Name: El tratamiento de los productos de plaquetas con riboflavina y luz UV: Eficacia contra el alto título contaminación bacteriana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Aprende a evaluar la reducción de contaminación bacteriana en productos plaquetarios mediante el tratamiento con riboflavina y luz UV. Este método mejora la seguridad transfusional preservando la calidad de los componentes sanguíneos.

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Los autores no tienen agradecimientos.

1. Bacterias Suspensión Preparación: <ol><li> De una placa de cultivo rayado, asépticamente inocular una sola colonia en un frasco estéril de 250 ml que contiene 100 ml de medio de crecimiento apropiado (Tabla 1) a modo de asa de inoculación estéril. </li><li> Colocar el frasco en un incubador con agitación orbital a las condiciones apropiadas (Tabla 1) durante 1-2 días, comprobando periódicamente para el crecimiento. Ajuste la velocidad del agitador a 140 RPM. </li><li> Transferir asépticamente la suspensión bacteriana en dos estéril de 50 ml tubos cónicos y centrifugar los tubos a 3000 xg durante 20 min a 23 ° C. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender cada pellet bacteriano con 15 ml de agua de peptona estéril. Vortex según sea necesario. Combine el cultivo de bacterias suspendidas en un tubo / contenedor. </li><li> Título de la cultura de valores en triplicado por sección 4 para determinar el título de la cultura. </li><li> Refrigere hasta por 2 semanas a 477; 2 ° C hasta que se necesite. Re-título de la cultura en el momento de su uso, consulte el paso 4.8. </li></ol> 2. Plaquetas Preparación del producto: <ol><li> Reunir un producto de plaquetas humanas aféresis estándar a un banco de sangre acreditada. El producto de plaquetas debe cumplir con las siguientes especificaciones de recogida: 90-360 ml de volumen y 0,8 -3,8 x 10 6 plaquetas / l de concentración. <ol><li> Asegúrese de que el producto de plaquetas ha descansado durante un mínimo de 2 horas antes de la elaboración de reducción de patógenos. Almacenar los productos a 22 ± 2 ° C en una incubadora de plaquetas sin agitación durante estos 2 hr. Después de dos horas a asegurar el producto de plaquetas se agitó a 22 ± 2 ° C en una incubadora de plaquetas. Utilice el producto para un máximo de 22 horas después de recogida. </li></ol></li><li> Usando una jeringa de 3 ml extraer una muestra de 2 ml para medir el 22C pH del producto de plaquetas. Utilizar un analizador de gases en sangre para asegurar que el producto tiene un pH&gt; 6,6. Usar la misma muestra para medir la concentración de plaquetas del producto de plaquetas usando un analizador hematológico. Asegúrese de que el producto cumple con las 0.80-3.8 x 10 6 plaquetas / requisito concentración colección l. </li><li> Evaluar visualmente el remolino del producto de plaquetas. Si el producto tiene un &quot;0&quot; agitar el producto será descartado. </li><li> Mantenga la bolsa de plaquetas bajo una fuente de luz blanca directa y exprimir la bolsa de plaquetas brevemente. Observar visualmente el patrón de remolino de la muestra de plaquetas. Puntuación del producto utilizando la siguiente escala. NOTA: 2 - Remolino positivo: Remolino inhomogeneidad visible durante toda la bolsa con un fuerte contraste. 1 - Intermedio Remolino: Un poco de falta de homogeneidad visible, pero sólo en unos pocos lugares y con poco contraste. 0 - remolino negativo: la homogeneidad turbia restante antes y después de exprimir la bolsa de plaquetas </li></ol> Proceso 3. La riboflavina y luz UV: <ol><li> TranSfer el producto de plaquetas a una bolsa de riboflavina y UV iluminación de luz y de almacenamiento mediante un dispositivo de acoplamiento de tubos estériles. Después de la transferencia de retirar la unidad de plaquetas bolsa de recogida de vacío usando un sellador de tubos y desechar la bolsa vacía como residuos biológicos peligrosos. </li><li> Retire una bolsa de 35 ml de 500 mM riboflavina solución madre de su envoltura externa protectora ligera. Muelle estéril el kit de riboflavina en la línea de entrada de la bolsa de tratamiento y almacenamiento. Permitir a los contenidos a drenan en la unidad de plaquetas. </li><li> Cuelgue la riboflavina bolsa / tratamiento y almacenamiento conjunto de bolsas de la bolsa de la riboflavina y expresar suavemente aire residual de la bolsa de tratamiento y almacenamiento y en la bolsa de riboflavina. Asegurar una pequeña cantidad de producto de plaquetas se expresa también en la bolsa riboflavina para enjuagar cualquier riboflavina residual en el producto de plaquetas. Deje que la solución riboflavina y plaquetas drene de nuevo en la bolsa de tratamiento y almacenamiento y luego sujetar la línea de entrada. Retire la bolsa vacía riboflavina nosotrosing un sellador de tubos y desechar la bolsa vacía como residuos biológicos peligrosos. </li><li> Muelle estéril una &quot;línea 6 tubos con conector jeringa femenina en la línea de entrada de la bolsa de iluminación y almacenamiento. Adjuntar un cilindro de jeringa 10 ml (quitar el émbolo) en el conector de la jeringa mujer. </li><li> Añadir asépticamente 5 ml de bacterias del stock en el cilindro de la jeringa a través de una pipeta. Abra la pinza en la línea de entrada y permiten que las bacterias se drenan en el producto de plaquetas. Enjuague el cilindro de la jeringa al permitir algún producto de plaquetas fluya de nuevo en el barril de la jeringa 10 ml. Retire la jeringa barril 10 ml. </li><li> Asépticamente adjuntar una jeringa de 30 ml y enjuagar la boca de entrada de un mínimo de dos veces para asegurarse de que las bacterias de valores, se mezcla en el producto de plaquetas. Después de que el producto se mezcle bien, utilizar una jeringa limpia 5-10 ml y extraer una muestra pre-tratamiento de 2 ml. Utilizando una jeringa nueva asegurar que cualquier aire introducido desde el paso de la inoculación o el muestreo de paso se elimina. <ol><li> Título de la muestra antes del tratamiento por sección 4. </li></ol></li><li> Quite la línea de entrada de la bolsa de tratamiento y almacenamiento y pesar el producto. </li><li> Coloque el producto en el iluminador y seguir los comandos de la pantalla para comenzar un tratamiento de plaquetas estándar. <ol><li> Introduzca ID del operador. </li><li> Seguros y montar la bolsa a la placa iluminador. </li><li> Introduzca el ID de la muestra en el Iluminador utilizando el lector de código de barras o el teclado de entrada manual. </li><li> Tipo de producto Scan. </li><li> Cierre la pinza de cuarzo. </li><li> El dispositivo de iluminación entregará automáticamente 6.24 J / ml de energía. El tiempo de tratamiento típico tarda 5-10 min. </li></ol></li><li> Después del tratamiento muelle estéril una &quot;línea 6 tubos con conector jeringa femenina en la línea de bulbo de la muestra del tratamiento y la bolsa de almacenamiento. Asegúrese de que el producto se mezcla bien y luego adjuntar una jeringa de 5 ml y extraer una muestra postratamiento 2 ml. <ol><li> Título del post-tratamiento samPLE por sección 4. </li></ol></li></ol> 4. bacteriana Titer <ol><li> Estimar el título de las muestras de pre-tratamiento y post-tratamiento y preparar el número apropiado de tubos de 5 ml de dilución necesarios para llevar a cabo una serie de dilución punto final de cada muestra. Asépticamente llenar los tubos necesarios con 1,8 ml de agua de peptona. </li><li> Titer cada muestra utilizando un esquema de dilución en serie de 10 veces. Transferir asépticamente 0,2 ml de la muestra sin diluir al primer tubo de dilución (10 -1). Vortex este tubo de dilución y la transferencia de 0,2 ml al siguiente tubo de dilución. Continuar la dilución en serie a través del número requerido de diluciones. <ol><li> Transferencia asépticamente 100 l de cada dilución a ser plateado a una placa de agar apropiado (Tabla 1). </li></ol></li><li> El uso de un esparcidor de células estéril, distribuir uniformemente la muestra en cada placa de agar. </li><li> Invierta e incubar las placas en las condiciones apropiadas ( <strong&gt; Tabla 1) durante 1-2 días de cheques para el crecimiento periódicamente. </li><li> Contar con placas 30-300 colonias. Las placas que contienen más de 300 colonias se consideran demasiado numerosos para contar (TNTC). Las placas que contenían menos de 30 colonias se consideran por debajo del límite de cuantificación (LOQ). </li><li> Calcular el título de cada muestra de prueba y registrar los resultados como UFC / ml. <ol><li> Utilice la siguiente ecuación para calcular UFC / ml: <img alt="Ecuación 1" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq1.jpg" width="250" /></li><li> Si no hay colonias en la placa de dilución más bajo, utilice la siguiente ecuación para calcular el límite de detección (LOD): <img alt="Ecuación 2" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq2.jpg" width="100" /> y <img alt="Ecuación 3" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq3.jpg" width="100" /> Dónde: N = menor número de partículas (UFC) en product que se puede detectar con confianza. P = probabilidad de que un microorganismo será sin ser detectado; para una confianza del 95% de la detección de un microorganismo, p = 0,05. V = volumen total de productos en ml v = volumen de chapado (ml) x nivel de dilución de la placa </li></ol></li><li> Para control negativo, la placa 0,5 ml de agua de peptona la que se utiliza para las diluciones en serie en cada uno de dos placas de agar. Utilice el mismo tipo de placa que las muestras a ensayar. Invierta e incubar la placa en las condiciones apropiadas para 1-2 días de cheques para el crecimiento periódicamente. <ol><li> Si se observa un crecimiento en cada placa de agar, la botella de agua de peptona utilizada debe ser desechada; los resultados del estudio también se invalidan. </li></ol></li><li> Para control positivo, vuelva a título de la cultura social de las bacterias que se utilizó. Invierta e incubar las placas en las condiciones apropiadas para 1-2 días de cheques para el crecimiento periódicamente. El título será de ± 1,0 log ufc / ml del registroed de la titulación (ver sección 1.5) para el estudio se considere válida. </li></ol>

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</ol>

Todos los autores de este trabajo se emplean actualmente por Terumo BCT, desarrollador y fabricante del sistema Mirasol PRT. Tasas de publicación de este video-artículo han sido pagados por Terumo BCT.

Detección bacteriana se ha convertido en una práctica común en las instituciones bancarias de la sangre y por muchos lugares que sirve como el principal método para evitar la transfusión de plaquetas contaminadas por bacterias. Aunque la detección de bacterias normalmente intercepta la mayoría de rápido crecimiento de bacterias Gram negativas como S. marcescens, E. coli y E. cloacae, que lucha para detectar crecimiento lento bacterias Gram positivas como S. aureus, Streptococcus spp. y S. epidermidis 8. Desafortunadamente, estas bacterias Gram positivas de tres están implicadas en más de 50% de todas las unidades de plaquetas contaminadas y la transfusión de plaquetas que contienen productos de estos tres organismos ha dado lugar a mortalidad de los pacientes 1. Detección bacteriana se basa en el título bacteriano en un producto de plaquetas que ser lo suficientemente suficientemente alta para que al menos un organismo está contenida dentro de la muestra típica de detección 4 a 8 ml. Si el título bacteriana no es suficientemente alto para que una bacteria a ser capturado en el volumen de la muestra 4-8 ml, la unidad se encuentra en posición incorrecta como negativa y se libera para la transfusión. Un enfoque alternativo para la detección bacteriana podría ser emplear un proceso proactivo que se pueden realizar en todas las unidades de plaquetas y que podrían hacer que los organismos contaminantes como no funcional. En este estudio, títulos elevados de bacterias se añaden intencionalmente a unidades de plaquetas para poner a prueba la capacidad total de la reducción del proceso de reducción de patógenos riboflavina y luz ultravioleta. Aunque las cargas bacterianas probadas en este estudio muy superiores a los que normalmente se encuentran en productos de la sangre en el momento de la donación, este estudio ayuda a demostrar que el proceso de riboflavina y luz ultravioleta es capaz de reducir significativamente el título de bacterias viables en una unidad de plaquetas contaminadas por 2.6 a 5.4 log (reducción de 99,7 a 99,9996% de bacterias contaminantes) (Figura 2). Para obtener una Accurate valor reducción logarítmica, es fundamental que el operador tiene buena técnica aséptica junto con las habilidades de pipeteo precisos al realizar los pasos de titulación bacterianas. Pipeteado imprecisa cuando se realizan diluciones en serie puede conducir a una acumulación de errores, por lo tanto una medición inexacta título. Los datos recogidos en este estudio apoya el trabajo previo con riboflavina y luz UV, que desafió el sistema contra bajo nivel, bacteriemia clínicamente relevante (&lt;20 UFC / unidad). El estudio anterior fue diseñado para imitar un evento de contaminación clínica real y los resultados mostraron riboflavina y luz UV fue eficaz para prevenir el crecimiento bacteriano durante el período de almacenamiento de plaquetas 7-día. Modelado basado en los datos del estudio anterior sugiere que las estimaciones de los riesgos actuales de contaminación bacteriana de los productos de plaquetas podrían reducirse hasta en un 98% desde los niveles actuales 8. El proceso de la luz UV riboflavina y se compara favorablemente con pantalla bacterianación, que sólo demostró una eficacia del 66% para detectar contaminantes bacterianos en las unidades de plaquetas cuando desafió con una carga bacteriana clínicamente relevante 8. Al igual que con todas las tecnologías, el tratamiento PRT de productos plaquetarios para prevenir complicaciones asociadas con unidades de plaquetas contaminadas por bacterias tiene sus limitaciones. Sistemas PRT no son eficaces contra las esporas bacterianas y no inactivan endotoxina, por lo tanto, incluso si un sistema PRT puede inactivar títulos elevados de bacterias Gram negativas la endotoxina restante todavía puede causar shock séptico en el receptor. PRT se realiza mejor temprano durante el almacenamiento antes de que las bacterias se pueden propagar a altos títulos. En conclusión, como se demuestra por la combinación de estos dos estudios, el proceso de riboflavina y luz UV es eficaz para reducir las cargas bacterianas de ambos organismos Gram negativas y Gram positivas y puede ofrecer una alternativa viable a la detección bacteriana. Rutinariamente treatinproductos g de plaquetas con riboflavina y luz ultravioleta también tiene el beneficio adicional de reducir la transmisión potencial de otros agentes de transmisión sanguínea como virus y parásitos.

La transfusión de plaquetas, plasma, glóbulos rojos envasados ​​y productos de sangre entera jugar un papel importante en la medicina moderna y se puede utilizar para tratar varias condiciones médicas, reemplazar los fluidos vitales y en última instancia salvar vidas. Las plaquetas son un producto celular que, o bien están aislados de la sangre entera y se agruparon en una dosis para transfusión o se recoge a través del proceso de aféresis de plaquetas. La función principal de las plaquetas en el cuerpo es para detener el sangrado en los sitios de la herida y para ayudar a mantener la hemostasia. Los pacientes que sufren de un recuento bajo de plaquetas (trombocitopenia) son susceptibles a eventos hemorrágicos espontáneos y se transfunden con plaquetas para llevar su celular recuento de plaquetas nuevamente dentro de un rango normal. Plaquetas recogidas se almacenan durante un máximo de 5-7 días y se almacenan a 22 ± 2 ° C, mientras que bajo agitación constante. A pesar del ahorro de las propiedades de las transfusiones de plaquetas vida permanece allí un ligero riesgo para los receptores de transfusiones debido a contamination de estos productos por parásitos, bacterias y virus 11. La aplicación de las pruebas de ácido nucleico viral (NAT) ha disminuido significativamente el riesgo de transmisión viral de los principales agentes transmitidos por la sangre, como el virus de la hepatitis C (VHC), virus de la hepatitis B (VHB) y el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) 5. Una publicación reciente de los Servicios de Sangre de Canadá estima que el riesgo residual de estos agentes sean 1 por 8.000.000 donaciones para el VIH, 1 por cada 6,7 millones de donaciones para el VHC y 1 por 1,7 millones de donaciones para el VHB 15. Aunque las bacterias normalmente cosechan menos atención en el público en general, la frecuencia de contaminación bacteriana en productos de plaquetas se ha estimado para ser tan alta como 1: 1000 7 y porque millones de productos de plaquetas se transfunden cada año muchos destinatarios están expuestos a complicaciones potencialmente peligrosas para la vida como sepsis 6. La investigación sugiere que la carga bacteriana en el momentode contaminación es bajo, &lt;100 unidades formadoras de colonias (UFC) / 2,16 de productos, sin embargo los ricos almacenamiento de medio ambiente y temperatura ambiente de nutrientes permite a las bacterias contaminantes a proliferar a peligrosamente altos títulos antes de la transfusión. En la actualidad, los métodos sólo aprobados disponibles para evitar que los productos contaminados por bacterias lleguen a un receptor de las plaquetas es a través del uso de sistemas de cultivo a base y punto de prueba rápida atención. En resumen, para sistemas de cultivo basado en productos plaquetarios se almacenan en un agitador a 22 ° C durante 12-24 horas para permitir que las bacterias proliferen en el producto, sobre el cual se extrae una muestra 4-8 ml del producto de plaquetas y se inoculó en una botella que contiene medios nutrientes. La botella se coloca en un instrumento que supervisa la botella para el crecimiento bacteriano. Si el instrumento detecta el crecimiento bacteriano en la botella que se encuentra en posición y la unidad de plaquetas correspondiente se descarta. Si bien este proceso es un éxito razonable en la detección de gro rápidoorganismos de las alas, muchas de las especies de crecimiento lento no crecen a un alto título suficiente para ser detectado, lo que crea la posibilidad de que las unidades de falsos negativos que se publicará para la transfusión 7,12,14,16,22. A diferencia de los sistemas de detección de la cultura basada, punto rápido de las pruebas de atención se realiza típicamente más adelante en el período de almacenamiento de plaquetas cuando la carga bacteriana se ha incrementado significativamente. Se requiere que los títulos superiores desde el punto de pruebas de atención son menos sensibles que los sistemas de cultivo basados, y sólo detectan de forma fiable las bacterias una vez que alcanzan un título ≥1 x 10 3 UFC / ml 17. Sin embargo este tipo de pruebas pueden proporcionar resultados dentro de 1 hora de muestreo. La variabilidad en el rendimiento de estas pruebas han dado lugar a la liberación de un producto falso negativo, causando una reacción séptico fatal en el receptor 9. Una forma alternativa para combatir el problema de la contaminación bacteriana de los productos de plaquetas es a través del uso rutinario de un proc reducción de patógenosess que pueden inactivar bacterias contaminantes en lugar de tratar de detectarlos. El uso de riboflavina como un fotosensibilizador, en combinación con la luz UV, se ha demostrado para reducir la infectividad de una amplia gama de contaminantes transmitidos por la sangre patógenos, incluyendo bacterias 3,4,8,10,19-21 .El uso de riboflavina y UV luz para la reducción de patógenos no es tóxico y no mutagénico y componentes ligeros tratados con riboflavina y UV han demostrado ser seguros para los receptores de transfusiones, así como para las personas que manipulan productos de la sangre 18. Brevemente, las moléculas de riboflavina pueden asociar con los ácidos nucleicos (ADN y ARN) de bacterias, parásitos, virus y cualquier célula nucleada (por ejemplo, células blancas de la sangre). La exposición a la luz UV se activa riboflavina, causando una alteración química a los grupos funcionales de los ácidos nucleicos (principalmente bases de guanina), evitando así la replicación y / o transcripción de los ácidos nucleicos y dejando el organismo inactivado 13. Células anucleado como placapermite y los glóbulos rojos no se ven afectados por la química riboflavina debido a la falta de ácido nucleico. El trabajo previo con la tecnología de riboflavina y luz ultravioleta evaluó un selecto grupo de bacterias usando un diseño experimental pretende imitar un producto de plaquetas contaminadas con una carga bacteriana clínicamente relevante (&lt;20 UFC / producto) 8. El objetivo de este estudio fue evaluar el proceso de la luz riboflavina y rayos UV contra la contaminación bacteriana título elevado (&gt; 1,0 x 10 5 UFC / ml) en productos de plaquetas tratadas en el plasma con el fin de medir la capacidad de reducción bacteriana total del sistema. Con base en los datos obtenidos de los estudios de hemovigilancia 1, se seleccionó un panel de que ocurren comúnmente organismos positivas negativas y gram gram para la evaluación en este estudio e incluyó las siguientes especies: Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Streptococcus mitis, Streptococcus pyogenes, Serratia marcescens, Yersinia enterocolitica ,Neotomae Brucella, Bacillus cereus (forma vegetativa), Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y Klebsiella pneumoniae. Todos los organismos, excepto B. cereus, se obtuvieron a partir de ATCC y se colocó en una prioridad en la obtención de cepas bacterianas que se habían identificado como estar aislado de los componentes sanguíneos. El B. cereus a prueba en este estudio es una cepa clínica aislada internamente a partir de un producto de plaquetas contaminadas.

<table><tbody><tr><td>Mirasol Iluminador</td><td>Terumo BCT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mirasol Bolsa de Tratamiento/Almacenamiento</td><td>Terumo BCT N</td><td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Analizador de Hematología</td><td>Beckman-Coulter</td><td>Ac&bull; T diff&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>analizador de gases en sangre</td><td>Siemens</td><td>RapidLab 1265&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de acoplamiento estéril</td><td>Terumo BCT</td><td>TSCD</td><td></td></tr><tr><td>incubadora de plaquetas</td><td>helmer</td><td>PC2200</td><td></td></tr><tr><td>incubadora orbital agitadora</td><td>Lab-Line</td><td>4628</td><td></td></tr><tr><td>incubadora seca</td><td>Fisher</td><td>Iso-temp</td><td></td></tr><tr><td>Clase II A/B3 cabina de bioseguridad</td><td>Thermo-forma</td><td>1286</td><td></td></tr><tr><td>selladora de tubos</td><td>Sebra</td><td>Smart Sealer II</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de sobremesa</td><td>IEC</td><td>Centra GP8R</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Jeringa</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>30 ml Jeringa</td><td>BD</td><td>309650</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Tubo de dilución</td><td>VWR</td><td>211-0058</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubo cónico</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>Micropipeta</td><td>Gilson</td><td>P-200</td><td></td></tr><tr><td>Micropipeta</td><td>Rainin</td><td>R-200</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de repetición</td><td>Eppendorf</td><td>4780</td><td></td></tr><tr><td>1-200 &micro; l Punta de filtro</td><td>Costar</td><td>4810</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Pipeta serológica desechable</td><td>Costar</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Pipeta serológica desechable</td><td>Costar</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>35 ml 500 &micro; M Riboflavina</td><td>Terumo BCT</td><td>35 mL 500 &micro; M&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Agar Brucella con 5% de Sangre de Caballo</td><td>BBL</td><td>221547</td><td></td></tr><tr><td>Brain Infusión de Corazón</td><td>Teknova</td><td>B9993</td><td></td></tr><tr><td>Agua de Peptona</td><td>BD</td><td>257087</td><td></td></tr><tr><td>Tripticasa Caldo de Soja</td><td>BD</td><td>299113</td><td></td></tr><tr><td>Tripticasa Agar de Soja</td><td>Remel</td><td>R01917</td><td></td></tr><tr><td>Suero de Caballo Inactivado por Calor</td><td>Gibco</td><td>26050</td><td></td></tr></tbody></table>

el tratamiento de los productos de plaquetas con riboflavina y luz uv: eficacia contra el alto título contaminación bacteriana

Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

La contaminación de las unidades de plaquetas por bacterias durante mucho tiempo ha sido reconocido como un riesgo de transfusión significativa debido a sus condiciones de almacenamiento después de la donación. Los productos se almacenan de forma rutinaria a 22 ° C en un agitador de agitación, una condición que puede promover el crecimiento bacteriano. Aunque el número total de bacterias que se cree que se introduce en un producto de plaquetas es extremadamente baja, estas bacterias pueden multiplicarse a un nivel muy alto título antes de la transfusión, potencialmente resultando en eventos adversos graves. El objetivo de este estudio fue evaluar un proceso de reducción de patógenos riboflavina basado contra un panel de bacterias que han sido identificados como contaminantes comunes de productos plaquetarios. Este panel incluye los siguientes organismos: S. epidermidis, S. aureus, S. mitis, S. pyogenes, S. marcescens, Y. enterocolitica, B. neotomae, B. cereus, E. coli, P. aeruginosa y K. pneumoniae. Cada unidad de plaquetas fue inoculado con una carga bacteriana de alta y las muestras se eliminó both antes y después del tratamiento. Una formación de colonias de ensayo, utilizando un sistema de puntos de la dilución final, se utilizó para determinar los pre-tratamiento y post-tratamiento títulos bacterianas. Log reducción se calculó restando el título de post-tratamiento desde el título de pre-tratamiento. Se observaron las siguientes reducciones logarítmicas: S. epidermidis 4,7 log (99,998%), S. aureus 4,8 log (99,998%), S. mitis 3,7 log (99,98%), S. pyogenes 2,6 log (99,7%), S. marcescens 4,0 log (99,99%), Y. enterocolitica 3,3 log (99,95%), B. neotomae 5,4 log (99,9996%), B. cereus 2,6 log (99,7%), E. coli ≥5.4 log (99,9996%), P. aeruginosa 4,7 log (99,998%) y K . pneumoniae 2,8 log (99,8%). Los resultados de este estudio sugieren que el proceso podría ayudar a reducir el riesgo de eventos adversos graves transfusión asociados con la contaminación bacteriana.

Se evaluó la reducción de las once especies bacterianas diferentes utilizando el proceso PRT basada riboflavina y luz ultravioleta. Estos agentes representan algunos de los contaminantes más comunes de los productos de plaquetas e incluyen cinco por bacterias Gram positivas y seis organismos Gram negativas. Al menos seis productos plaquetarios fueron evaluados por el organismo y cada producto se inoculó con suficientes bacterias para producir&gt; 1,0 x 10 5 CFU / ml título final de bacterias en el producto de plaquetas. Antes del tratamiento se tomó una muestra para determinar el título de pre-tratamiento, después de lo cual el producto de plaquetas se trata rápidamente con el proceso de riboflavina y UV. Después del tratamiento de los productos de plaquetas se observaron las siguientes reducciones logarítmicas: S. epidermidis 4,7 log (99,998%), S. aureus 4,8 log (99,998%), S. mitis 3,7 log (99,98%), S. pyogenes 2,6 log (99,7%), S. marcescens 4,0 log (99,99%), Y. enterocolitica 3,3 log (99,95%), B.neotomae 5,4 log (99,9996%), B. cereus 2,6 log (99,7%), E. coli ≥ 5,4 log (99,9996%), P. aeruginosa 4,7 log (99,998%) y K. pneumoniae 2,8 log (99,8%) (Figura 2). Todas las unidades cumplen las especificaciones del sistema como se ha indicado anteriormente para la riboflavina y el proceso UV. Las pruebas de reducción adicional se realizó con S. pyogenes utilizando capa leucocitaria plaquetas derivadas. No se observó ninguna diferencia significativa en la reducción de S. pyogenes en capa leucocitaria plaquetas derivadas frente a las plaquetas de aféresis (datos no mostrados). <img alt="Mesa 1" src="/files/ftp_upload/52820/52820table1.jpg" /> Tabla 1: Las condiciones de crecimiento para las especies bacterianas evaluadas utilizando riboflavina y luz ultravioleta. Un panel de ambas bacterias Gram positivas y Gram negativas que se han demostrado para contaminar productos plaquetarios se seleccionaron para este estudio. Las condiciones de crecimiento (temperatura y los medios de comunicación de tipo) que se utilizan para propagar y titer se muestran los organismos. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52820/52820fig1.jpg" /> Figura 1: Proceso de reducción de la luz patógeno riboflavina y rayos UV. La riboflavina se disolvió en 0,9% de solución salina a una concentración nominal de 500 mM. La solución fue estéril conectado y drenado en cada producto de plaquetas. Las bacterias se añadieron asépticamente a cada unidad de plaquetas y después se trataron con 6,2 J / ml de la energía UV (aproximadamente de 6-10 min). En este estudio in vitro de la unidad de plaquetas después del tratamiento se tomaron muestras para determinar el título bacteriana final. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52820/52820fig2.jpg" /> Figura 2: Reducción de las diferentes especies bacterianas cuando son tratados con riboflavina y luz ultravioleta riboflavina y luz UV se utiliza para reducir las cargas bacterianas de contaminantes bacterianos comunes de productos de plaquetas.. El log de ​​reducción 10 es la diferenciaentre el título medio de pre-tratamiento y el título medio después del tratamiento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52820/52820fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Las condiciones de almacenamiento de los productos de plaquetas crean un entorno ideal para que los contaminantes bacterianos se multipliquen a niveles peligrosos. El objetivo de este estudio fue utilizar un ensayo formador de colonias para evaluar un proceso de reducción de patógenos basado en riboflavina contra la contaminación bacteriana de alto título en productos plaquetarios humanos.

El tratamiento de los productos de plaquetas con riboflavina y luz UV: Eficacia contra el alto título contaminación bacteriana

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la reducción de contaminantes bacterianos comunes en productos de plaquetas mediante un proceso de reducción de patógenos basado en riboflavina y luz ultravioleta. Esto se logra primero preparando un stock de bacterias con alto título. El segundo paso consiste en obtener un producto plaquetario humano y evaluar la calidad celular de la unidad.A continuación, se administra riboflavina a la unidad de plaquetas y se inocula con una concentración conocida de bacterias. El paso final consiste en tratar la unidad con luz ultravioleta. En última instancia, la reducción bacteriana se mide comparando muestras antes y después del tratamiento para determinar bacterias viables mediante un ensayo de siembra por dilución en punto final.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el cribado bacteriano es que la riboflavina y la luz ultravioleta pueden inactivar otros patógenos como el VIH, el VHC, la malaria y Babesia. Las implicaciones de esta tecnología van más allá de los patógenos transmitidos por la sangre, ya que la tecnología también es capaz de inactivar los glóbulos blancos y los productos sanguíneos donados. Estos últimos se han asociado con eventos adversos en las transfusiones, como la enfermedad del injerto contra el huésped asociada a transfusiones.Primero se me ocurrió la idea de utilizar este método para inactivar patógenos en sangre mediante estudios que realizaba sobre la interacción de compuestos, compuestos fotoquímicos con ácidos nucleicos. La técnica aprovecha el hecho de que los patógenos, a diferencia de los glóbulos rojos, las plaquetas y las proteínas plasmáticas, contienen ácidos nucleicos genómicos esenciales para la replicación y la transmisión de enfermedades. Así, al dirigirnos a la química del ácido nucleico en el entorno de los productos sanguíneos presentes, podemos inactivar de manera más selectiva los patógenos, al tiempo que preservamos la calidad de los componentes de glóbulos rojos, plaquetas y proteínas plasmáticas. Demostración del procedimiento.Hoy serán Nick HOA, científico del laboratorio, y Denise Gilmore, técnica de laboratorio. Primero, prepare un frasco estéril de 250 mililitros que contenga 100 mililitros de medio de crecimiento específico para la bacteria de interés. Utilizando un asa de inoculación estéril, inocule una colonia bacteriana individual proveniente de una placa de cultivo por estría en el medio.A continuación, coloque el frasco en un incubador con agitación orbital. Ajuste la velocidad del agitador a 140 RPM e incube la cultura durante uno o dos días. Revise periódicamente la cultura para observar el crecimiento bacteriano.Después de la incubación, transfiera la suspensión bacteriana a dos tubos cónicos estériles de 15 mililitros. Centrifugue los tubos a 3000 ×g durante 20 minutos a 23 °C. A continuación, aspire el sobrenadante y resuspenda el pellet bacteriano con 15 mililitros de agua estéril para péptidos.Vortexee los tubos para ayudar a la suspensión y luego reúna los cultivos bacterianos resuspendidos para concentrar el cultivo patrón. Llene cinco tubos de dilución con 1,8 mililitros de agua peptónica cada uno. Transfiera 200 microlitros de la muestra sin diluir al primer tubo, vortexee el tubo y luego transfiera 200 microlitros al siguiente tubo.Repita hasta alcanzar la dilución adecuada. Transfiera 100 microlitros de cada dilución a una placa de agar apropiada. Utilizando un espátula estéril, extienda uniformemente. Distribuya la muestra a través de la AER para una placa de control negativo.500 microlitros del agua con péptido sobre dos placas de agar. Utilizando un espátula estéril, distribuya uniformemente la muestra sobre la superficie del agar, invierta todas las placas e incúbelas a la temperatura adecuada durante uno o dos días tras la incubación. Si se observa crecimiento en cualquiera de las placas de control negativo, el agua con péptido está contaminada y el título es inválido.Si las placas del control negativo son negativas, cuente las colonias en todas las placas que tengan entre 30 y 300 colonias. Luego calcule el título de cada muestra de prueba y registre los resultados para obtener algunos por mililitro. Refrigere las culturas bacterianas durante hasta dos semanas a cuatro grados Celsius.Para obtener precisión, reajuste el cultivo antes de usarlo. Obtenga un producto estándar de plaquetas humanas por aféresis de entre 90 y 360 mililitros, con una concentración de 0,80 a 3,8 millones de plaquetas por microlitro. Deje reposar la bolsa durante al menos dos horas en un incubador de plaquetas a 22 grados Celsius y luego agite suavemente a 60 RPM hasta su uso.Extraiga una muestra de dos mililitros del producto de plaquetas y utilice un analizador de gases sanguíneos a 22 grados Celsius para asegurarse de que el pH sea superior a 6,6. Con la misma muestra, mida la concentración de plaquetas mediante un analizador hematológico para verificar que se encuentre dentro del rango deseado. A continuación, inspeccione visualmente la bolsa de plaquetas sosteniéndola bajo una fuente de luz blanca directa.Presione brevemente la bolsa y observe el patrón de remolino de la muestra. Si persiste una homogeneidad turbia antes y después de presionar la bolsa, no utilice las plaquetas con un dispositivo de acoplamiento de tubos. Transfiera las plaquetas a una bolsa de almacenamiento e iluminación con riboflavina y luz ultravioleta.Retire la bolsa vacía de plaquetas utilizando un sellador de tubos y deséchela como residuo biopeligroso. A continuación, retire el envoltorio exterior protector de la luz de la solución stock estéril de riboflavina a 500 micromolar. Acople la bolsa de riboflavina a la línea de entrada de la bolsa de tratamiento y almacenamiento, y drene su contenido en la unidad de plaquetas.Luego, cuelgue el bolsa y el conjunto de la bolsa de tratamiento de la bolsa de riboflavina. Presione suavemente para expulsar el aire residual de la bolsa de tratamiento y hacia la bolsa de riboflavina. Enjuague cualquier riboflavina residual hacia la bolsa de plaquetas con una pequeña cantidad de producto de plaquetas.Deje que la solución de riboflavina y plaquetas drene nuevamente hacia la bolsa de tratamiento. Luego, cierre la línea de entrada con una pinza. Retire la bolsa vacía de riboflavina utilizando el sellador de tubos y deseche la bolsa vacía de manera adecuada y estéril.Conecte una línea de tubo de seis pulgadas con un conector de jeringa hembra al conducto de entrada de la bolsa de iluminación y almacenamiento. Fije el cilindro de una jeringa de 10 mililitros a la línea de tubo. A continuación, agregue cinco mililitros de la suspensión de tallos bacterianos al cilindro de la jeringa.Luego abra la pinza de la línea de entrada y permita que las bacterias drenen hacia el producto de plaquetas. Enjuague el cuerpo de la jeringa permitiendo que algo del producto de plaquetas fluya de regreso. Después del enjuague, retire el cuerpo de la jeringa.Coloque una jeringa de 30 mililitros y enjuague el puerto de entrada al menos dos veces después de que el producto esté bien mezclado. Utilice una jeringa limpia de cinco mililitros y extraiga una muestra de dos mililitros previa al tratamiento. Use una jeringa nueva para eliminar cualquier aire introducido en la bolsa.Luego retire la línea de entrada de la bolsa de tratamiento y pese la solución de plaquetas. Comience el tratamiento de las plaquetas ingresando primero el identificador del operador y luego coloque la bolsa en el iluminador pla. A continuación, ingrese el identificador de la muestra utilizando un lector de códigos de barras.Introduzca el tipo de producto y su peso en el software. A continuación, cierre la pinza de cuarzo para entregar automáticamente 6,24 julios por mililitro de energía ultravioleta. El tratamiento típico dura de cinco a 10 minutos.Mientras tanto, titule la muestra previa al tratamiento tras la exposición a UV, titule una muestra posterior al tratamiento para evaluar la supervivencia bacteriana y luego titule el cultivo bacteriano stock como control positivo. La titulación del cultivo stock debe estar dentro de una unidad logarítmica de UFC por mililitro respecto a su titulación registrada. Se evaluó la reducción de 11 especies bacterianas diferentes mediante un proceso de tecnología de reducción de patógenos basado en riboflavina y luz UV.Se evaluaron al menos seis productos de plaquetas por organismo y cada uno fue inoculado. Con una cantidad suficiente de bacterias, se obtuvieron muestras con una titulación final mayor de 10.000 UFC por mililitro antes del tratamiento, así como inmediatamente después del tratamiento con riboflavina y luz UV, en comparación con las soluciones previas al tratamiento. Todas las cargas bacterianas se redujeron en al menos 2,6 unidades logarítmicas, aproximadamente 400 veces, mediante el tratamiento con riboflavina y luz UV.Tras estos estudios con bacterias de título elevado, se pueden realizar estudios adicionales utilizando títulos de inóculo más clínicamente relevantes. Estos representan en realidad los niveles de bacterias que podrían estar presentes en los productos en el momento de la donación. El objetivo de esos estudios con inóculo de título bajo es evaluar la capacidad del método para prevenir el crecimiento bacteriano y permitir que se mantengan negativos por cultivo durante el período de almacenamiento, incluyendo períodos prolongados de almacenamiento a temperatura ambiente.Tras la introducción de esta tecnología, se ha permitido a investigadores y profesionales médicos evaluar la capacidad de inactivar un amplio espectro de patógenos y utilizar esta tecnología para prevenir la propagación de enfermedades transmitidas por transfusión. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la reducción logarítmica de bacterias en un producto plaquetario altamente contaminado tratado con riboflavina y luz ultravioleta.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

En este artículo se describe el proceso utilizado por el Hospital Universitario de Örebro para producir dosis doble capa leucocitaria concentrados de plaquetas preparado a partir de donaciones de sangre entera y tratados con el sistema sanguíneo INTERCEPT para la inactivación de patógenos.

Preparación e inactivación de patógenos de Double Dose productos plaquetarios capa leucocitaria usando el sistema sanguíneo INTERCEPT

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Inactivación de bacterias mediante mononucleótido de flavina activado por luz

Fuente: Cheng, C., et al. Inactivación de patógenos mediante fotólisis con luz visible de riboflavina-5′-fosfato. J. Vis. Exp. (2022).En este video, una mezcla de reacción tamponada que contiene L-metionina, nitro azul tetrazolio (NBT) y mononucleótido de flavina (FMN) se irradia con luz violeta para inducir la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). Esto conduce a la inactivación bacteriana y a la formación de formazán detectable espectrométricamente.

Cuantificación de la inactivación bacteriana inducida por la luz a través de la generación de especies reactivas de oxígeno

Fuente: Zhao, K., et al. Un modelo in vitro para estudiar el efecto de la terapia fotodinámica mediada por ácido 5-aminolevulínico sobre el biofilm de Staphylococcus aureus . J. Vis. Exp. (2018)El vídeo muestra un protocolo de terapia fotodinámica para evaluar los efectos antibacterianos en biopelículas bacterianas Gram-positivas. Las biopelículas se dividen en cuatro grupos: dos reciben un precursor fotosensibilizador y dos reciben un tampón. Todos son incubados en la oscuridad, seguidos de la...

Tratamiento activado por luz de biopelículas bacterianas utilizando un precursor fotosensibilizante

Este video muestra el proceso de reducción de patógenos basado en riboflavina y luz ultravioleta contra la contaminación bacteriana de alto título en productos de plaquetas humanas. Este proceso podría ayudar a reducir el riesgo de eventos adversos graves de transfusión asociados con la contaminación bacteriana.

Un tratamiento de riboflavina y luz ultravioleta de productos plaquetarios para eliminar bacterias

Implante asociada a la infección es una complicación clínica significativa. Este estudio describe un enfoque utilizando plasma rico en plaquetas (PRP) para prevenir infecciones relacionados con el implante, presenta el protocolo para la preparación de PRP con concentración de plaquetas constante, e informa de las propiedades antimicrobianas de los recientemente identificados PRP y protocolos relacionados para examinar tales propiedades...

PRP como un nuevo enfoque para prevenir la infección: Preparación y<em&gt; In vitro</em&gt; Propiedades antimicrobianas de PRP

Aquí, presentamos un protocolo para inactivar bacterias patógenas con especies reactivas de oxígeno producidas durante la fotólisis del mononucleótido de flavina (FMN) bajo irradiación de luz azul y violeta de baja intensidad. Se ha demostrado que la fotólisis FMN es un método simple y seguro para procesos sanitarios.

Inactivación de patógenos mediante fotólisis con luz visible de riboflavina-5′-fosfato

La formación de plaquetas procoagulantes se ha correlacionado con un mayor riesgo de trombosis. Aquí se presenta un protocolo preciso para aislar plaquetas lavadas de la sangre humana, destinado a cuantificar la exposición a la fosfatidilserina y la liberación de microvesículas, que son características distintivas de las plaquetas procoagulantes.

Caracterización de plaquetas procoagulantes mediante la medición de la exposición a fosfatidilserina y la liberación de microvesículas de plaquetas humanas purificadas

Se puede evaluar la función plaquetaria bajo flujo y se puede modelar la reanimación hemostática simulada utilizando un dispositivo microfluídico, que tiene aplicaciones en medicina traumatológica y transfusional.

Microfluídica en la evaluación de la función plaquetaria

Un ensayo parásito-rescate y la transformación con células THP1...

A Parasite Rescate y Transformación de ensayo para la detección antileishmanial contra intracelular<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigotes en THP1 Humanos aguda línea celular de leucemia monocítica

Aprende a evaluar la reducción de contaminación bacteriana en productos plaquetarios mediante el tratamiento con riboflavina y luz UV. Este método mejora la seguridad transfusional preservando la calidad de los componentes sanguíneos.

El tratamiento de los productos de plaquetas con riboflavina y luz UV: Eficacia contra el alto título contaminación bacteriana

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