 10 7 células / ml desde 2 x 10 6 células en 100 l de PBS serán utilizados para el trasplante. Si no se utiliza inmediatamente, conservar las células del donante a -80 ° C, utilizando técnicas de congelación lenta y FBS con DMSO al 10%. Para el modelo quimérico mixta, mezclar células Langerin-DTR-donantes y TLR3 - / - </sup&gt; Células del donante en una relación de 75:25. Preparar una mezcla de 75: 25 Langerin-DTR: wt células de médula ósea para generar ratones de control. </li></ol></li><li> Irradiación del ratón y el trasplante <ol><li> Irradiar ratones hembras entre 6-8 semanas de edad en un irradiador fuente de Cesio-137. Dé ratones dos dosis de 550 rad 4 horas de diferencia. Irradiación de Split minimiza la toxicidad hepática aguda y por lo tanto reduce la letalidad del ratón debido al protocolo de irradiación. </li><li> Después de la irradiación, mantener los ratones bajo tratamiento con antibióticos durante dos semanas. Dar antibióticos con el agua de bebida a 2,5-5 mg de Baytril / kg. </li><li> 2-4 horas después de la segunda irradiación, los ratones trasplantados con células de la médula ósea del donante por vía intravenosa. Realizar la inyección de células del donante a través de inyección seno retro-orbital 13 y bajo anestesia con isoflurano usando volumen máximo de 100 l de PBS que contenía 2 x 10 6 células. </li><li> Cuatro semanas después del trasplante, injerto evaluar en una muestra de 100l de sangre periférica mediante citometría de flujo utilizando una máquina capaz de leer al menos dos colores. Para distinguir entre el donante y las células receptoras de radio-resistentes, utilizar comercialmente disponible CD45.1 marcado con fluorescencia y CD45.2 anticuerpos anti-ratón utilizando diluciones entre 1/100 y 1/200. Injerto óptimo de las células del donante debe ser de al menos el 80% de las células hematopoyéticas totales en sangre periférica. </li></ol></li><li> Agotamiento de Vacunación y específica <ol><li> Vacunar a los ratones con la vacuna de la influenza viva atenuada recombinante vía intranasal. Para la vacunación de ratón, anestesiar los ratones con 5% de isoflurano en oxígeno utilizando un vaporizador de precisión. Usar una pipeta de 200 l para administrar 50 l de PBS que contienen 10 3 unidades formadoras de placa (pfu) de la vacuna. </li><li> Para generar el modelo final ratón, el tratamiento de ratones con 50 ng de DT diluido en 50 l de PBS por vía intranasal. Administrar gota a gota DT directamente a las fosas nasales de los ratones anestesiados como se describe en 3.3.1. Mi Tratarce con dosis diarias que comienzan el tratamiento en días -2 antes de la vacunación hasta el día 2 después de la vacunación (Figura 3B). </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este estudio se describe cómo la genética y modelos de ratones quiméricos inversa puede ser utilizado para dilucidar los mecanismos fisiológicos y moleculares de la inmunidad inducida por la vacuna. Genética inversa influenza se establece en muchos laboratorios y ha jugado un papel principal en la comprensión de la patogénesis de la gripe, la replicación y la transmisión 17. Un punto clave en nuestro protocolo es el rescate de las vacunas antigripales adaptadas al frío que expresan epítopos extraños. Aunqu...

La generación de memoria inmunológica en ausencia de enfermedad es la base fisiológica de la vacunación eficiente 1. Recientemente, los sistemas de enfoques basados ​​en la biología han revelado que las vacunas exitosas, como la vacuna contra la fiebre amarilla, inducen una fuerte inducción de la respuesta inmune innata y la activación de varios subconjuntos de células dendríticas (DC), que a su vez, conducen a la activación del antígeno multilinaje células T específicas 2,3. Desde los DC son la única población de células inmunes con la capacidad de activar las células T vírgenes de antígenos específicos de 4, el estudio de su función durante la vacunación es fundamental para entender la respuesta inmune a las vacunas y diseñar estrategias de futuro frente a patógenos desafiantes. Un sistema que permita el seguimiento de diferentes subconjuntos DCs durante las respuestas inmunes a las vacunas sería deseable con el fin de establecer una cinética precisos de la migración DC a los tejidos linfoides, y por lo tanto para proporcionarinformación sobre los mecanismos fisiológicos responsables de la iniciación de la inmunidad adaptativa-vacuna específica. Genética basada inversas enfoques ofrecen la posibilidad de generar modificado, las vacunas vivas atenuadas que se pueden utilizar experimentalmente con este propósito. Desde su puesta en práctica en la investigación de la gripe, la genética inversa basada en plásmidos se ha empleado ampliamente para generar cepas de la gripe recombinantes incluyendo LAIVs. Los protocolos estándar para rescatar virus de la gripe recombinantes requieren multi-transfección de líneas celulares altamente transfectables con plásmidos ambisense (produciendo tanto ARN de sentido positivo y negativo) que contienen los segmentos virales de la influenza ocho, así como la amplificación en un sistema permisivo tal como Madin-Darby de riñón canino ( células MDCK) y / o de pollo huevos embrionados 5. Sin embargo, la aplicación de genética inversa para generar herramientas moleculares con el fin de estudiar los mecanismos inmunes de la vacunación permanece sin explorar. La generaciónde nuevos modelos de ratón que permite el agotamiento específico de subconjuntos de células inmunes, incluyendo las DC, ha abierto nuevas posibilidades para comprender los mecanismos inmunológicos básicos subyacentes protección de la vacuna-suscitó. La comparación entre las funciones de subconjuntos de DC en ratones y seres humanos ha revelado que, en gran medida, ratón y humanos DCs son funcionalmente homóloga 6,7, estos hallazgos, fuertemente sugieren que el desarrollo de modelos de ratón que permite el agotamiento específico de DCs en el estado estacionario y durante condiciones inflamatorias, puede servir para entender la fisiología de las respuestas de CC en los seres humanos. En los últimos años una serie de modelos de ratones se han generado que llevan transgenes que expresan el receptor de la toxina de la difteria de simio (DT) (DTR) bajo el control de la región promotora de un gen de interés 8,9. Desde tejidos de ratón no expresan naturalmente DTR, estos modelos permiten el agotamiento condicional de subconjuntos de células que portan el gen diana de interés sobre la inoculación al ratón con DT. Por lo tanto, nuestra ability para agotar DCs específicos y otros leucocitos en vivo durante los procesos fisiológicos, se ha mejorado en gran medida por el desarrollo de ro a base de DTR. Sin embargo, mientras que estos modelos de ratones transgénicos se han utilizado ampliamente para entender la ontogenia del sistema inmune, su aplicación para el desarrollo de vacunas ha sido apenas probado. Aquí, mediante la combinación de genética inversa de la gripe y quimeras de médula ósea competitivos basados-DTR, proponemos un método para estudiar la cinética de la inmunidad de la vacuna, así como la función del gen individual durante la respuesta inmune a las vacunas en vivo. La aplicación de esta tecnología para la evaluación preclínica de nuevas vacunas contra enfermedades infecciosas desafiantes podría ayudar a racionalizar el diseño de vacunas y probar vacunas candidatas en vivo.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&agudo; s Medio Eagle modificado (DMEM 1x)</td><td>Gibco RL-Life Technologies</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Gibco RL-Life Technologies</td><td>31985-047</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen-Life Technologies</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/ml)</td><td>PAA</td><td>p11-010</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Huevos embrionados</td><td>Valo biomedia Gmbh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; M Filtros de nylon</td><td>Greiner-Biorad</td><td>542-070</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lisado de glóbulos rojos (RBCL) 10x</td><td>BD Bioscience</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>Ratón CD16/CD32 BD Fc Block (2.4G2)</td><td>BD Pharmigen</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>APC-Anti-ratón SIINFEKL-H2kb (25 D1.16)</td><td>Biolegend</td><td>141605</td><td></td></tr><tr><td>PE-Anti-ratón CD11c (HLA3)</td><td>BD Biosciences</td><td>553802</td><td></td></tr><tr><td>eFluor 450-Anti-ratón MHCII (Md/114.15.2)</td><td>eBioscience</td><td>48-5321-82</td><td></td></tr><tr><td>Pe-Cy7-Anti-ratón CD11b (M1/70)</td><td>Biolegend</td><td>101216</td><td></td></tr><tr><td>PerCp/Cy5.5-Anti-ratón CD103 (2E7)</td><td>Biolegend</td><td>121416</td><td></td></tr><tr><td>PE-Anti-ratón CD45.1 (A20)</td><td>eBioscience</td><td>12-0453-82</td><td></td></tr><tr><td>V500-Anti-ratón CD45.2 (1O4)</td><td>BD Bioscience</td><td>562130</td><td></td></tr><tr><td>PerCp-eFluor710 -Anti-ratón CD8a (53-6.7)</td><td>eBioscience</td><td>46-0081-80</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7-Anti-ratón CD3&épsilon; (145-2611)</td><td>Biolegend</td><td>100325</td><td></td></tr><tr><td>eFluor450-Anti-ratón CD4 (GK 1.5)</td><td>eBioscience</td><td>48-0041-80</td><td></td></tr><tr><td>CFSE Colorante de proliferación</td><td>eBioscience</td><td>65-0850-85</td><td></td></tr><tr><td>Baytril 2.5%</td><td>Bayer</td><td>65-0850-85</td><td></td></tr><tr><td>Dimethil-Sulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Ovoalbúmina&nbsp;</td><td>Sondas moleculares&nbsp;</td><td>O23020</td><td></td></tr><tr><td>Toxina diftérica (DT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0564</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-TPCK</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>BD FACsCanto II Citómetro de flujo</td><td>BD Biosciences</td> FlowJo software de <td></td><td></td></tr><tr><td>análisis celular 9.5</td><td>Flowjo inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mancha azul de tripano (0.4%)&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Contador de células automático Countess</td><td>Invitrogen-Life Technologies</td><td>C10227</td><td></td></tr></tbody></table>

administración intranasal de vacunas contra la influenza recombinante en modelos de ratón quimérico para el estudio de la mucosa inmunidad

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Las vacunas son uno de los mayores logros de la humanidad y han salvado millones de vidas durante el último siglo. Paradójicamente, se sabe poco sobre los mecanismos fisiológicos que median las respuestas inmunitarias a las vacunas, tal vez debido al éxito general de la vacunación, que ha reducido el interés en los mecanismos moleculares y fisiológicos de la inmunidad de las vacunas. Sin embargo, varios patógenos humanos importantes, incluido el virus de la gripe, siguen planteando un reto para la vacunación, y pueden beneficiarse de estrategias basadas en el sistema inmunitario. 
Aunque la genética inversa de la influenza se ha aplicado con éxito a la generación de vacunas contra la influenza vivas atenuadas (LAIV), no se ha abordado la adición de herramientas moleculares en las preparaciones de vacunas, como componentes trazadores para seguir la cinética de la vacunación in vivo. Además, la reciente generación de modelos de ratón que permiten el agotamiento específico de los leucocitos durante los estudios cinéticos ha abierto una ventana de oportunidad para comprender los mecanismos inmunitarios básicos que subyacen a la protección provocada por la vacuna. Aquí, describimos cómo la combinación de genética inversa y modelos de ratones quiméricos puede ayudar a proporcionar nuevos conocimientos sobre cómo funcionan las vacunas a nivel fisiológico y molecular, utilizando como ejemplo una vacuna contra la influenza recombinante, adaptada al frío y con virus vivos atenuados (LAIV). Utilizamos LAIVs generadas en laboratorio que albergan trazadores celulares, así como quimeras competitivas de la médula ósea (BMC) para determinar la cinética temprana de la inmunidad de la vacuna y los principales mecanismos fisiológicos responsables del inicio de la inmunidad adaptativa específica de la vacuna. Además, mostramos cómo esta técnica puede facilitar los estudios de la función génica en animales individuales durante las respuestas inmunitarias a las vacunas. Proponemos que esta técnica se puede aplicar para mejorar las estrategias profilácticas actuales contra patógenos para los que se necesitan contramedidas médicas urgentes, por ejemplo, la gripe, el VIH, el Plasmodium y los virus de la fiebre hemorrágica como el virus del Ébola.

Generación de vacunas de la gripe vivos atenuados recombinantes puede conseguirse mediante la transfección de plásmidos que codifican los ocho segmentos del virus de la gripe bajo el control de promotores bidireccionales 5. Una vacuna de la gripe adaptada al frío por lo general contiene seis segmentos de una cepa adaptada al frío, así como el HA y NA de la cepa de la gripe de elección (por ejemplo, H1N1) (Figura 1A). El principio de adaptación al frío se basa en la replicación del vi...

Hay una falta general de conocimiento sobre cómo funcionan las vacunas. Aquí proponemos el uso combinado de genética inversa y ratones quiméricos de médula ósea para obtener información sobre las respuestas inmunitarias tempranas del huésped a las vacunas, con un enfoque especial en las células dendríticas y la inmunidad de las células T.

Administración intranasal de vacunas contra la influenza recombinante en modelos de ratón quimérico para el Estudio de la mucosa Inmunidad

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

El objetivo general de este procedimiento es describir un sistema para evaluar la iniciación fisiológica de la inmunidad adaptativa específica de vacunas. Esto se logra primero mediante la genética inversa para generar vacunas vivas atenuadas contra la influenza que contienen un péptido inmunogénico específico, y luego utilizando un embrión de pollo para multiplicar el virus. A continuación, se obtienen células de los ganglios linfáticos de ratones vacunados y se utiliza análisis de fax para rastrear la migración de las células dendríticas.En el siguiente ensayo, las células T CD8 positivas reactivas al péptido inmunogénico se marcan y se inyectan en ratones vacunados, seguido de un análisis por citometría de flujo para medir la proliferación de esas células y analizar la respuesta inmunitaria con mayor detalle. Se genera un trasplante competitivo de médula ósea mediante la infusión de células de médula ósea que expresan el receptor para la toxina de la difteria en ratones conogénicos irradiados, los cuales luego se exponen a la toxina de la difteria. Tras una depleción exitosa, se vacuna al ratón y se utilizan anticuerpos marcados y tetrámeros para identificar las células T CD8 positivas.Reconociendo el péptido específico. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la vacunología, como cómo funciona una vacuna a nivel neurológico, cuáles son los principales objetivos celulares y moleculares de la vacuna, y lo más importante, cómo podemos mejorar las estrategias profilácticas actuales. Quien demostrará el procedimiento será Sanmen Medina.Nuestra responsable de laboratorio y yo generamos para este protocolo una vacuna contra la influenza reordenada y adaptada al frío utilizando la cepa adaptada al frío A Ann Arbor 6/60 como base, acoplada con la hemaglutinina y una neuraminidasa modificada de la cepa A PR 8/34.Una porción de la secuencia de la cola proteica del gen de la neuraminidasa se reemplaza con una breve secuencia de ADNc que codifica el péptido de síntesis fecal de pollo. Este péptido es altamente inmunodominante en la clase H dos del CMH y una respuesta restringida de los ratones C 57 negro seis, y funciona como un elemento rastreable.Para comenzar, plaque 1.000.002 células 93 T en cada pocillo de una placa de seis pocillos con DMEM que contenga 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina-estreptomicina. A continuación, prepare suficiente mezcla de transfección de plásmido para 100 microlitros por pocillo. Combine un microgramo de cada plásmido y complete el tubo con medio celular Opti-MEM precalentado hasta 50 microlitros en otro tubo.Añada un volumen doble de lipectomía 2000 correspondiente a la cantidad total de plásmido que se va a transfectar y complete el tubo hasta 50 microlitros con opti MEM antes de agregar la mezcla de transfección a las células. Deje reposar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, añada 100 microlitros de la mezcla de transfección a cada pocillo y coloque la placa en un incubador durante 16 horas.Al día siguiente, cambie el medio a DMEM con 0,3 %BSA y 1 %pen estrep. Luego, coloque las células a 33 grados Celsius con 5 %dióxido de carbono durante cinco horas. Después de cinco horas.Añada una capa de un millón de células permisivas para la influenza MDCK en DMEM suplementado con tripsina. Mantenga los cultivos conjuntos durante dos o tres días bajo un régimen de incubación a 33 grados Celsius para generar y amplificar el virus. Posteriormente, elimine los restos celulares mediante una centrifugación de cinco minutos a 260 G. Luego, recoja los sobrenadantes e inocule huevos embrionados de pollo de nueve a diez días de edad en condiciones estériles.Para ello, haga un orificio en la parte superior del cascarón del huevo y agregue el virus en una dilución de 100 x 10 x o una x. Cubra el cascarón del huevo con cera derretida utilizando un hisopo de algodón e incube los huevos de gallina inoculados durante tres días a 33 grados Celsius. Posteriormente, recolecte el líquido alantoico de los huevos infectados.Lave las cáscaras de huevo con etanol al 70 %. Abra el huevo con una grieta muy suave en la parte superior y retire la membrana de Toic de Alan utilizando pinzas estériles. Utilice una pipeta de 10 mililitros para recoger la mayor cantidad posible de líquido.Típicamente seis a 10 mililitros. Centrifugar el fluido a 260 gs durante 10 minutos a cuatro grados Celsius y transferir el fluido clarificado de Alan Toic a nuevos tubos. Después de anestesiar un ratón donante y acceder quirúrgicamente al mediastino, extraer los ganglios linfáticos utilizando pinzas curvas.Transfiera los ganglios linfáticos a una placa de seis pocillos que contenga un mililitro de DMEM. Después de eliminar cualquier tejido conectivo o graso que rodee el ganglio linfático, sujete el ganglio con una aguja y ábralo con la otra aguja. Esto debe provocar que las células salgan del ganglio linfático hacia el medio para recolectar las células.Primero, pase todo el material tisular a través de un filtro de nailon de 70 micrones para obtener una suspensión de células lista para la centrifugación. Reuspenda el sedimento celular en dos mililitros de tampón de lisis de glóbulos rojos. Deje que la reacción de lisis transcurra durante tres minutos a temperatura ambiente y finalícela añadiendo dos mililitros de PBS frío con hielo; a continuación, proceda a la tinción de las células según el protocolo descrito en el texto.Asegurándose de usar el golpeteo de la placa para eliminar y descartar el sobrenadante antes de la incubación con el anticuerpo. Etiquete las células T donadoras de ratones transgénicos para el TCR disponibles comercialmente, incube 5 millones de células en un mililitro de PBS con CFSE cinco micromolar. Deje que la incubación continúe durante 20 minutos a 37 grados Celsius en la oscuridad.Luego, recopile las células a 2 millones por 100 microlitros de PBS e infunda ratones congénicos receptores con una dosis de 100 microlitros mediante inyección en el seno retroorbital. Después de tres a cinco días, sacrifique los ratones, extraiga los ganglios linfáticos mediastínicos y prepare una suspensión simple de células para citometría de flujo. Como antes.Luego identifique las células donantes tiñendo las suspensiones de células individuales con un cóctel de anticuerpos. Para el análisis, deje el canal FL uno del citómetro de flujo abierto para determinar el perfil de dilución de CFSE.Después de extraer y desinfectar los tibias y fémures de un ratón sacrificado, recójalos en una placa con DMEM. Corte los extremos de los huesos utilizando tijeras afiladas y lave la médula ósea dentro del DMEM. Ahora, mediante métodos estándar, irradie ratones hembras de seis a ocho semanas de edad utilizando un irradiador con fuente de cesio-137. De dos a cuatro horas después de la irradiación, anestesie los ratones y transplante células de médula ósea donante mediante una inyección en el seno retroorbital de 2 millones de células en 100 microlitros de PBS. Durante las próximas dos semanas, suministre a los ratones de 2,5 a 5 miligramos de Baal por kilogramo en su agua de bebida.Dos días antes de la vacunación, administre 50 nanogramos de DT diluidos en 50 microlitros de PBS gota a gota directamente en las fosas nasales de ratones anestesiados. Continúe este tratamiento durante tres días posteriores a la vacunación. Consulte el protocolo escrito para obtener los detalles sobre cómo generar el modelo final de ratón.Vacune a los ratones con influenza atenuada recombinante utilizando una inyección intranasal bajo anestesia. Administre 1000 UFP de vacuna proveniente de una pipeta de 200 microlitros en 50 microlitros de PBS. La generación de vacunas recombinantes contra la influenza atenuadas puede lograrse mediante la transfección de plásmidos que codifican los ocho segmentos del virus de la influenza bajo el control de promotores bidireccionales. Una vacuna contra la influenza adaptada al frío generalmente contiene seis segmentos de una cepa adaptada al frío, así como las proteínas HA y NA de la cepa de influenza de elección, como H uno N uno.La adaptación al frío permite la replicación restringida del virus a 33 grados Celsius, la temperatura del tracto respiratorio superior en ratones y humanos, pero no permite la replicación en el tracto respiratorio inferior, por lo que no puede provocar fusión neumónica. Se utilizó PCR para reemplazar una región conservada en el tallo de la neuraminidasa viral con un péptido derivado de OVA rastreable. El modelo con péptido rastreable se inoculó en ratones entre tres y seis días posteriores a la vacunación.La proteína rastreable syn fecal se detectó en los ganglios linfáticos drenantes del pulmón. Se utilizó citometría de flujo multiparamétrica para cuantificar en tiempo real la presentación de antígenos derivados de la vacuna. Asimismo, la infusión de linfocitos T específicos contra syn fecal permitió cuantificar las respuestas de linfocitos T CD8 específicas de la vacuna para evaluar funciones específicas de genes durante la vacunación.Se utilizó un modelo de ratón que combina la tecnología DTR y la trasplante competitivo de médula ósea. De este modo, la pérdida de la función génica se dirigió a compartimentos celulares específicos durante las respuestas inmunitarias a la vacunación. Después de ver este video, tendrá una buena comprensión de cómo analizar las vías moleculares y fisiológicas involucradas en la modulación de la inmunidad inducida por vacunas en el huésped.Además, esta técnica proporcionará nuevas perspectivas en la determinación de los objetivos celulares de la vacuna, avanzando así en la evaluación de nuevas plataformas de vacunas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: Lenhard, A. et al. Un modelo murino para la transición de Streptococcus pneumoniae de colonizador a patógeno tras la coinfección viral recapitula la enfermedad agravada por la edad. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo muestra un modelo de coinfección en ratones en el que el virus de la gripe desencadena la transición de Streptococcus pneumoniae de colonizador a patógeno. Detalla los pasos implicados en la colonización bacteriana, la infección viral y la progresión de la enfermedad.

Un modelo murino para estudiar la transición patógena de Streptococcus pneumoniae tras la coinfección viral

Source: Wang, M., et al, Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates intranasal infection of a mouse with a pathogenic influenza virus to establish a respiratory tract infection. The procedure outlines the administration of the virus into the nasal cavity. The virus enters host cells, replicates, and activates the immune system.

Intranasal Infection of a Mouse with a Pathogenic Influenza Virus

Este video muestra la inmunización intranasal con BCG en ratones, activando tanto las respuestas inmunitarias innatas como las adaptativas, lo que lleva al desarrollo de células T de memoria residentes en el pulmón y células B efectoras, mejorando así la protección contra las infecciones por Mycobacterium.

Inmunización intranasal con BCG en un modelo de ratón

El video muestra un método para crear virus de influenza recombinantes adaptados al frío. Consiste en transfectar células humanas con plásmidos bidireccionales, seguido de una incubación a baja temperatura para producir virus adecuados para la producción de vacunas, caracterizada por una replicación reducida en condiciones más cálidas.

Generación de virus vivos atenuados recombinantes de la influenza para vacunas

Demostramos el procedimiento para la inoculación intratraqueal de Haemophilus influenzae en las vías respiratorias inferiores de ratones. Se trata de una herramienta muy útil para estudiar las vías de señalización que regulan la inflamación de las vías respiratorias en modelos de ratón.

Administración intra-traqueal de<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; En modelos de ratón para estudiar las vías respiratorias inflamación

Virus de la gripe A (gripe) son importantes patógenos respiratorios humanos. Para entender la patogenicidad de gripe y realizar ensayos preclínicos de vacunas nuevos enfoques, modelos animales, imitar la fisiología humana se requieren. Aquí, describimos las técnicas para evaluar el IAV patogenia, respuesta humoral y eficacia de la vacuna utilizando un modelo murino de infección.

Estudios de Virus de influenza A en un modelo murino de infección

En este estudio, presentamos un protocolo para realizar dos fotones intravital proyección de imagen y de la célula análisis de interacción en la mucosa traqueal murina después de la infección con virus de la gripe. Este Protocolo será relevante para los investigadores que estudian la dinámica celular inmune durante las infecciones respiratorias.

Proyección de imagen de interacción de células en Mucosa traqueal durante la infección del Virus de la Influenza usando microscopia Intravital de dos fotones

Aquí presentamos un elegante protocolo para la evaluación en vivo de la vacuna eficacia y anfitrión inmunorespuestas. Este protocolo puede ser adaptado para modelos de vacuna que estudian viral, bacteriana o parásitos patógenos.

Evaluación de las respuestas del huésped-patógeno y eficacia de la vacuna en ratones

Este documento describe los protocolos de evaluación de la respuesta Tfh y GC B en el modelo de ratón de infección por el virus de la gripe.

Evaluación de las células auxiliares foliculares T y la respuesta del centro germinal durante la infección por el virus de la gripe A en ratones

Este protocolo proporciona instrucciones para la administración intranasal de IAV y el análisis posterior del daño pulmonar del ratón y los cambios transcripcionales asociados a los tipos de células pulmonares.

Modelado de la reparación alveolar pulmonar displásica y funcional después de la infección por influenza

Aprende a evaluar la inmunidad adaptativa inducida por vacunas en modelos de ratón quimérico mediante genética inversa y análisis de flujo. Este método permite estudiar la migración de células dendríticas y la proliferación de linfocitos T CD8 positivos.

Administración intranasal de vacunas contra la influenza recombinante en modelos de ratón quimérico para el Estudio de la mucosa Inmunidad (Video) | JoVE Journal

Administración intranasal de vacunas contra la influenza recombinante en modelos de ratón quimérico para el Estudio de la mucosa Inmunidad

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