Name: Ex Vivo Imaging de Postnatal cerebelosa gránulo migración celular utilizando confocal Macroscopía (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Aprende a visualizar la migración de neuronas granulares en cerebelo postnatal de rata mediante macroscopía confocal. Este método permite estudiar la dinámica neuronal y factores endógenos que regulan el movimiento celular en neurociencia.

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Este trabajo fue apoyado por el Instituto para la Investigación y la Innovación en Biomedicina (IRIB), la Plataforma de imágenes de células de Normandía (PRIMACEN), Inserm, IBISA, la Universidad de Rouen, el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER - Perené, Interreg 4A), la-Neurociencias LARC Red y la región de Haute-Normandie.

Animales (hombre o ratas Wistar hembras) nacieron y se criaron en un animalario acreditado (aprobación B.76-451-04), según el libro de francés para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Los experimentos se llevaron a cabo bajo la supervisión de investigadores autorizados (MB, DV y LG), de conformidad con la Directiva Europea Consejo de la Comunidad (2010/63 / UE de 22 de septiembre de 2010) y el Ministerio de Agricultura francés. 1. Preparación de Medios y Herramientas <ol><li> En una cabina de seguridad biológica, preparar BSS de Hank 1x (HBSS) en agua estéril de 10x solución madre que contiene CaCl2 (1,85 g / l) / MgSO4 (0,9767 g / l), sin MgCl2. Añadir NaHCO3 (350 g / ml) a 1x solución de HBSS. </li><li> En una cabina de seguridad biológica, añadir suplemento N2 (de una solución madre 100x) y penicilina (100 unidades / ml) -streptomycin (0,1 mg / ml) solución a medio Eagle modificado (DMEM) mezcla de nutrientes de Dulbeccotura F-12 (1: 1). </li><li> En condiciones estériles, preparar una alícuota (25 l, 2 mM) de la citoplásmico colorante fluorescente llamado Cell Rastreador verde en DMSO (1,075 ml para 1 mg). Diluir una alícuota en 5 ml de DMEM en un tubo cónico de 15 ml. </li><li> Preparar lleno cubo de hielo para mantener los medios de comunicación a 4 ° C. </li><li> Descontaminar mesas de trabajo de laboratorio y herramientas con etanol al 70%. </li></ol> 2. Disección de cerebelo de ratas P10 <ol><li> Rápidamente decapitar a crías de rata (P10) con tijeras curvas de funcionamiento detrás de las orejas con el fin de obtener el comienzo de la médula espinal. </li><li> En la parte posterior del lado de la cabeza decapitada, que la línea media de la incisión de la piel desde el cuello hasta la nariz con iris tijeras finas y se separa la piel del cráneo con iris finas tijeras y Dumont # 3 fórceps. </li><li> Con unas tijeras finas iris para hacer delicadamente dos incisiones laterales desde la base hasta la región rostral del cráneo. Retire el cráneo disecado con dos # 3 fórceps. Separe el sujetadordesde cualquier adherencia con el cráneo con las mismas pinzas. </li><li> Transferir el cerebro con el extremo cuchara de una espátula para placa de Petri (Ø 35 mm) que contiene 2 ml de medio HBSS enfriado con hielo. </li><li> Coloque la placa de Petri que contiene el cerebro en un plato más grande Petri (Ø 100 mm), lleno de hielo y traslado a la etapa del microscopio estereoscópico. </li><li> Bajo un microscopio estereoscópico, aislar el cerebelo del cerebro por dilaceración utilizando dos # 3 fórceps. Del mismo modo, eliminar la médula espinal residual y el pial-membrana. </li><li> Transferir el cerebelo en una nueva placa de Petri llena de HBSS (Ø 35 mm, 2 ml) con el extremo cuchara de una espátula y mantener en hielo. </li></ol> 3. Preparación de rebanadas cerebelosa aguda <ol><li> Bajo el microscopio estereoscópico, cortar el cerebelo entre los vermis y el hemisferio derecho como se indica por las dos cabezas de flecha en la figura 2A con un estándar de mango de bisturí # 3 sólido y una cuchilla quirúrgica # 15. </li><li> Ponga una gota de cianpegamento oacrylate en la platina vibratome y esperar 15-25 segundos para eliminar los vapores de solventes tóxicos. </li><li> Recoger el cerebelo corte con el extremo cuchara de una espátula y retirar el exceso de HBSS con toallas de papel limpias. </li><li> Traiga el cerebelo cerca del platina. Fijar el borde del corte de la platina y esperar 10 seg. </li><li> Inserte el disco en la bandeja de muestra de tampón con el manipulador, y girarla de manera que el eje transversal del cerebelo es perpendicular al soporte de la cuchilla. Fijar la platina con una llave Allen y rellene suavemente el baño tampón con medio HBSS hasta el cerebelo está cubierto. </li><li> Cargar hielo triturado en el baño de enfriamiento. </li><li> Limpiar la cuchilla tres veces con etanol al 70% para eliminar cualquier aceite. </li><li> Inserte la hoja en el soporte de la cuchilla y asegure con el tornillo de fijación. </li><li> Coloque el filo de la cuchilla derecha detrás del borde posterior (a la vista del usuario) de la muestra y definirlo como un punto de partida. Utilice adelante comandar definir tque el punto final después de que el borde frontal de la muestra. </li><li> Seleccione seccionar velocidad a 2,5 y seccionar frecuencia a 8. Seleccione el grosor de recorte a 180 micras. Iniciar seccionamiento de tejidos. </li><li> Recoge cada sección usando un vaso de gran calibre truncado pipeta Pasteur y traslado al HBSS que contienen placa de Petri (Ø 35 mm) se mantuvieron en hielo. </li><li> El uso de dos # 5 fórceps, eliminar las meninges cuidadosamente desde el cerebelo cuando interferir con la cuchilla. Reunir un máximo de 5 rebanadas por cerebelo (Figura 2B, C). </li><li> Retire las meninges de las rebanadas del cerebelo cuidadosamente con dos # 5 pinzas bajo el microscopio estereoscópico y separar los lóbulos suavemente para una mejor carga de la sonda. </li></ol> 4. fluorescente tinción de interneuronas de Vida <ol><li> Traslado rebanadas del cerebelo con una pipeta Pasteur de vidrio de gran calibre truncado a una placa de 6 pocillos (máx 3 rebanadas / por pocillo). Aspirar el medio HBSS. </li><li> Incubar las rebanadas (3 como máximo) en 5 ml de loading solución del colorante fluorescente (10 M). </li><li> Para protegerlo de la luz, cubrir la microplaca con papel de aluminio. Póngalo en una mesa de giro-en movimiento a 35 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente para facilitar el etiquetado celular. </li><li> Rodajas de transferencia sobre la membrana de un Transwell Insert (3,0 micras de tamaño de poro; Figura 2D) con una pipeta Pasteur de vidrio de gran calibre truncado. Aspirar el medio de carga con pipeta. </li><li> Retire el inserto y llenar el pozo con 1,9 ml de DMEM. Reemplazar el inserto y añadir 100 l de DMEM en la parte superior de la rebanada para cubrir el tejido. </li><li> Coloque la placa que contiene los insertos de cultivo en la cámara de la incubadora (37 ° C, 5% de CO 2) durante 2 horas, que es suficiente para observar los GC en el ML. Acuéstese tejidos planos para permitir la unión en la membrana de inserción (Figura 2E). Asegúrese de que las rebanadas no están secando. </li></ol> 5. Ex vivo Imaging través confocal Macroscopía <ol><li> Transferir el plato sinla tapa de plástico en una incubadora unido al soporte de un macroscopio confocal. Coloque una cubierta de vidrio en la placa de inserción del macroscopio. Mantenga la temperatura de la cámara de 37.0 ° C ± 0,5 ° C, y suministramos las rebanadas con un flujo constante de gas (95% O 2, 5% de CO 2) a través de la inserción de la placa para mantener el pH constante. Espere 2 horas más antes de experimento de lapso de tiempo. </li><li> Para visualizar la distancia de migración de GC en los cortes de tejido, iluminar la preparación con una luz de longitud de onda de 488 nm por medio de un diodo láser a través de un macroscopio láser confocal de barrido equipado con un objetivo seco X2 (de trabajo: 39 mm, diámetro: 58 mm, NA = 0,234), y detectar la emisión de fluorescencia desde 500 hasta 530 nm. <ol><li> Para resolver finamente el movimiento de los GC, adquirir imágenes con un factor de zoom óptico adicional de 1,5 a 2,0. Recoge imágenes de BN en un solo plano focal o hasta 10 planos focales diferentes a lo largo del eje z cada 30 min durante un máximo de 12 horas. </li></ol></li&gt; <li> Cuando es necesario, retire la cubierta de cristal y añadir pequeños volúmenes (1-10 mu l) de activadores biológicos o inhibidores en DMEM con una pipeta de 10 l para estudiar su efecto sobre la migración de GC. </li></ol> Seguimiento 6. celular <ol><li> Para cada momento de la película, realice la proyección z-pila a través del modo de tipo ecart en ImageJ. Modular el contraste y los niveles de brillo de las imágenes sucesivas para facilitar la identificación y el seguimiento de los GC etiquetados. Mapa manualmente cada posición en la instantánea de referencia (en t = 0). <ol><li> Utilice el plugin &quot;seguimiento manual&quot; en el menú de partículas Analizar y determinar haciendo clic en el punto de cada cuerpo celular gravedad durante lapsos de tiempo. Exportar los datos de seguimiento de primas en una hoja de cálculo. </li></ol></li><li> Reorganizar los datos de seguimiento primas exportadas desde ImageJ con un programa inteligente de fabricación casera (http://primacen.fr, escrito en código PHP) que identifican a cada célula y cargos asociados. Usando el programa, calculate la distancia total recorrida y la velocidad media de la migración para cada celda. Clasificar y comparar las características de la migración celular en condiciones de control y de tratamiento bajo filtros adecuados utilizando el mismo programa. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo describe la cultura de rata P10 rebanadas cerebelosa aguda en el sistema Transwell y el marcaje fluorescente de GC con un colorante fluorescente verde para estudiar la migración celular durante el desarrollo postnatal a través de macroscopía confocal. Este protocolo permite observaciones de la migración de células durante un periodo de hasta 12 horas y la prueba de las posibles funciones de los factores en la migración, incluyendo agonistas o antagonistas de los neuropéptidos, inhibidores de enzimas, moduladores de señalización celular o sustancias tóxicas durante el experimento regular. Un pequeño orificio en el inserto de membrana con una punta de pipeta es necesario para facilitar la administración de los compuestos en el medio de incubación. Una pipeta de punta curvada hecha en casa se puede utilizar para facilitar la entrega de la solución. Una cuestión de los estudios de migración celular en cortes de tejido vivo es que los movimientos del propio tejido pueden hacer difícil el seguimiento de la célula. Considerando lo han propuesto enfoques anteriores para estabilizar suavemente slices con un nylon de malla o una fina capa de colágeno de cola de rata 7,17, una de las principales ventajas de esta tecnología es la transferencia simple y directa de una placa de cultivo de 6 pocillos que contiene las rebanadas del cerebelo en insertos de membrana de la incubadora de CO 2 en el marco del objetivo de un macroscopio confocal. Controladores de temperatura integrado y CO 2 también proporcionan los parámetros ambientales adecuadas y constantes esenciales para la migración celular 9. Por lo tanto, las condiciones de cultivo se mantienen durante las observaciones y los movimientos de tejido se reducen al mínimo ya que las rebanadas están bien unidos a la pieza de inserción de membrana. Estabilización del tejido se verifica siguiendo la posición de los bordes rebanada o células de Purkinje que deben ser corregidos referencias durante la adquisición. Además, las rebanadas del cerebelo (entre 12 y 18) distribuidas en los 6 pocillos de la placa se pueden observar rápidamente en detalle con una platina motorizada y un zoom óptico. Debido a la gran distancia de trabajo (X2, 39 mm) del objetivo seco, epi-observación está libre de inmersión y la administración de compuestos en el medio de cultivo es mucho más fácil. Por lo tanto, los parámetros ambientales y similitudes de apoyo en la cultura de CO 2 incubadora y confocal macroscopía conducen a la máxima conservación de la muestra biológica. Otra ventaja del protocolo es el gran campo de visión y por consiguiente el gran número de células que se pueden observar de forma simultánea. Por ejemplo, se ha determinado previamente que la densidad de los GC fluorescentes con la migración radial en la ML fue 1.124 ± 138 células / mm 2 18. Macroscopía confocal (X2, NA = 0,234) tiene una resolución lateral inferior en comparación con la microscopía confocal (40X, NA = 1,25), pero la célula cuerpos de los GC pueden ser rastreados con facilidad y la velocidad media de la migración es comparable entre los dos enfoques tecnológicos 7,18 . Además de la mejora técnica de las adquisiciones de imágenes, la calidad de los cortes de tejido y XXe calidad de etiquetado son puntos clave para los experimentos exitosos. Siempre mantenga los medios de comunicación y los tejidos en hielo durante los procesos de disección, eliminar aceite en vibratome cuchillas y no utilizan rebanadas de tejido en contacto con pegamento. Secciones sagitales y transversales se adaptan a radial y la migración tangencial respectivamente. Utilizar diferentes longitudes de incubación para la detección apropiada en las diferentes capas corticales del cerebelo. Tiempos de incubación largos (hasta 8 horas) son necesarios para detectar la migración de numerosos GC en el PCL y el IGL. Dado que la migración GC es un proceso fisiológico durante las ventanas de espacio-temporales específicos, el control positivo es que las células tienen que migrar correctamente. En particular, numerosos GC cabezal en el ML es uno de los indicadores de salud principal de rebanadas sagital del cerebelo. Para comenzar los experimentos, se sugiere la observación de los movimientos de GC en el ML. De hecho, la forma de GC con cuerpo celular alargado verticalmente debe ser considerado como un punto de referencia para comenzar acquisition con control de sucesivos (2 horas) y tratamiento (2 hr) períodos que se pueden realizar fácilmente en el ML. Los colorantes fluorescentes como la familia Cell Tracker o proteínas fluorescentes expresados ​​a través de construcciones genéticas pueden ser utilizados como trazadores para los estudios de migración celular. Debido a la lenta cinética de la migración GC (1 pila cada 30 minutos), los experimentos multicolor también se pueden realizar en el modo secuencial desde 4 lasers vigas (405, 488, 532 y 633 nm) están disponibles en el sistema. Teniendo en cuenta la migración radial centrípeta y centrífuga, el seguimiento de otras interneuronas también se pueden realizar 18. En particular, menos numerosos tipos de células pueden ser más fácilmente localizadas con un gran campo de visión. Finalmente, este protocolo se puede utilizar para estudiar la migración de células en otras etapas del desarrollo del cerebelo, sino también a otras áreas del cerebro.

En el cerebelo en desarrollo, ocho tipos diferentes de neuronas se producen secuencialmente entre la segunda semana embrionario y la segunda semana postnatal en los roedores 1. Originario inicialmente a partir de, una zona germinal primaria, las células granulares inmaduros (GC) son los últimos neuronas para ser producidos a partir de la capa externa granular (EGL), una zona germinal secundaria 2. Durante las tres primeras semanas después del parto, la corteza cerebelosa es una estructura foliada organizado en cuatro capas que incluyen la EGL, la capa molecular (ML), la capa de células de Purkinje (PCL) y la capa granular interna (IGL) (Figura 1). A través de la migración centrípeta, inmadura GC, interneuronas glutamatérgicas, alcanzar el IGL dentro de aproximadamente 2 días. Por la tercera semana después del parto, la EGL desaparece y el IGL constituye lo que se llama la capa granular (GL) en el cerebelo adulto. En el GL, GC recibir entradas sinápticas excitatorias de fibras musgosas y células cepillo unipolares, yentradas sinápticas inhibitorias de axones de las células de Golgi. En el ML, los axones GC hacen sinapsis excitatorias con las neuronas GABAérgicas incluyendo las células de Purkinje, células cesta, las células estrelladas y las células de Golgi 2. Observación en tiempo real del movimiento de las células en rodajas cerebelosa aguda, obtenidos a partir de roedores postnatales tempranas demuestra que GCs modifican su forma concomitante con los cambios en la modalidad y la velocidad de migración durante su ruta en la corteza cerebelosa 3. Durante las dos primeras semanas después del parto, precursores GC proliferan activamente en la parte superior de la EGL. En la parte media de la EGL, postmitotic GCs migran tangencialmente en la dirección de su proceso más grande. En la frontera EGL-ML, GC ralentizar su movimiento, las células comienzan a entrar en un proceso descendente vertical corta en el ML. En el ML, GC tiene un cuerpo celular alargado verticalmente, un proceso posterior delgado y un proceso que lleve más voluminoso, y migran radialmente a lo largo de las fibras gliales Bergmann. En elPCL, GC detener su movimiento, pero después de una fase estacionaria prolongado (2 horas), que cruzan la frontera PCL-IGL. En la IGL, GCs migran hacia la parte inferior de la capa en la ausencia de soporte de fibra glial. Una vez que las puntas del proceso que conduce acercarse a la frontera importa IGL-blanca (WM), GC lenta y detener su movimiento. Se prefieren las secciones transversales del cerebelo para los estudios de migración tangencial en el EGL mientras rebanadas sagital se dedican a la migración radial en el ML, PCL y IGL. Algunos factores de regulación de los movimientos de GC incluidos los neuropéptidos (por ejemplo, la somatostatina, PACAP) han sido identificados hasta el momento, pero los mecanismos completos implicados en el control espacio-temporal de la migración GC en cada capa cortical siguen siendo 1,4,5,6 gran parte desconocido. Migración GC se ha estudiado durante los últimos 20 años a través de video y microscopía confocal utilizando iluminación de luz transmitida ya sea por células cultivadas aisladas o detección de fluorescencia para acurebanadas del cerebelo TE. DiI Inicialmente lipófilos, y más recientemente colorantes &quot;Rastreo de la célula&quot; y proteínas fluorescentes de células-expresado se utilizaron para la microscopía confocal o de dos fotones 7,8. Experimentos exitosos dependen de una serie de procedimientos específicos que hacen que el protocolo simple, pero no fácil. En particular, las rebanadas agudas tienen que ser estabilizado durante las observaciones en general, con una red de malla de nylon casera 9. La intensidad de iluminación de luz tiene que ser lo más bajo posible para evitar la fototoxicidad y photobleaching tal como se propone en los escaneos multipunto enfoque microscopio confocal. Además, la temperatura y CO 2 son parámetros ambientales clave desde la inestabilidad puedan afectar a la migración neuronal. Para facilitar y perfeccionar los procedimientos experimentales, hemos desarrollado un protocolo macroscopía confocal que limita los movimientos rebanada, asegura parámetros ambientales constantes, reduce fotoblanqueo, campo de visión aumenta (del orden de milímetros) y consequtemente el número de células (decenas) que pueden ser rastreados a través de análisis de imágenes. Por lo tanto, 180 micras rodajas gruesas se cultivan en insertos de membrana, y placas de 6 pocillos se transfieren directamente bajo un objetivo motorizado 2X de un macroscopio confocal comercial equipado con una gran cámara de incubación, la temperatura y el CO 2 controladores y un sistema de control de vibraciones. Time-lapsos y z-pilas se realizaron a continuación durante varias horas y herramientas farmacológicas o moléculas bioactivas se pueden añadir o entregados en el medio de incubación. Este método también podría ser adaptado para estudiar la migración de los otros tipos de neuronas en el cerebelo o cerebro en diferentes etapas de desarrollo.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s medio de águila modificado (DMEM) mezcla de nutrientes F-12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8437</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hank 10x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1641</td><td></td></tr><tr><td>PACAP38</td><td>INRS, Canadá</td><td></td><td>Bourgault et al., 200919</td></tr><tr><td>PAI-1</td><td>Calbiochem</td><td>528208</td><td></td></tr><tr><td>suplemento N-2</td><td>Fisher Scientific / Gibco/ invitrogen</td><td>O973</td><td></td></tr><tr><td>Pegamento de cianoacrilato</td><td>Loctite</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Tracker Verde CMFDA</td><td>Invitrogen</td><td>C2925</td><td></td></tr><tr><td>Poliéster Transwell-Clear insertos</td><td>Corning</td><td>3452</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Colector de cultivo celular de 6 pocillos</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo de tejidos de 35 mm de diámetro</td><td>BD Falcon</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo de tejidos de 100 mm de diámetro</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>130182</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polipropileno (15 ml)</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 70%</td><td>Fisher Chemical</td><td>E/0800DF/21</td><td></td></tr><tr><td>Cabina de seguridad biológica campana extractora</td><td>Thermo Scientific</td><td>MSC9 Clase II A2</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de volumen ajustable (0,5-10 y micro; L)</td><td>Eppendorf</td><td>4910 000.018</td><td></td></tr><tr><td>Giroscopio, SSL3</td><td>Stuart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora 2, Hera Cell 150</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtomo de cuchilla vibratoria, VT1000S</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal, TCS LSI Controlador de</td> temperatura <td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Controlador</td> < CO>2 controlador PeCon<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, M205 C</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de operación, curvas, romas/romas</td><td>Medicon</td><td>03.03.17</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de iris finas endurecidas, rectas, afiladas/afiladas</td><td>FST</td><td>149090-11</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #3 y #5</td><td>FST</td><td>11293-00 y 11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Cuchillas inyectoras de vibratomo/un solo filo</td><td>Leica Microsystems</td><td>39053250</td><td></td></tr><tr><td>Mango de bisturí estándar #3 sólido</td><td>FST</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Cuchilla quirúrgica #15</td><td>Swann-Morton</td><td>205</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo imaging de postnatal cerebelosa gránulo migración celular utilizando confocal macroscopía

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Durante el desarrollo postnatal, las células granulares inmaduros (interneuronas excitatorias) exhiben la migración tangencial en la capa granular externa, y la migración luego radial en la capa molecular y la capa de células de Purkinje para llegar a la capa granular interna de la corteza cerebelosa. Por defecto en los procesos migratorios induce la muerte celular, ya sea o extravío de las neuronas, lo que lleva a los déficits en diversas funciones del cerebelo. La migración de células granulares centrípeta implica varios mecanismos, tales como la quimiotaxis y la degradación de la matriz extracelular, para guiar a las células hacia su posición final, pero los factores que regulan la migración de células en cada capa cortical son sólo parcialmente conocida. En nuestro método, rebanadas cerebelosa aguda, se preparan a partir P10 ratas, las células granulares están etiquetados con un marcador fluorescente citoplásmica y los tejidos se cultivan en insertos de membrana de 4 a 10 hr antes de iniciar la monitorización en tiempo real de la migración celular por macroscopía confocal a 37 ° C en elpresencia de CO 2. Durante su migración en las diferentes capas corticales del cerebelo, células granulares pueden estar expuestos a los agonistas o antagonistas de neuropéptido, inhibidores de proteasa, bloqueadores de los efectores intracelulares o sustancias incluso tóxicos tales como alcohol o metilmercurio para investigar su posible papel en la regulación de la migración neuronal .

A principios del cerebelo posnatal, GC presentan cambios significativos en su modo y la velocidad de la migración, ya que se cruzan diferentes capas corticales 1 (Figura 1). Esta sección ilustra ejemplos de los resultados que se pueden obtener mediante el estudio de la migración GC en su medio celular natural. Rata P10 cortes de tejido cerebeloso marcados con un colorante fluorescente verde se examinan bajo un macroscopio confocal (Figura 3A) y nos muestran que los GC migrar radialmente en la ML con una velocidad media de 18 m / h (Figura 3B, C). Hasta la fecha, el papel de las interacciones / comunicaciones entre las células neuronales y gliales incluyendo los factores de regulación y mecanismos moleculares implicados en el control de la migración de células en cada capa cortical son en gran parte desconocidos. En consecuencia, la cuestión principal es identificar los neuropéptidos, neurotransmisores, las neurotrofinas y los componentes de la matriz extracelular que podrían desempeñar un papel en estos cortical capa específicacambios fic de la velocidad durante su proceso de migración. Polipéptido activador de la adenilato ciclasa pituitaria (PACAP) se detecta principalmente en el PCL, sino también en el ML y el IGL durante las dos primeras semanas después del parto en roedores 7,10,11. Aplicación de PACAP38 (10 -6 M) al medio de cultivo resultó en una disminución de velocidad 79% de la GC en el ML. Por ejemplo, la velocidad de migración de GCs en el ML se redujo de 11,9 m / h en condiciones de control a 2,5 micras / hr después de la administración de PACAP38 (Figura 4A). Activador del plasminógeno de tipo tisular (tPA) es un miembro de la cascada proteolítica que conduce a la degradación de los componentes de la matriz extracelular (EM) tales como moléculas de adhesión celular o laminina 12,13. tPA y del plasminógeno, un sustrato de tPA, se detectan en las capas corticales durante el desarrollo del cerebelo postnatal 14,15,16. La administración de PAI-1 (10 -7 M), un inhibidor endógeno de tPA, reduce en 78% la GCmigración en el ML. Por ejemplo, GCs reduce la velocidad de migración en el ML de 19,2 m / h en condiciones de control a 4,2 micras / hr después de la adición de PAI-1 (Figura 4B). Estos resultados indican que PACAP ejerce un efecto inhibidor directo sobre los movimientos de GC y que la serina proteasa tPA facilita la migración de GCs en el ML del cerebelo de rata en desarrollo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig1.jpg" /> Figura 1: Representación 3D de la migración de GC en la corteza cerebelosa postnatal. 1-4, extensión de los procesos de GC y la migración tangencial en el EGL 5., La migración radial en el ML largo de las fibras gliales Bergmann. 6, fase estacionaria transitoria en el PCL. 7, la migración glial-independiente radial en el IGL. 8, Finalización de GC migración en el IGL GC, de células granulares, en rojo;. EGL, Capa granular externa; B, Bergmann células gliales, de color morado oscuro; G, células de Golgi, en amarillo; cf, fibras de escalada, en azul; g, células granulares postmigratory, en luz verde; IGL, capa granular interna; MFT, fibra de musgo terminal, en verde oscuro; ML, capa molecular; P, de células de Purkinje, en morado claro; capa de células PCL, Purkinje. Esta cifra ha sido modificado desde 5. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig2.jpg" /> Figura 2: la cultura ex vivo de las rebanadas del cerebelo P10 (A) cerebelo disecado de rata P10.. La barra de escala = 6 mm. (B) Micrografía de vivir 180 micras de espesor rebanada cerebelosa a través de microscopía estereoscópica. La barra de escala = 3 mm. (Gatoun aumento mayor, las cuatro capas corticales (EGL, ML, PCL, IGL) del cerebelo ya son distinguibles. La barra de escala = 1 mm. (D) Después del marcaje fluorescente, cortes de tejido se colocan en insertos de cultivo (24 mm de diámetro) en una placa de 6 pocillos. (E) Representación esquemática de un inserto de la cultura con la membrana de poliéster de cultivo de tejidos tratados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52810/52810fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig3.jpg" /> Figura 3: la migración dinámica de GC en las capas corticales del cerebelo P10 rata (A) vista Macroconfocal (xyz, proyección 2D) de una rebanada del cerebelo de rata P10 en el que los GC se marcan con un colorante fluorescente citoplásmica verde.. La barra de escala = 75 micras. (B) Time-lapse muestra GCmovimientos en la ML por macroscopía confocal de 4 horas en condiciones de control. Asterisco (*) símbolo marca el soma GC. El tiempo transcurrido (en min) se indica en la parte inferior de cada fotomicrografía. La barra de escala = 10 micras. (C) los cambios secuenciales en la distancia recorrida por GC soma. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig4.jpg" /> Figura 4:. Efecto de neuropéptido y proteasa inhibidor de la migración GC (A) GC fue rastreado en el ML por macroscopía confocal durante 2 horas en condiciones de control y luego durante 2 horas en presencia de polipéptido de adenilato-ciclasa pituitaria activación (PACAP). (B) GC fue localizado en el ML by macroscopía confocal durante 2 horas en condiciones de control y luego durante 2 horas en presencia del inhibidor del activador del plasminógeno-1 (PAI-1).

Durante el desarrollo del cerebelo postnatal, las células granulosas inmaduras que se originan en la zona germinal exhiben distintas modalidades de migración para llegar a su destino final y establecer redes neuronales. Este protocolo describe la preparación de cortes cerebelosos y el enfoque macroscópico confocal utilizado para investigar los factores que regulan la migración neuronal.

Ex Vivo Imaging de Postnatal cerebelosa gránulo migración celular utilizando confocal Macroscopía

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

El objetivo general de este procedimiento es visualizar neuronas en migración en cortes cerebrales vivos. Esto se logra primero mediante la disección del cerebelo de una rata P10. Los siguientes pasos consisten en preparar cortes cerebelosos agudos y etiquetar las neuronas con una sonda fluorescente.Luego, se realiza el experimento de lapso de tiempo mediante imágenes confocales macroscópicas o microscopía confocal. El paso final consiste en rastrear las neuronas en las películas resultantes. En última instancia, se utiliza la microscopía ex vivo para mostrar el papel de factores endógenos o sustancias tóxicas que regulan la migración neuronal.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la microscopía confocal es que la imagen confocal macro aumenta el campo de visión, permitiendo dejar rebanadas de tejido cerebral directamente colocadas sobre el inserto de la ingle. Al principio, se me ocurrió la idea de este método cuando tuve dificultades para transferir y estabilizar rebanadas de tejido cerebral para experimentos de microscopía confocal. Comience accediendo al cráneo de la cabeza de una rata P10 decapitada, utilizando finas tijeras de iris haga dos incisiones laterales desde la base hasta la región rostral del cráneo. Luego retire el cráneo diseccionado con una pinza número tres, rompiendo cualquier adherencia entre el cerebro y el cráneo.Ahora, retire el cerebro con el extremo de cuchara de una espátula y colóquelo en una placa de Petri de 35 milímetros con dos mililitros de HBSS frío sobre hielo. A continuación, bajo un microscopio estereoscópico, aísle el cerebelo del cerebro mediante laceraciones D utilizando dos pinzas número tres. Transfiera el cerebelo con la espátula a una nueva placa con tampón frío sobre hielo.Luego, utilizando las mismas herramientas, retire y deseche el cordón espinal residual y la membrana de pelado. Prepare un mango de escalpelo sólido número tres con una hoja quirúrgica número 15. Utilizando la hoja bajo un microscopio estereoscópico, corte el cerebelo entre el vermis y el hemisferio derecho.Ahora, en el vibrátomo, coloque una gota de pegamento de cianocrilato sobre el disco de la muestra y espere de 15 a 25 segundos para que se disipe el vapor del disolvente antes de transferir el cerebelo al disco. A continuación, fije el borde del cerebelo al disco de la muestra y espere 10 segundos. Ahora, utilizando el manipulador, inserte el disco de la muestra en la bandeja tampón de forma que el eje transversal del cerebelo quede perpendicular al soporte del cuchillo.Asegúrese de fijar el disco utilizando una llave de aluminio. Luego, cubra cuidadosamente el cerebelo con HBSS y coloque hielo triturado en el baño refrigerante. Para cortar la muestra, coloque una cuchilla limpia de manera que su borde quede justo detrás del borde posterior de la muestra.Defina esto como el punto inicial para el corte con hielo. Luego, utilice el comando de avance para definir el punto final justo más allá del borde frontal del espécimen. Ahora, establezca el grosor de corte en 180 micrones.Luego ajuste la velocidad de corte a 2,5 y la frecuencia a ocho, e inicie el corte del espécimen. Recopile hasta cinco secciones por cerebelo. Tome cada sección utilizando una pipeta de vidrio ancha truncada.Transfiera las secciones a un recipiente que contenga HBSS frío sobre hielo. Después de recolectar los cortes bajo un microscopio estereoscópico, retire cuidadosamente las meninges utilizando dos pinzas número cinco. Además, separe suavemente los LOE para facilitar la carga del sonda.Después de cortar la muestra, utilice una pipeta truncada de gran tamaño para transferirla junto con algo de HBSS a una placa de seis pocillos, colocando hasta tres secciones en cada pocillo. A continuación, después de vaciar el medio de cada pocillo cargado, agregue cinco mililitros de solución de carga que contenga 10 micromoles del colorante fluorescente, proteja las muestras de la luz y cubra la placa con papel de aluminio. Luego, coloque la placa sobre un agitador ajustado a 35 RPM.Deje que la placa incube durante 10 minutos a temperatura ambiente para permitir que el colorante marque las c&eacute;lulas en los pocillos. Ahora transfiera los cortes como antes a la membrana de un inserto transwell que tenga poros de tres micrones. Luego aspire el medio de carga, dejando solo los cortes.Ahora retire el inserto y los cortes para llenar el pocillo con 1,9 mililitros de DMEM. Luego vuelva a colocar el inserto y agregue otros 100 microlitros de DMEM para cubrir los tejidos. Incube esta preparación durante dos horas, tras las cuales serán visibles las células granulosas.Transfiera la placa sin la tapa a una cámara ambiental con flujo constante de gas en un microscopio confocal. Luego coloque una cubierta de vidrio sobre el inserto de la placa del microscopio confocal para experimentos de lapso de tiempo. Deje que las células se incuben en la cámara durante dos horas adicionales antes de continuar.Para visualizar las células granulares que migran en los cortes de tejido, ilumine la preparación con luz de 488 nanómetros y utilice un objetivo seco de dos x. Detecte las emisiones fluorescentes de 500 a 530 nanómetros utilizando ImageJ. Para cada imagen de la película de lapso de tiempo, realice una proyección Zack utilizando el modo de desviación estándar, ajuste el contraste y los niveles de brillo de cada imagen para que las células granulares marcadas sean fáciles de observar. A continuación, seleccione el complemento de seguimiento manual en el menú de análisis de partículas.Utilice el complemento para hacer clic en el punto central de cada cuerpo celular etiquetado a lo largo de la secuencia de imágenes de lapso de tiempo. Luego exporte los datos brutos de seguimiento a una hoja de cálculo para su posterior análisis. Reorganice los datos brutos de seguimiento exportados desde Image J con una herramienta casera inteligente que identifique cada célula y sus posiciones asociadas utilizando el programa.Calcule la distancia total recorrida y la velocidad media de migración para cada célula. En el cerebelo posnatal temprano, las células granulares exhiben cambios significativos en su modo y velocidad de migración a medida que atraviesan diferentes capas corticales. Se examinaron células granulares marcadas con CTG en cortes de tejido cerebeloso de ratas PM.Como se describió, las células granulares migraron radialmente en la capa molecular con una velocidad promedio de 18 micrones por hora. Luego se utilizó otra preparación para probar el efecto de fármacos que se esperaba alteraran la tasa de migración. La aplicación de pay cap 38 al medio de cultivo provocó una disminución del 79 % en la velocidad de las células granulares en la capa molecular, una caída hasta 2,5 micrones por hora.La administración de PI uno, un inhibidor del TPA endógeno, redujo la velocidad de migración de las células granulares en un 78 % respecto a la velocidad de control, hasta 4,2 micrones por hora. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo rastrear células en el balón teórico en desarrollo. Mientras intenta este procedimiento, es importante recordar proporcionar parámetros ambientales adecuados y constantes, esenciales para la migración celular tras su desarrollo.Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de las neurociencias exploraran los procesos sensoriales en el cerebro.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Se describe un protocolo en tiempo real videoimaging de la migración neuronal en el cerebro anterior del ratón. La migración de viralmente marcados o injertado precursores neuronales se registró en rebanadas agudas en vivo utilizando de gran campo de imagen fluorescente con un intervalo de adquisición relativamente rápido para estudiar las diferentes fases de la migración de células, incluyendo las duraciones de las fases estacionaria y la migración y la velocidad de migración.

Time-lapse de imágenes de Migración neuroblasto en rodajas agudas del cerebro anterior ratón adulto

Source: Chan, U., et al., utilizando la electroporación postnatal in vivo para estudiar la morfología de las neuronas de gránulos cerebelosos y el desarrollo de sinapsis. J. Vis. Exp. (2021).Este video demuestra el análisis del desarrollo de neuronas granulosas cerebelosas mediante la obtención de imágenes de cortes de tejido cerebral prefijados de ratones marcados con una proteína fluorescente, Capturar imágenes de alta resolución de la pila Z con un microscopio confocal y medir los parámetros...

Visualización de la sinaptogénesis de las neuronas granulosas cerebelosas en diferentes etapas de desarrollo

Fuente: Bénard, M., et al. Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy. J. Vis. Exp. (2015)Este video muestra un método macroscópico confocal para rastrear la migración ex vivo de células granulares en cortes cerebelosos de cerebros de ratas postnatales.

Imágenes ex vivo de la migración de células granulosas cerebelosas postnatales mediante macroscopía confocal

La migración de los neuroblastos es un acontecimiento fundamental en la neurogénesis postnatal. Se describe un protocolo para el etiquetado de la eficiencia de los neuroblastos por electroporación in vivo postnatal y la posterior visualización de su migración utilizando time-lapse de rodajas de cerebro agudas. Incluimos una descripción para el análisis cuantitativo de la dinámica de neuroblastos de seguimiento de vídeo.

In vivo Postnatal electroporación y time-lapse de Neuroblast Migración en rodajas de cerebro de ratón aguda

Morfogénesis neuronal y la migración son eventos cruciales que subyacen el desarrollo adecuado del cerebro. Aquí se describen los métodos para manipular genéticamente las neuronas granulares de cerebelo en cultivo y el cerebelo en desarrollo para la evaluación de la morfología y las características migratorias de las neuronas.

La manipulación genética de las neuronas cerebelosa gránulo<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em&gt; Estudiar Neuronal Morfología y Migración

La capa externa del gránulo del cerebelo es el sitio de la amplificación de tránsito más grande en el cerebro en desarrollo. A continuación, presentamos un protocolo para orientar la modificación genética a esta capa en el pico de la proliferación mediante electroporación ex vivo y la cultura de las rebanadas del cerebelo a partir de embriones Día 14 embriones de pollo.

Ex Vivo Cultura de polluelo cerebelosos Rebanadas y espacialmente focalizadas Electroporación de gránulos precursores celulares

Este protocolo proporciona instrucciones para la observación directa de neuronas corticales que migran radialmente. La electroporación in utero , el cultivo de corte organotípico y la formación de imágenes confocales en intervalos de tiempo se combinan para estudiar directa y dinámicamente los efectos de la sobreexpresión o regulación negativa de genes de interés en las neuronas que migran y para analizar su diferenciación durante el desarrollo.

Time-lapse Imágenes confocales de las neuronas migratorias en la cultura organotípica en rebanadas de cerebro de ratón embrionario<em&gt; En Utero</em&gt; Electroporación

Aquí, nos proporcionan un método confiable y de bajo costo para generar culturas de electroporated cerebro organotypic rebanada de embriones de ratón adecuados para microscopía confocal y técnicas de imagen en vivo.

Ex útero Electroporación y culturas Organotypic rebanada de cerebros embrionarios de ratón para vivir-la proyección de imagen de interneuronas GABAérgicas de migrando

Este protocolo describe una técnica crónica de implantación de ventanas craneales que se puede utilizar para imágenes longitudinales de estructuras neuro-glio-vasculares, interacciones y función en condiciones saludables y enfermas. Sirve como una alternativa complementaria al enfoque de imagen transcraneal que, aunque a menudo se prefiere, posee algunas limitaciones críticas.

Mapeo cerebral preciso para realizar imágenes in vivo repetitivas de dinámica neuroinmunitaria en ratones

Aquí describimos un método para visualizar la sinaptogénesis de las neuronas granulares en el cerebelo del ratón durante el curso del desarrollo cerebral postnatal cuando estas células refinan sus estructuras sinápticas y forman sinapsis para integrarse en el circuito cerebral general.

Utilización de electroporación postnatal in vivo para estudiar la morfología de la neurona del gránulo cerebeloso y el desarrollo de la sinapsis

Los métodos actuales describen un enfoque no ratiométrico para imágenes de calcio subcompartimentales de alta resolución in vivo en Caenorhabditis elegans utilizando indicadores de calcio codificados genéticamente fácilmente disponibles.

Imágenes subcelulares del manejo neuronal del calcio in vivo

Aprende a visualizar la migración de neuronas granulares en cerebelo postnatal de rata mediante macroscopía confocal. Este método permite estudiar la dinámica neuronal y factores endógenos que regulan el movimiento celular en neurociencia.

Ex Vivo Imaging de Postnatal cerebelosa gránulo migración celular utilizando confocal Macroscopía

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