Ex Vivo Imaging de Postnatal cerebelosa gránulo migración celular utilizando confocal Macroscopía

El objetivo general de este procedimiento es visualizar las neuronas migratorias en trozos de cerebro vivos. Esto se logra diseccionando primero el cerebelo de una rata P 10. Los siguientes pasos son preparar cortes cerebelosos agudos y etiquetar las neuronas con una sonda fluorescente.

Luego, el experimento de lapso de tiempo se realiza a través de imágenes macro confocales o microscopía confocal. El paso final es rastrear las neuronas en las películas resultantes. En última instancia, la microscopía ex vivo se utiliza para mostrar el papel de los factores endógenos o sustancias tóxicas que regulan la migración neuronal.

La principal ventaja de esta técnica de los métodos existentes, como la microscopía confocal, es que la imagen macro confocal aumenta la sensación de visión al dejar cortes de arte cerebral colocados directamente en el inserto de la ingle. La primera vez que tuve la idea de este método fue cuando tuve dificultades para transferir y estabilizar cortes de arte cerebral para experimentos de microscopía confocal Comience por tener acceso al cráneo de la cabeza de un cachorro de rata P 10 decapitado, usando tijeras de iris finas y haga delicadamente dos incisiones laterales desde la base hasta la región rostral del cráneo. A continuación, retire el cráneo diseccionado con dos pinzas número tres, rompiendo cualquier adherencia entre el cerebro y el cráneo.

Ahora, saque el cerebro con el extremo de la cuchara de una espátula y colóquelo en una placa de Petri de 35 milímetros con dos mililitros de HBSS frío en hielo. Ahora, bajo un microscopio estereoscópico, aísla el cerebelo del cerebro mediante laceraciones D utilizando dos pinzas número tres. Vierta el cerebelo en un plato nuevo con tampón helado.

Luego, con las mismas herramientas, retire y deseche la médula espinal residual y la membrana de la cáscara. Prepare un mango de bisturí sólido número tres con una hoja quirúrgica número 15. Usando la hoja bajo un microscopio estereoscópico, corte el cerebelo entre el vero y el hemisferio derecho.

Ahora en el vibrato, ponga una gota de pegamento de cianocrilato en el disco de muestra y espere de 15 a 25 segundos para que el vapor de solvente se disipe antes de transferir el cerebelo al disco. A continuación, fije el borde del cerebelo al disco de muestra y espere 10 segundos. Ahora, usando el manipulador, inserte el disco de muestra en la bandeja de tampón de modo que el eje transversal del cerebelo quede perpendicular al portacuchillas.

Asegúrese de asegurar el disco con una llave inglesa. Luego, cubra cuidadosamente el cerebelo con HBSS y cargue hielo picado en el baño de enfriamiento. Para cortar el espécimen, coloque una cuchilla limpia, de modo que su borde quede justo detrás del borde posterior del espécimen.

Defina esto como el punto de partida para el glaseado. A continuación, utilice el comando forward para definir el punto final justo después del borde frontal de la muestra. Ahora ajuste el grosor de la rebanada a 180 micras.

A continuación, ajuste la velocidad de corte a 2,5 y la frecuencia a ocho, y comience a seccionar la muestra. Recoge hasta cinco rodajas por cerebelo. Recoja cada sección con una pipeta de vidrio de jabalí ancho truncado.

Transfiera las secciones a un plato que contenga HBSS frío en hielo. Después de recoger las rodajas bajo un microscopio estereoscópico, retire cuidadosamente las meninges con dos pinzas número cinco. Además, separe suavemente los LOE para una mejor carga de la sonda.

Después de cortar la muestra, use una pipeta de verraco ancho truncada para transferirlas con un poco de HBSS a una carga de placa de seis pocillos hasta tres rebanadas en cada pocillo. A continuación, después de vaciar el medio en cada cargado, agregue cinco mililitros de solución de carga que contenga 10 micromolares del tinte fluorescente para proteger las muestras de la luz, cubra la placa con papel de aluminio. Luego coloque la placa en un mutador configurado a 35 RPM.

Deje que la placa se incube durante 10 minutos a temperatura ambiente para que el tinte etiquete los polos de las células. Ahora transfiera las rodajas como antes a la membrana de un inserto transwell que tiene poros de tres micras. A continuación, aspire el medio de carga, dejando sólo las rodajas.

Ahora retire el inserto y las rodajas para llenar el pozo con 1,9 mililitros de DMEM. A continuación, vuelva a colocar el inserto y añada otros 100 microlitros de DMEM para cubrir los tejidos. Incube esta preparación durante dos horas, después de lo cual las células granulares serán visibles.

Transfiera la placa sin la tapa a una cámara ambiental con flujo de gas constante en un microscopio confocal. A continuación, coloque la cubierta de vidrio en el inserto de la placa del microscopio confocal para los experimentos de lapso de tiempo. Deje que las células se incuben en la cámara durante dos horas adicionales antes de continuar.

Para visualizar las células granulosas migrando en las rebanadas de tejido, ilumine la preparación con una luz de 488 nanómetros y use un objetivo seco de dos veces. Detecte emisiones fluorescentes de 500 a 530 nanómetros usando la imagen J.Para cada imagen de la película de lapso de tiempo, realice una proyección de Zack usando el modo de desviación estándar, ajuste el contraste y los niveles de brillo de cada imagen para que las células granulosas marcadas sean fáciles de ver. Ahora, elija el complemento de seguimiento manual en el menú de análisis de partículas.

Utilice el complemento para hacer clic en el punto central de cada cuerpo de celda etiquetado a lo largo de la secuencia de imágenes de lapso de tiempo. A continuación, exporte los datos de seguimiento sin procesar a una hoja de cálculo para su posterior análisis. Reorganice los datos de seguimiento sin procesar exportados de la imagen J con una herramienta casera inteligente que identifica cada celda y las posiciones asociadas mediante el programa.

Calcule la distancia total de viaje y la velocidad media de migración de cada celda. En el cerebelo postnatal temprano, las células granulosas exhiben cambios significativos en su modo y velocidad de migración a medida que atraviesan diferentes capas corticales. Se examinaron células granulosas marcadas con CTG en cortes de tejido cerebeloso de rata PM.

Como se describió, las células granulosas migraron radialmente en la capa molecular con una velocidad promedio de 18 micras por hora. Luego se utilizó otra preparación para probar el efecto de los medicamentos que se esperaba que alteraran la tasa de migración. La aplicación de la capa de pago 38 al medio de cultivo dio como resultado una disminución de la velocidad del 79% de las células granulosas en la capa molecular, una caída a 2,5 micras por hora.

La administración de PI one, un inhibidor de la TPA endógena, redujo la velocidad de migración de las células granulosas en un 78% con respecto a la velocidad de control a 4,2 micras por hora. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo rastrear células en el globo de teoría en desarrollo. Al intentar este procedimiento, es importante recordar proporcionar parámetros ambientales apropiados y constantes esenciales para la migración celular después de su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de las neurociencias exploraran los procesos reales en el cerebro.