Name: Diferenciación neural de células madre embrionarias de ratón en el suero libre de monocapa Cultura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Aprende a diferenciar células madre embrionarias de ratón en progenitores neuronales mediante cultivo monocapa sin suero. Este protocolo permite generar tipos celulares neuronales maduros y escalar a formato multipocillo para cribado de compuestos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

El trabajo fue financiado por una beca de Desarrollo y Promoción de la Ciencia y la Tecnología del Ministerio de Educación de Tailandia para W.W. y subvenciones de Tenovus y Anonymous Trust para M.P.S.

1. Preparación de Medios NOTA: El protocolo se basa en el uso de una mezcla de dos por separado medios de comunicación: DMEM / F12 suplementado con suplemento N2 modificado y Neurobasal suplementado con suplemento B27, típicamente en una relación 1: 1. <ol><li> Preparar el suplemento N2 modificado por mezcla de los componentes en un tubo de 15 ml. No vórtice o filtrar esto; mezclar invirtiendo el tubo hasta que la solución es clara. <ol><li> Comience con la pipeta 7,2 ml de DMEM / F12, a continuación, añadir 1 ml de 25 mg / ml de insulina (compuesto en HCl 0,01 M) y mezclar bien invirtiendo el tubo. Se tarda un par de minutos hasta que la solución es clara. </li><li> Añadir 1 ml de 100 mg / ml, apo-transferrina (compuesto en agua), 33 l de 0,6 mg / ml progesternone (compuestos en etanol), 100 l de 160 mg / ml (1 M) putrescina (compuesto en el agua ), 10 l de selenito de sodio 3 mM (compuesto en agua) y 666 l de 7,5% de albúmina de suero bovino y mezclar bien el tubo. Alícuota en 2,5 ml y se almacena a -20 °C durante un máximo de 2 meses. </li></ol></li><li> Preparar los medios de comunicación. <ol><li> Para 250 ml de DMEM / F12 añadir 2,5 ml de N2. Mezclar bien pero no sacuda o filtro. </li><li> Para 250 ml de Neurobasal noticias agregar 5 ml de suplemento de B27. Mezclar bien pero no sacuda o filtro. </li><li> Mezclar los medios de comunicación de los pasos 1.2.1 y 1.2.2 en una proporción de 1: 1. En algunos casos una mezcla 1: 3 puede ser necesaria (complementado como la mezcla 1: 1 en el paso 1.2.4). </li><li> Para la mezcla de añadir 0,5 ml de L-glutamina (concentración final 0,2 mM) y 3,5 l de 2-mercaptoetanol (concentración final 0,1 mM) y mezclar bien sin agitación. Almacene el papel a 4 ° C durante un máximo de 3 semanas y evitar la exposición a la luz. Esta mezcla final se llama N2B27. </li></ol></li><li> Preparar la solución de gelatina. <ol><li> Preparar una solución de gelatina al 1% en agua ultrapura y autoclave a 121 ° C, 15 psi, durante 15 min. Es importante que la botella se utiliza para esto es completamente limpio de los detergentes o desinfectantes, por lo que se recomienda que una nueva botella esutilizado para esto y es sólo alguna vez se enjuaga en agua ultrapura entre usos. Alícuota la solución al 1% en 50 ml alícuotas y mantenga a 4 ° C durante meses. </li><li> Calentar una alícuota del 1% de gelatina en un baño de agua a 37 ° C hasta que se disuelva y añadir a 500 ml de solución salina tamponada con fosfato caliente (PBS). Mezclar bien y pipetear suficiente para cubrir el fondo de cada pocillo o placa. Permitir la gelatina para recubrir la superficie de al menos 30 minutos. </li></ol></li></ol> 2. Plating las células NOTA: Este protocolo se aplica igualmente a ESC de ratón cultivadas en 10% de suero con el factor inhibidor de la leucemia (LIF), la sustitución de suero con LIF o medio libre de suero con LIF y proteína morfogenética ósea 4 (BMP4) o inhibidores de MEK y GSK3 (medios 2i) con o sin LIF. Sin embargo, el momento y la eficiencia de la diferenciación pueden variar en función de los medios de comunicación y las células (véase la discusión). Para los experimentos que se muestran aquí utilizamos la línea 46C ratón ESC (que tiene un reportero EGFP noqueó en one de los alelos Sox1 endógenos), que se cultiva en GMEM con 10% de suero y LIF. Para obtener resultados óptimos es importante que las células se disocian y se volvieron a sembrar en los medios N2B27; simplemente cambiando de medios de comunicación de GMEM / suero / LIF a N2B27 siempre resulta en una eficiencia de diferenciación reducida en comparación con resiembra las células. <ol><li> Cultivar las células en GMEM con 10% de suero, piruvato de sodio 1 mM, aminoácidos no esenciales 1x, 0,1 M 2-mercaptoetanol, y 100 unidades / LIF 13 ml. Para conseguir una cultura subconfluente de ratón CES, la placa 1 x 10 6 células en un cultivo en matraz T25 que se llevará a 2-3 días. </li><li> Observar las células bajo el microscopio de campo claro. Cuando las células son subconfluent y listo para pasaje, enjuagarlos dos veces en PBS. Añadir 1 ml de reactivo de disociación de células y volver a la incubadora durante 2 - 5 min. Aunque la tripsina y otras enzimas también pueden ser utilizados para la disociación celular, que pueden tener un impacto negativo en la unión de células de modo que las densidades de chapado tendrán que ser Adjusted. </li><li> Una vez que las células están empezando a levantar de la placa, toque el recipiente para desalojar en una sola suspensión celular. Recoger las células en un total de 10 ml de medios de comunicación y de disociación celular reactivo y pipeta en un tubo de centrífuga de 15 ml. </li><li> Girar las células a 300 xg durante 3 min a TA. </li><li> Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender el precipitado en 10 ml de pre-calentado N2B27 pipeteando arriba y abajo de 3 - 5 veces. Cuando pipeteando la suspensión hacia abajo, pipeta contra el lado del tubo para evitar la creación de burbujas. Contar las células con un contador de células automatizado o un hemocitómetro y registrar la concentración. </li><li> Preparar una suspensión de células que contiene el número deseado de células por unidad de volumen que se plateado por pocillo en pre-calentado N2B27. Una densidad de 10.500 células por cm 2 en una placa de 6 pocillos (es decir, 1 x 10 5 células por pocillo de una placa de 6 pocillos) es óptima. Ver Tabla 1 para sugerido número de células por cm 2 y plavolúmenes de medios ting para una variedad de recipientes de cultivo celular. </li><li> Aspirar la gelatina del recipiente de cultivo y la placa la suspensión celular de acuerdo con la densidad y el volumen sugerido en la Tabla 1. No agitar las placas ya que esto concentrar las células hasta el centro. Coloque las culturas en una incubadora húmeda a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Cambie medios cada 1 - 2 días reemplazando todos los medios de comunicación con N2B27 fresco. Pipeta suavemente como el lavado de las células podría afectar la densidad y disminuir la eficiencia de la diferenciación en los siguientes días. Dónde viabilidad inicial después de la siembra es pobre, la placa de las células en una mezcla 1: 3 de los medios de comunicación N2 y complementados-B27 y cambiarlo a N2B27 después de los dos primeros días. Las células se empiezan a diferenciar y deben mostrar la expresión Sox1 (visible por fluorescencia verde del reportero en la línea celular 46C utilizado aquí) dentro de 4-6 días. </li></ol> 3. La tinción de inmunofluorescencia NOTE: El protocolo se puede aplicar a cualquier tipo de recipiente. El volumen de cada reactivo se describe por pocillo de placa de 6 pocillos y se puede escalar a cualquier superficie. Replating no se recomienda debido a la viabilidad baja después. <ol><li> Quitar medio de diferenciación y fijar las células mediante la adición de 500 l de 4% (v / v) paraformaldehído, dejar durante 15 min. </li><li> Lavar y permeabilizar las células con 2 ml de PBS-T (solución salina tamponada con fosfato con 0,5% (v / v) de Tween-20) dos veces. Las células se pueden mantener en PBS-T para un máximo de 2 meses a 4 ° C. </li><li> Reemplazar PBS-T con 1 ml de PBS-T con 10% (v / v) de suero (de la misma especie que el anticuerpo secundario). Incubar 1 hora en el balancín placa a temperatura ambiente para bloquear cualquier unión no específica. </li><li> Después de 1 hora, se lavan las células dos veces con 2 ml de PBS-T, y se incuban en 500 l de IgG de ratón contra βIII-tubulina (diluido 1: 1000 en PBS-T con 10% de suero). Poner en el plato oscilante, y dejar de O / N a 4 ° C. </li><li> Desde este paso, siempre proteger el buquede la luz. Lavar las células dos veces con PBS-T, a continuación, añadir 500 l de anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con fluorescencia (diluido a 2 g / ml en PBS-T con 10% de suero). Póngalo en la placa oscilante durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Enjuagar las células dos veces con PBS-T, a continuación, añadir 500 l de DAPI (diluido a 0,5 mg / ml en PBS-T) y se deja durante 5 min. </li><li> Lavar las células de nuevo y mantenerlos en PBS-T. Las células están listas para ser fotografiados y se pueden mantener durante un máximo de 2 semanas a 4 ° C. Tenga en cuenta que la señal de las buenas prácticas agrarias se desvanece con el tiempo por lo que es inapropiado comparar la intensidad de las buenas prácticas agrarias de células fijadas y en directo o de células fijadas en diferentes momentos. </li></ol>

<ol><li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo-derived+stem+cells%3A+of+mice+and+men%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryo-derived stem cells: of mice and men.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).</li>
<li>Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+express+neuronal+properties+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro.</a> Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).</li>
<li>Fraichard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro.+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+glial+cells+and+functional+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">In vitro. differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons.</a> J. Cell Sci. 108, 3181-3188 (1995).</li>
<li>Strubing, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+into+the+neuronal+lineage+in+vitro+gives+rise+to+mature+inhibitory+and+excitatory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons.</a> Mech. Dev. 53, 275-287 (1995).</li>
<li>Stavridis, M. P., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Biochem Soc Trans. 31, 45-49 (2003).</li>
<li>Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+embryonic+stem+cells+into+neuroectodermal+precursors+in+adherent+monoculture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture.</a> Nat Biotechnol. 21, 183-186 (2003).</li>
<li>Ying, Q. L., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+conditions+for+neural+commitment+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Defined conditions for neural commitment and differentiation.</a> Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).</li>
<li>Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+discrete+period+of+FGF-induced+Erk1%2F2+signalling+is+required+for+vertebrate+neural+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification.</a> Development. 134, 2889-2894 (2007).</li>
<li>Stavridis, M. P., Collins, B. J., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+orchestrates+fibroblast+growth+factor+signalling+to+drive+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid orchestrates fibroblast growth factor signalling to drive embryonic stem cell differentiation.</a> Development. 137, 881-890 (2010).</li>
<li>Speakman, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+O-GlcNAc+Levels+Activate+Epigenetically+Repressed+Genes+and+Delay+Mouse+ESC+Differentiation+Without+Affecting+Naive+to+Primed+Cell+Transition%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Elevated O-GlcNAc Levels Activate Epigenetically Repressed Genes and Delay Mouse ESC Differentiation Without Affecting Naive to Primed Cell Transition.</a> Stem Cells. 32, 2605-2615 (2014).</li>
<li>Kunath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+stimulation+of+the+Erk1%2F2+signalling+cascade+triggers+transition+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+from+self-renewal+to+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment.</a> Development. 134, 2895-2902 (2007).</li>
<li>Dani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+induction+of+stem+cell+renewal+by+LIF-deficient+cells%3A+a+new+ES+cell+regulatory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Paracrine induction of stem cell renewal by LIF-deficient cells: a new ES cell regulatory pathway.</a> Dev Biol. 203, 149-162 (1998).</li>
<li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Culture+Methods%22%5BJournal%5D)">Culture and differentiation of embryonic stem cells.</a> Journal of Tissue Culture Methods. 13, 89-94 (1991).</li>
<li>Aubert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+mammalian+neural+genes+via+fluorescence-activated+cell+sorter+purification+of+neural+precursors+from+Sox1-gfp+knock-in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Screening for mammalian neural genes via fluorescence-activated cell sorter purification of neural precursors from Sox1-gfp knock-in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, Suppl 1. 11836-11841 (2003).</li>
<li>Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+is+mediated+via+activation+of+STAT3%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3.</a> Genes Dev. 12, 2048-2060 (1998).</li>
<li>Silva, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Capturing pluripotency.</a> Cell. 132, 532-536 (2008).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo de diferenciación neural monocapa ha estado en uso durante más de una década 6. El protocolo es altamente eficiente, compuesto de medio definido, y hecho en un sistema monocapa que hace que el sistema sea más aplicable para preclínica (por ejemplo, detección de drogas) utiliza. Sin embargo, hay algunos factores críticos que determinan la eficiencia de diferenciación. Este artículo señala los factores y la solución para cada obstáculo. Densidad de las células ...

Las células madre embrionarias son células pluripotentes derivadas de embrión temprano con la capacidad de proliferar indefinidamente in vitro conservando la capacidad de diferenciarse en todos los tipos celulares adulto siguientes reintroducción en un embrión etapa apropiada (mediante la formación de una quimera), la inyección en singénicos o inmunocomprometidos hosts (mediante la formación de un teratoma) o in vitro sujetos a las señales apropiadas 1. La diferenciación in vitro de células madre embrionarias de ratón en linajes neuronales fue descrita por primera vez en 1995 y consistió en la formación de agregados de suspensión multicelulares (cuerpos embrionarios, EBS) en medios que contienen suero complementado con el ácido retinoico morfógeno 2-4. Desde entonces una variedad de protocolos han sido desarrollados para permitir la diferenciación neural 5. Muchos todavía utilizar la agregación, otros co-cultivo con la inducción de tipos de células y varios implican el uso de medios libres de suero. Todos los protocolos tienen ventajas unasnd desventajas y la naturaleza precisa de neural o células neuronales producidas también varía de acuerdo con el protocolo utilizado. El protocolo ideal sería que robusto, escalable y hacer uso de los medios de comunicación y sustratos completamente definidos, ser susceptibles de monitorización no invasiva del proceso de diferenciación y el resultado en la generación de poblaciones puras de progenitores neurales capaz de ser modelada por las señales externas y para diferenciar en todos los subtipos neuronales y gliales con alta eficiencia y rendimiento en un tiempo relativamente corto. En los últimos doce años hemos estado utilizando un método para generar células progenitoras neuronales y neuronas de ratón CES en una baja densidad, la cultura monocapa adherente sin suero 6-10. Este protocolo cumple muchos de los criterios establecidos anteriormente: en nuestras manos la eficiencia de diferenciación ha sido bastante constante durante muchos años y una variedad de líneas celulares, se puede escalar hacia arriba o hacia abajo (que utilizamos con éxito buques de placas de 96 pocillos a 15 cm de diámetro diella es) y los medios utilizados están bien definidos. El proceso es susceptible de microscopía timelapse para el seguimiento de la diferenciación y una variedad de señales de modelado puede ser añadido para inducir la generación de distintos tipos de subtipos neuronales (por ejemplo, Shh y Fgf8 para las neuronas dopaminérgicas 6). Sin embargo, hay algunos retos para la aplicación exitosa de este protocolo. Uno de los aspectos clave es la preparación cuidadosa de los medios de comunicación. Siempre nos preparamos los medios de comunicación en la empresa a pesar de la disponibilidad de alternativas comerciales. Uno de los suplementos utilizados (N2; véase el Protocolo) tiene modificaciones sobre el estándar versiones disponibles en el mercado. Por último, uno de los pasos más importantes para la aplicación exitosa de este método es la densidad celular óptima en chapado. Esto es principalmente porque mientras que la naturaleza autocrina de una de las señales que inducen (Fgf4 11) requiere que las células están presentes suficientes para permitir viabil óptimadad y la diferenciación, a muy altas densidades de diferenciación se deteriora (posiblemente en parte debido a la producción autocrina de LIF 12). Por ello es importante que la preparación tanto de los medios y chapado celular se realizan con cuidado y consistentemente para asegurar resultados óptimos.

<table><tbody><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-074</td><td></td></tr><tr><td>Medio neurobasal</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase Reactivo de disociación celular</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplemento, sin suero</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td>Reconstituir con HCl estéril 0,01 M</td></tr><tr><td>Apo-transferrina</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td>Reconstituir con agua estéril</td></tr><tr><td>Progesterona</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td>Reconstituir con etanol</td></tr><tr><td>Putrescina</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td>Reconstituir con agua estéril</td></tr><tr><td>Selenito de sodio</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td>Reconstituir con agua estéril</td></tr><tr><td>Fracción de albúmina bovina V</td><td>Life Technologies</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Asegúrese de que esté completamente disuelto antes de usarlo, ya que la glutamina suele estar sedimentada</td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>GMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11710-035</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solución de aminoácidos no esenciales</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>Factor inhibidor de la leucemia</td><td>preparado internamente como en Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidino-2-fenilindol diclorhidrato (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>Proteger de la luz</td></tr><tr><td>Ratón anti y beta; III anticuerpo IgG de tubulina</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo IgG antiratón marcado con fluorescencia</td><td>Life Technologies</td><td>A31571</td><td>Proteger de la luz</td></tr><tr><td>Matraz de cultivo de tejidos de 25 cm2</td><td>Thermo Scientific</td><td>156367</td><td></td></tr></tbody></table>

diferenciación neural de células madre embrionarias de ratón en el suero libre de monocapa cultura

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

La capacidad para diferenciar las células madre embrionarias de ratón (ESC) a progenitores neurales permite el estudio de los mecanismos que controlan la especificación neural, así como la generación de tipos de células neuronales maduros para el estudio adicional. En este protocolo se describe un método para la diferenciación de ESC para progenitores neurales utilizando suero libre, la cultura monocapa. El método es escalable, eficaz y resulta en la producción de ~ 70% de células progenitoras neurales dentro de 4 - 6 días. Se puede aplicar a ESC de diversas cepas cultivadas bajo una variedad de condiciones. Progenitores neurales se puede permitir que diferenciar aún más en neuronas funcionales y glía o analizado mediante microscopía, citometría de flujo o técnicas moleculares. El proceso de diferenciación es susceptible de microscopía de lapso de tiempo y se puede combinar con el uso de líneas de reportero para supervisar el proceso de especificación neural. Proporcionamos instrucciones detalladas acerca de la preparación de los medios de comunicación y la optimización de la densidad celular para permitir que el proceso de abe aplica a la mayoría de las líneas de la ESC y una variedad de recipientes de cultivo celular.

En este experimento, se utilizó la línea celular 46C 14, las células madre embrionarias de ratón con un reportero Sox1-GFP endógeno, para rastrear la diferenciación neuronal. Mediante el uso de esta línea celular, la expresión de Sox1, un marcador de progenitor neural, puede ser detectado por fluorescencia verde. Revestimiento de densidad es un factor crítico para lograr la diferenciación neuronal. Las células madre embrionarias de ratón se sembraron en placa de 6 pocillos a diferentes densidades que varían d...

Este protocolo describe en detalle el método para generar progenitores neurales a partir de células madre embrionarias utilizando un método de monocapa sin suero. Estos progenitores se pueden utilizar para derivar tipos de células neuronales maduras o para estudiar el proceso de especificación neuronal y son susceptibles de escalado en formato multipocillo para el cribado de compuestos.

Diferenciación neural de células madre embrionarias de ratón en el suero libre de monocapa Cultura

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

El objetivo general de este procedimiento es diferenciar células madre embrionarias de ratón hacia una línea neural en un cultivo celular monocapa libre de suero. Esto se logra primero recubriendo el recipiente de cultivo con gelatina. En el segundo paso, las células madre embrionarias se disocian en una suspensión de células individuales en medio de diferenciación y se diluyen a las densidades de siembra adecuadas.En el paso final, las células se siembran en la placa recubierta con gel ENC. Finalmente, se utiliza microscopía de inmunofluorescencia para confirmar el éxito de la diferenciación mediante la visualización de los marcadores neuronales de interés. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades, ya que sembrar con la densidad adecuada es fundamental para lograr una buena diferenciación.Y existen varios factores que afectan la densidad de siembra tanto directa como indirectamente. Antes de sembrar las células, caliente un alícuota de gelatina al 1 % en un baño de agua a 37 °C hasta que se disuelva. Luego, mezcle la gelatina con 500 mililitros de PBS tibio y cubra el fondo del recipiente de cultivo celular con la cantidad suficiente de la solución para recubrir la superficie mientras la gelatina realiza el recubrimiento.Lave dos veces la cultura subconfluente de células madre embrionarias de ratón con PBS. A continuación, añada un mililitro de reactivo de disociación a la cultura. Tras dos a cinco minutos, golpee suavemente el recipiente para desprender la monocapa y obtener una suspensión de células individuales, y recoja la cultura en un volumen total de 10 mililitros de medio y reactivo de disociación celular.Transfiera las células a un tubo cónico de 50 mililitros y centrifúgelas. Luego, tras la aspiración cuidadosa del sobrenadante, re suspenda el precipitado en 10 mililitros de N2B27 precalentado, pipeteando contra la pared del tubo. Para evitar la formación de burbujas, cuente ahora las células registrando la concentración y vuelva a suspenderlas en el número adecuado de células por unidad de volumen por pocillo en N2B27 precalentado, según la tabla.Luego aspire la gelatina del recipiente de cultivo y siembre las células sin agitar el recipiente. Coloque los cultivos en un incubador húmedo a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono. Reemplace el medio cada uno o dos días.Con N fresco B 27, las células comenzarán a diferenciarse y a expresar socks, una expresión dentro de los cuatro a seis días para teñir las células mediante imágenes de inmunofluorescencia. Retire el medio de diferenciación de los cultivos y fije las células en 500 microlitros de paraformaldehído al 4 %; después de 15 minutos, lave y permeabilice las células dos veces con dos mililitros de PBS con tween. A continuación, bloquee cualquier unión no específica mediante una incubación de una hora de las células.En un mililitro de PBS con tween suplementado con suero sobre un agitador de placas después de lavar las células como se acaba de demostrar. Añadir 500 microlitros de IgG de ratón contra beta tres tubulina a los cultivos para una incubación nocturna sobre el agitador de placas a cuatro grados Celsius. Al día siguiente.Después de lavar las células, incubar las muestras en el anticuerpo secundario marcado con fluorocromo anti-IgG de US a temperatura ambiente, protegidas de la luz, con agitación durante una hora. Enjuagar las células nuevamente y teñirlas en 500 microlitros de DPI durante cinco minutos. Finalmente, tras lavar las células por última vez, almacenarlas en PBS tween durante hasta dos semanas a cuatro grados Celsius.Hasta su visualización. En este experimento, se utilizaron células madre embrionarias de ratón con un reportero GFP de SOX1 endógeno para rastrear la diferenciación neural. En el día seis, las células se fijaron y tiñeron para el marcador neuronal beta-tubulina tres.En la densidad óptima, las células se diferenciaron en progenitores neurales y neuronas, mientras que colocarlas a una densidad más alta dio como resultado una disminución en el número de células positivas para SOX one GFP y tubulina beta tres. El volumen del recipiente de cultivo celular también afecta la densidad óptima de siembra. Por ejemplo, las células cultivadas en una placa de 96 pozos requieren una densidad celular aproximadamente 10 veces mayor que esa.Las células sembradas en una placa de cultivo de seis pocillos para alcanzar las densidades óptima y alta de confluencia celular. Durante la diferenciación, las células madre embrionarias cambian gradualmente su morfología. Por ejemplo, en estas imágenes, puede observarse la morfología de las células y colonias desde el día uno hasta el seis después del inicio del proceso a densidad celular óptima.El día cuatro, las células comienzan a convertirse en progenitores neurales, evidenciado por la aparición de una señal fluorescente verde proveniente del reportero SOX1-GFP. Y para el día seis, la mayoría de las células son positivas para SOX1. Aunque se espera la presencia de algunas células no neurales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo iniciar la diferenciación neural de células madre embrionarias de ratón en un cultivo celular en monocapa.

neural-differentiation-mouse-embryonic-stem-cells-serum-free

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Hemos desarrollado un nuevo protocolo para mejorar la eficiencia de la diferenciación in vitro de células madre embrionarias de ratón en neuronas motoras. Las células madre embrionarias diferenciadas adquirida cuenta con las neuronas motoras como lo demuestra la expresión de marcadores neuronales de neuronas y el motor mediante técnicas de inmunohistoquímica.

La diferenciación eficiente de las células madre embrionarias de ratón en neuronas motoras

El video muestra un protocolo que utiliza medios sin suero para generar progenitores neuronales a partir de células madre embrionarias de ratón. La concentración deseada de células madre embrionarias, suspendidas en medios sin suero, se coloca en cubreobjetos recubiertos de gelatina. Con una densidad celular óptima, las células producen factores de señalización autocrinos que, junto con los factores inductores de la diferenciación neuronal en el medio sin suero, desencadenan la diferenciación...

Generación de progenitores neurales a partir de células madre embrionarias en cultivos monocapa sin suero

Este video muestra un método para la generación in vitro de células progenitoras neurales (NPCs) a partir de células madre embrionarias de ratón (mESCs). Las mESCs se cultivan en suspensión para formar cuerpos embrioides (EBs), que luego son guiados para diferenciarse en NPCs mediante tratamiento con ácido retinoico en un cultivo adherente.

Una técnica para generar células progenitoras neurales a partir de células madre embrionarias de ratón

El video mostró un método de cultivo celular para diferenciar células progenitoras neurales en neuronas. Al incubar las células en un medio rico en nutrientes complementado con factores de crecimiento, las células progenitoras maduraron hasta convertirse en neuronas con axones y dendritas desarrollados. Un agente estabilizador garantizaba la viabilidad celular y protegía contra el daño oxidativo durante todo el proceso de diferenciación.

Diferenciación de Células Progenitoras Neurales en Neuronas

Este video muestra una técnica para la diferenciación de células madre embrionarias en una población en red de neuronas con sinapsis funcionales. Describe los pasos involucrados en la diferenciación de células madre embrionarias en neuronas, la inducción de la formación de redes neuronales y el enriquecimiento del cultivo con neuronas en red.

Diferenciación de células madre embrionarias de ratón en una población de neuronas en red

El suero utilizado en los cultivos de embriones contiene componentes desconocidos que pueden afectar el resultado de los experimentos sobre todo en los estudios que involucran interacciones de señalización. Aquí hemos utilizado un sistema de cultivo oxigenada libre de suero y mostramos que los embriones mitad de la gestación de ratón en cultivo de 16-40 horas exhiben desarrollo morfológico comparable a los embriones en desarrollo en el útero.

Embriones de ratón con el desarrollo en todo un sistema de cultivo de embriones sin suero

Se describe una técnica para el uso de células madre embrionarias murinas para generar dos o tres cuerpos embrioides dimensionales. A continuación, explicamos cómo inducir la diferenciación neural de las células del cuerpo embrioides por ácido retinoico, y cómo analizar su estado de diferenciación de células progenitoras por inmunofluorescencia marcador e inmunotransferencia.

Análisis de inducida por ácido retinoico Neural diferenciación de células madre embrionarias de ratón en cuerpos embrioides dos y tres dimensiones

Aquí, presentamos una nueva técnica microquirúrgica para el aislamiento de las células madre neurales de la eminencia gangliónica E13 ratón embrión.

Aislamiento y cultivo de las células madre neurales embrionarias de ratón

Aquí se presenta un protocolo para la generación de un cultivo de una sola célula de células madre embrionarias humanas y su posterior diferenciación en células progenitoras neuronales. El protocolo es simple, robusto, escalable y adecuado para aplicaciones de detección de drogas y medicina regenerativa.

Diferenciación neuronal eficiente utilizando el cultivo monocelular de células madre embrionarias humanas

Aquí, establecimos un método de bajo costo y fácil de operar que dirige la diferenciación rápida y eficiente de las células madre embrionarias a las neuronas. Este método es adecuado para la popularización entre laboratorios y puede ser una herramienta útil para la investigación neurológica.

Diferenciación neuronal de las células madre embrionarias del ratón in vitro

Describimos el procedimiento para la diferenciación in vitro de células madre embrionarias de ratón en células neuronales utilizando el método de la gota colgante. Además, realizamos un análisis fenotípico exhaustivo a través de RT-qPCR, inmunofluorescencia, ARN-seq y citometría de flujo.

Diferenciación y caracterización de progenitores neurales y neuronas a partir de células madre embrionarias de ratón

Aprende a diferenciar células madre embrionarias de ratón en progenitores neuronales mediante cultivo monocapa sin suero. Este protocolo permite generar tipos celulares neuronales maduros y escalar a formato multipocillo para cribado de compuestos.

Diferenciación neural de células madre embrionarias de ratón en el suero libre de monocapa Cultura

Explorar más videos