Diferenciación neural de células madre embrionarias de ratón en el suero libre de monocapa Cultura
14 de mayo de 2015
Este protocolo describe en detalle el método para generar progenitores neurales a partir de células madre embrionarias utilizando un método de monocapa sin suero. Estos progenitores se pueden utilizar para derivar tipos de células neuronales maduras o para estudiar el proceso de especificación neuronal y son susceptibles de escalado en formato multipocillo para el cribado de compuestos.
El objetivo general de este procedimiento es diferenciar células madre embrionarias de ratón hacia una línea neural en un cultivo celular monocapa libre de suero. Esto se logra primero recubriendo el recipiente de cultivo con gelatina. En el segundo paso, las células madre embrionarias se disocian en una suspensión de células individuales en medio de diferenciación y se diluyen a las densidades de siembra adecuadas.
En el paso final, las células se siembran en la placa recubierta con gel ENC. Finalmente, se utiliza microscopía de inmunofluorescencia para confirmar el éxito de la diferenciación mediante la visualización de los marcadores neuronales de interés. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades, ya que sembrar con la densidad adecuada es fundamental para lograr una buena diferenciación.
Y existen varios factores que afectan la densidad de siembra tanto directa como indirectamente. Antes de sembrar las células, caliente un alícuota de gelatina al 1 % en un baño de agua a 37 °C hasta que se disuelva. Luego, mezcle la gelatina con 500 mililitros de PBS tibio y cubra el fondo del recipiente de cultivo celular con la cantidad suficiente de la solución para recubrir la superficie mientras la gelatina realiza el recubrimiento.
Lave dos veces la cultura subconfluente de células madre embrionarias de ratón con PBS. A continuación, añada un mililitro de reactivo de disociación a la cultura. Tras dos a cinco minutos, golpee suavemente el recipiente para desprender la monocapa y obtener una suspensión de células individuales, y recoja la cultura en un volumen total de 10 mililitros de medio y reactivo de disociación celular.
Transfiera las células a un tubo cónico de 50 mililitros y centrifúgelas. Luego, tras la aspiración cuidadosa del sobrenadante, re suspenda el precipitado en 10 mililitros de N2B27 precalentado, pipeteando contra la pared del tubo. Para evitar la formación de burbujas, cuente ahora las células registrando la concentración y vuelva a suspenderlas en el número adecuado de células por unidad de volumen por pocillo en N2B27 precalentado, según la tabla.
Luego aspire la gelatina del recipiente de cultivo y siembre las células sin agitar el recipiente. Coloque los cultivos en un incubador húmedo a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono. Reemplace el medio cada uno o dos días.
Con N fresco B 27, las células comenzarán a diferenciarse y a expresar socks, una expresión dentro de los cuatro a seis días para teñir las células mediante imágenes de inmunofluorescencia. Retire el medio de diferenciación de los cultivos y fije las células en 500 microlitros de paraformaldehído al 4 %; después de 15 minutos, lave y permeabilice las células dos veces con dos mililitros de PBS con tween. A continuación, bloquee cualquier unión no específica mediante una incubación de una hora de las células.
En un mililitro de PBS con tween suplementado con suero sobre un agitador de placas después de lavar las células como se acaba de demostrar. Añadir 500 microlitros de IgG de ratón contra beta tres tubulina a los cultivos para una incubación nocturna sobre el agitador de placas a cuatro grados Celsius. Al día siguiente.
Después de lavar las células, incubar las muestras en el anticuerpo secundario marcado con fluorocromo anti-IgG de US a temperatura ambiente, protegidas de la luz, con agitación durante una hora. Enjuagar las células nuevamente y teñirlas en 500 microlitros de DPI durante cinco minutos. Finalmente, tras lavar las células por última vez, almacenarlas en PBS tween durante hasta dos semanas a cuatro grados Celsius.
Hasta su visualización. En este experimento, se utilizaron células madre embrionarias de ratón con un reportero GFP de SOX1 endógeno para rastrear la diferenciación neural. En el día seis, las células se fijaron y tiñeron para el marcador neuronal beta-tubulina tres.
En la densidad óptima, las células se diferenciaron en progenitores neurales y neuronas, mientras que colocarlas a una densidad más alta dio como resultado una disminución en el número de células positivas para SOX one GFP y tubulina beta tres. El volumen del recipiente de cultivo celular también afecta la densidad óptima de siembra. Por ejemplo, las células cultivadas en una placa de 96 pozos requieren una densidad celular aproximadamente 10 veces mayor que esa.
Las células sembradas en una placa de cultivo de seis pocillos para alcanzar las densidades óptima y alta de confluencia celular. Durante la diferenciación, las células madre embrionarias cambian gradualmente su morfología. Por ejemplo, en estas imágenes, puede observarse la morfología de las células y colonias desde el día uno hasta el seis después del inicio del proceso a densidad celular óptima.
El día cuatro, las células comienzan a convertirse en progenitores neurales, evidenciado por la aparición de una señal fluorescente verde proveniente del reportero SOX1-GFP. Y para el día seis, la mayoría de las células son positivas para SOX1. Aunque se espera la presencia de algunas células no neurales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo iniciar la diferenciación neural de células madre embrionarias de ratón en un cultivo celular en monocapa.
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Descripción general
Este protocolo describe la diferenciación de células madre embrionarias de ratón en progenitores neurales mediante un método de monocapa libre de suero. Este enfoque permite la generación de tipos celulares neuronales maduros y es adecuado para la ampliación en formato de placas multipocillo para cribado de compuestos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Investigación con células madre
Antecedentes
- Las células madre embrionarias pueden diferenciarse en diversos tipos celulares.
- Los progenitores neurales son esenciales para estudiar el desarrollo neural.
- Los métodos de cultivo sin suero pueden mejorar la reproducibilidad.
- La densidad adecuada de siembra es fundamental para una diferenciación exitosa.
Objetivo del estudio
- Establecer un método confiable para generar progenitores neuronales.
- Facilitar el estudio de los procesos de especificación neural.
- Permitir la selección de alto rendimiento de compuestos que afectan la diferenciación neural.
Métodos Utilizados
- Recubrir los recipientes de cultivo con gelatina.
- Crear una suspensión de células individuales de células madre embrionarias.
- Siembra de células en placas recubiertas con gelatina.
- Utilizar microscopía de inmunofluorescencia para confirmar el éxito de la diferenciación.
Resultados principales
- Diferenciación exitosa de células madre embrionarias en progenitores neurales.
- La visualización de marcadores neurales confirma la diferenciación.
- Establecimiento de densidades óptimas de siembra para una diferenciación eficaz.
- El método es escalable para aplicaciones de cribado de compuestos.
Conclusiones
- El método de monocapa sin suero es eficaz para la generación de progenitores neuronales.
- La inmunofluorescencia es una técnica confiable para evaluar la diferenciación.
- Este protocolo puede adaptarse para diversas aplicaciones de investigación en neurociencia.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite la generación escalable de progenitores neuronales a partir de células madre embrionarias de ratón en un sistema definido, en monocapa y libre de suero, lo que apoya la validación temprana de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas en el descubrimiento de fármacos para neurociencia. El método proporciona una plataforma reproducible y cuantitativa para evaluar los efectos de compuestos sobre la diferenciación neuronal, facilitando la identificación de compuestos prometedores y una mayor confianza predictiva en las etapas preclínicas. Su compatibilidad con líneas reporteras y formatos de cultivo de alta densidad permite su integración en flujos de trabajo de cribado para estudios de modulación de vías y de interacción con la diana.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la investigación de los mecanismos de especificación neural y la validación funcional de dianas del desarrollo neurológico mediante diferenciación dirigida.
- Valor operativo: Proporciona un sistema definido y libre de suero que reduce la variabilidad y mejora la reproducibilidad entre experimentos y líneas celulares.
- Valor predictivo: Facilita la evaluación de los cambios inducidos por compuestos en el rendimiento de progenitores neurales y en la expresión de marcadores, aportando información sobre la interacción con la diana y la modulación de vías.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera una población homogénea de progenitores neurales adecuada para la selección de compuestos y la evaluación fenotípica de la diferenciación neural.
- Valor operativo: Adaptable a formatos de múltiples pocillos (por ejemplo, placas de 96 pocillos) con optimización escalable de la densidad de siembra, lo que permite aplicaciones de throughput medio a alto.
- Preparación para ensayos: Compatible con inmunofluorescencia, citometría de flujo y lecturas moleculares para el análisis multiparamétrico de la eficiencia de diferenciación y la expresión de marcadores.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Translacional: Permite la progresión desde la generación de progenitores neurales hasta la maduración funcional de neuronas y glía, apoyando la modelización relevante para enfermedades.
- Reducción Mecanicista de Riesgos: Facilita el estudio del compromiso de linaje y la dinámica de diferenciación mediante líneas reporteras (por ejemplo, SOX1-GFP) para monitorear la especificación neural en tiempo real.
- Utilidad Preclínica: Permite evaluar los efectos de compuestos sobre la maduración neural y la diferenciación glial, apoyando estudios de farmacología de seguridad y de mecanismo de acción.
Integración de la Secuencia de Trabajo y Flujo de Trabajo
El método se integra en la fase inicial del descubrimiento, apoyando la validación del blanco mediante la interrogación mecanicista de la diferenciación neural y permitiendo el desarrollo de ensayos para la selección de compuestos en carteras de neurociencia.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis sobre vías del neurodesarrollo y la validación de dianas mediante diferenciación dirigida y lecturas basadas en marcadores.
- Selección: Permite la estandarización y reproducibilidad de ensayos en cultivo en monocapa, siendo la densidad de siembra un parámetro crítico para la generación consistente de progenitores neurales.
- Análisis: Proporciona resultados cuantitativos mediante inmunofluorescencia (por ejemplo, SOX1-GFP, βIII-tubulina) y citometría de flujo para medir la eficiencia de diferenciación y la respuesta a compuestos.
- Investigación Traducional: Conecta la generación temprana de progenitores neurales con la maduración posterior hacia neuronas y glía funcionales, favoreciendo la continuidad preclínica.
- Reutilización Empresarial: Un protocolo definido y escalable facilita la reutilización en múltiples líneas de células madre embrionarias, recipientes de cultivo y campañas de selección, reduciendo los esfuerzos de rediseño.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista en las vías de diferenciación neural.
- Valor operativo: Condiciones estandarizadas y libres de suero mejoran la reproducibilidad y escalabilidad entre laboratorios y líneas celulares.
- Valor estratégico: Informa las decisiones de avance o interrupción al permitir la evaluación temprana de los efectos del compuesto sobre el compromiso de la linaje neural y la eficiencia de diferenciación.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de objetivos en neurociencia mediante la reducción de riesgos mecanicistas y la validación de vías.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo de células madre, técnicas de diferenciación y microscopía de inmunofluorescencia.
- Depende del acceso a incubadoras de CO2, centrífugas, microscopios y reactivos como gelatina, N2B27, reactivos de disociación y anticuerpos.
- Necesita la estandarización de la densidad de siembra y de los procedimientos de recubrimiento con gelatina entre usuarios y sitios para garantizar la reproducibilidad.
- La adaptación a diferentes líneas de células madre embrionarias o a constructos reporteros puede requerir la optimización de la densidad de siembra y del momento de diferenciación.
- Las limitaciones prácticas incluyen la sensibilidad a la densidad de siembra y la necesidad de una disociación cuidadosa del monocapa para evitar la formación de agregados o suspensiones celulares incompletas a nivel de célula individual.
