Ingeniería 3D Cellularized colágeno Geles para Vascular Regeneración Tisular

El objetivo general de este procedimiento es diseñar construcciones tubulares para la regeneración del tejido vascular. Esto se logra combinando primero colágeno tipo uno y células musculares lisas en geometría cilíndrica con el uso de una técnica de moldeo. El segundo paso es madurar la construcción en un biorreactor estático específicamente diseñado.

A continuación, las construcciones maduras se cosechan cuidadosamente y las células endoteliales se colocan en el lumen de la construcción utilizando un actor de biorreactor de pared giratoria. En última instancia, se realizan ensayos histológicos, metabólicos y pruebas mecánicas para evaluar las propiedades de estas construcciones tubulares. La originalidad de esta técnica es que utiliza un solo paso para combinar las células y el colágeno para producir una construcción de ingeniería de tejidos con propiedades mecánicas específicas sin ningún tratamiento físico o químico adicional.

Además, la construcción se puede manipular fácilmente gracias a los agarres de diseño específico, que permiten su manipulación y enlaces finales. Este método puede proporcionar información sobre la interacción entre las células y la matriz extracelular durante el crecimiento y la remodelación para la regeneración del tejido vascular. Además, se puede aplicar para una serie de tejidos específicos, como tendones, injertos de piel, parches cardíacos y el sistema nervioso.

Para comenzar a fabricar y ensamblar el biorreactor estático como se describe en el texto adjunto, se incluyen detalles sobre el depósito y la gasa, la fabricación de agarre, la tapa del mandril y las técnicas de ensamblaje y esterilización del molde de la carcasa. A continuación, expanda las células de músculo liso de la aorta porcina en un matraz de cultivo de tejidos de 175 centímetros cuadrados hasta que tengan un 90% de confluente. Utilizando técnicas de cultivo estándar, recoja las células y luego vuelva a suspenderlas a 4 millones de células por mililitro en un medio de cultivo completo.

A continuación, combine una parte de solución tampón, dos partes de solución de colágeno estéril a cuatro gramos por litro y una parte de suspensión celular. En este orden, mida el pH de la mezcla y asegúrese de que esté entre pH 7.0 y 7.4. A continuación, vierta suavemente la mezcla de colágeno celular en el complejo de moldes de la carcasa ensamblada.

Asegúrate de que no haya burbujas de aire en la mezcla. Deje reposar el gel de colágeno a temperatura ambiente durante una hora en un ambiente estéril. Después de una hora, retire el tubo de la carcasa y transfiera con cuidado la construcción al depósito que contiene 35 mililitros de medio de cultivo precalentado.

Incubar el constructo en posición vertical durante una o dos semanas de maduración estática. Cambie el medio de cultivo cada dos días aspirando el medio viejo desde el puerto del tabique inferior y volviendo a llenar el depósito con una cantidad equivalente de cultivo fresco. Medio. Si lo desea, recoja un mililitro del medio de cultivo viejo y fresco en cada intercambio de medios para el análisis bioquímico cada hora durante las primeras 12 horas y cada 24 horas a partir de entonces.

Retire el constructo del medio de cultivo en condiciones estériles y colóquelo ortogonalmente en la trayectoria de un interferómetro láser de barrido para medir el espesor del constructo después de una o dos semanas de maduración estática. Transfiera el biorreactor a una campana de cultivo celular y retire suavemente la construcción de su mandril. Una vez libre, colóquelo en una placa de Petri de 100 milímetros de diámetro que contenga 40 mililitros de medio de cultivo fresco.

A continuación, configure un probador micromecánico equipado con una celda de carga de cinco a 10 Newton y agarres que se extienden en un baño de PBS mantenido a 37 grados Celsius. Retire la construcción de su placa de Petri y conéctela a dispositivos de agarre especializados para pruebas longitudinales y diseñados para conectarse a la parte de gasa de la construcción sin aplastar el gel. Utilice cinta de teflón para evitar que los dispositivos de agarre se deslicen durante las pruebas.

A continuación, monte la construcción en el probador micromecánico. A continuación, realice una prueba de fatiga en la dirección longitudinal estirando primero la construcción hasta su longitud de calibre inicial y manteniéndola allí durante 10 minutos. A continuación, aplique 30 ciclos de una deformación cíclica del 10% a una velocidad del 5% por segundo.

Aumente la deformación en pasos incrementales del 10% de deformación cíclica hasta que la muestra no pueda realizar pruebas en la dirección circunferencial. Primero secciona el espécimen en anillos de 10 milímetros de largo. A continuación, monte los anillos en las barras de acero inoxidable utilizadas en lugar de las empuñaduras.

Al igual que con las pruebas de dirección longitudinal, primero, estire la construcción hasta su longitud de calibre inicial y manténgala allí durante 10 minutos. A continuación, aplique 30 ciclos de una deformación cíclica del 10% a una velocidad del 5% por segundo. Una vez que la construcción haya madurado y se haya retirado de su mandril, fije la construcción que ambos extremos esté en el depósito y colóquela en el conjunto del depósito.

Como se muestra aquí. Llena el exterior del depósito con 30 mililitros de cultivo. Medio. A continuación, llene el 75% del volumen luminal del constructo con una mezcla de proteínas y, a continuación, cierre ambos extremos del constructo.

Para evitar cualquier fuga de la solución de proteína, coloque el biorreactor dentro de una incubadora y gire el biorreactor a 4,02 veces 10 por los cinco GForce negativos durante una hora para cubrir la superficie luminal con proteínas mientras se recubre la luz. Recolección de células de la vena umbilical humana y tial cultivadas con técnicas estándar cuando tienen un 90% de confluencia Resus, suspende las células y suplementa el medio de cultivo M1 99. A continuación, observe la vena umbilical humana y las células uroteliales en la luz de la construcción.

Con una densidad de 1000 células por centímetro cuadrado, cierre las extremidades superiores de la construcción para evitar cualquier fuga de la solución celular. Incubar los constructos alojados en el cultivo de biorreactor de pared giratoria durante dos días a una rotación constante de 4,02 veces 10 con respecto a la fuerza 5G negativa. Durante la maduración estática de las construcciones de los vasos, el diámetro externo de las estructuras de ascenso celular se redujo rápidamente.

Como se muestra aquí, el diámetro de los constructos se redujo en un 60% de su valor inicial en el primer día de cultivo estático. Al séptimo día, los constructos habían reducido casi un 85%Tanto los ciclos de deformación longitudinal como los circunferenciales de los constructos seguían las propiedades viscoelásticas típicas de los constructos basados en colágeno. En general, los constructos fueron más fuertes en la dirección longitudinal en comparación con la dirección circunferencial en el mismo rango de deformación, la tinción tricónica de Massen realizada en los constructos endoteliales mostró un endotelio altamente homogéneo.

Las células musculares lisas exhibían una morfología en forma de huso y parecían homogéneamente dispersas a través de la pared, mientras que las células endoteliales parecían bien distribuidas en el lado luminal. Después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en biomecánica y medicina regenerativa exploraran el comportamiento mecánico de los tejidos nativos y modificados.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo las construcciones vasculares pueden diseñarse rápidamente y finalmente volverse lo suficientemente fuertes como para ser manipuladas y utilizadas para el acondicionamiento mecánico en un controlador dinámico. Esperamos que nuestros esfuerzos y resultados le hayan convencido sobre el alto potencial de las células en el modelo de matriz extracelular para el desarrollo de tejidos funcionales biológicos.