Name: Un Aquatic Microbial metaproteomics Flujo de trabajo: a partir de células a tríptico péptidos adecuados para el análisis basado en la espectrometría de masas en tándem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Aprenda a extraer proteínas y ADN de biomasa microbiana marina mediante lisado, concentración y digestión con tripsina. Este flujo de trabajo genera péptidos aptos para análisis por espectrometría de masas en tándem.

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Los autores desean agradecer a Marcos Di Falco por su experiencia y asesoramiento en la preparación de las muestras para nano-LC MS/MS, así como al Dr. Zoran Minic de la Universidad de Regina para el análisis LC MS/MS. Este trabajo contó con el apoyo financiero de NSERC (DG402214-2011) y CRC (950-221184). D.C. contó con el apoyo del Instituto Concordia para el Agua, la Energía y los Sistemas Sostenibles y FQRNT.

1. Prepare Reactivos <ol><li> Preparar la solución de SDS-extracción: M Tris-HCl pH 0,1 7,5, 5% de glicerol, EDTA 10 mM y 1% de SDS. Filtro-esterilizar utilizando un filtro y tienda de 0,22 micras a 4 ° C. </li><li> Preparar reactivos de valores necesarios para el gel de poliacrilamida. <ol><li> Preparar 1,5 M Tris-HCl pH 8,8. Filter-esterilizar utilizando un filtro de 0,22 micras y almacenar a temperatura ambiente. </li><li> 0,5 M Tris-HCl pH 6,8. Filter-esterilizar utilizando un filtro de 0,22 micras y almacenar a temperatura ambiente. </li><li> Preparar 10% de SDS. Filtrar esterilizar utilizando un filtro de 0,22 micras y almacenar a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Preparar soluciones necesarias en gel tripsina digerir y extracción de péptidos. <ol><li> Preparar bicarbonato de amonio 100 mM. Filtro-esterilizar utilizando un filtro y tienda de 0,22 micras a 4 ° C. </li><li> Preparar 1 stocks M de TDT. Suspendido en bicarbonato de amonio 100 mM y se almacena a -80 ° C. </li><li> Preparar 550 mM acciones yodoacetamida. Suspendido en100 mM de bicarbonato de amonio y almacenar a -80 ° C. </li><li> Preparar 100 ng / l existencias tripsina. Alícuota de 60 l en tubos de 1,5 ml de microcentrífuga y se almacena a -80 ° C. </li><li> Preparar la solución de extracción: ácido fórmico 1%, 2% de acetonitrilo. </li><li> Preparar la solución de resuspensión: 5% de acetonitrilo y ácido fórmico al 0,1%. </li></ol></li></ol> 2. Realice lisis celular en la Unidad de filtro de cartucho con células conservadas en el ARN solución Estabilización <ol><li> Expulsar la solución de estabilización de ARN a partir de la unidad de filtro de cartucho (1,5 ml) y en un tubo de microcentrífuga de 2 ml utilizando una jeringa de 60 ml se adjunta al final de cierre luer del filtro. </li><li> Centrifugar el tubo de microcentrífuga de 2 ml durante 10 minutos a 17.000 xg para sedimentar los residuos celulares. Esto se hace para que el filtro en el paso 2.3 no obstruye. </li><li> Transferir el sobrenadante a una unidad de filtro de ultracentrifugación 10 K para capturar cualquier proteínas procedentes de células que han lisadas de la congelación / thaw de la muestra. No deseche el pellet. Será utilizado en el paso 2.5. Realizar la centrifugación de la unidad de filtro de ultracentrifugación a 3.270 xg durante 30 min o hasta que el volumen se ha reducido a alrededor de 600 l. </li><li> Derretir la punta de una punta de p10 y bloquear el lado no Luer de la unidad de filtro de cartucho con el extremo abierto de la punta. Esto asegurará que ningún tampón de extracción y la biomasa se escapa durante los pasos 2.5-2.7. </li><li> Suspender el sedimento en 1 ml de solución de SDS-extracción y la pipeta en la unidad de filtro de cartucho original. La forma más fácil de pipeta en la unidad de filtro de cartucho es apilar una punta p200 en una punta p1000 y utilizar este doble punta para pipetear. </li><li> Añadir 1 ml de solución de extracción SDS a la unidad de filtro de cartucho de modo que el volumen total es de aproximadamente 2 ml y se incuba durante 10 min a temperatura ambiente rotando en un horno de hibridación. Coloque 3 laboratorio arrugado toallitas en el fondo de un tubo cónico de 50 ml. Parafilm ambos extremos de la unidad de filtro de cartucho cerradasy poner la unidad de filtro de cartucho en el tubo de 50 ml. Cierre la tapa y colocar el tubo en el horno de hibridación. </li><li> Después de 10 min lugar filtrar la Sterivex en un flotador de espuma y seguro en su lugar con una jeringa de 5 ml en el extremo Luer. Flotador y se incuba en un baño de agua 95 ° C durante 15 minutos. </li><li> Deje que la unidad de filtro de cartucho fresco y rotar a temperatura ambiente durante 1 hora (como en el paso 2.6). </li><li> Expulsar el lisado solución de extracción / célula SDS fuera del filtro con una jeringa de 60 ml en la misma unidad de filtro de ultracentrifugación como antes (paso 2.3). Añadir 1 ml de solución fresca de extracción de SDS a la unidad de filtro de cartucho y se mezcla durante 30 seg a mano y luego expulsar en la unidad de filtro de ultracentrifugación utilizando la jeringa 60 ml. Esto es para enjuagar la unidad de filtro de cartucho para asegurar que todas las proteínas se han eliminado. </li><li> Realizar centrifugación en la unidad de filtro de ultracentrifugación durante 45 minutos a 3270 xg o hasta que el volumen en la unidad de filtro es menor que 600 l. </li><li> Deseche el filtrado y la parte superior de la unidad de filtro ultracentrífugo con solución de SDS-extracción fresco. </li><li> Centrifugar la unidad de filtro durante otros 45 min a 3270 x g. </li><li> Repita los pasos 2.11 y 2.12 veces más. Asegúrese de que el volumen final en la unidad de filtro de ultracentrifugación es como máximo de 600 l en el final de la vuelta final. </li><li> En este punto, se dividió el concentrado en dos. Una fracción será utilizado para la precipitación del ADN y el otro para la precipitación de proteínas. Nota: La cantidad de fraccionamiento depende de la cantidad de biomasa que se filtró y los usos previstos de los productos. En nuestro caso, nos dividimos el concentrado con 10% hacia la precipitación de ADN y el 90% hacia la precipitación de proteínas. </li></ol> Precipitación 3. Proteína <ol><li> Añadir 4 volúmenes de metanol: acetona (50:50) a un volumen de concentrado y agitar durante 10 seg. Incubar toda la noche a -20 ° C. </li><li> Centrifugar a 17000 xg durante 30 min. Decantar el sobrenadantey dejar que el pellet (puede ser invisible) seco en un SpeedVac durante 1 hora (o hasta que se seque). Nota: No más de secar el sedimento ya que esto puede hacer que sea difícil para volver a suspender. </li><li> Suspender el precipitado en 25 l de solución de SDS-extracción. Deje reposar durante una hora y luego volver a suspender pipeteando arriba y abajo. </li><li> Cuantificar la proteína usando un kit de ensayo de proteínas y las instrucciones del fabricante. </li></ol> 4. ADN Precipitación <ol><li> Añadir solución de SDS-extracción a la fracción de concentrado para ser utilizado para la precipitación del ADN hasta que la marca 500 l. Este paso es simplemente para aumentar el volumen de la solución, por lo que es más fácil trabajar con. </li><li> Añadir 0.583 volúmenes de un reactivo de precipitación de proteínas (tales como la proteína MPC reactivo de precipitación) y agitar durante 10 seg. Usted debe ver una forma precipitado blanco. Nota: También hemos utilizado fenol: cloroformo métodos de extracción de ADN, pero es más difícil debido a los bajos volúmenes. Se obtuvieron mejores rendimientos de ADN utilizando elMPC Protein Precipitación Reactivo. </li><li> Centrifugar a 17.000 xg y 4 ° C durante 10 min. </li><li> Transferir el sobrenadante a otro tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y añadir 0,95 volúmenes de isopropanol. Invertir 30-40 veces. </li><li> Centrifugar durante 10 min a 4 ° C a la velocidad máxima. </li><li> Decantar con cuidado y desechar el sobrenadante. </li><li> Enjuague dos veces con 750 l de etanol al 70%. </li><li> Retire la mayor cantidad de etanol como sea posible con la pipeta, luego dejar secar al aire. Nota: No más de secar el ADN ya que esto puede hacer que sea difícil para volver a suspender. </li><li> Resuspender en 25 l de tampón TE bajo, pH 8 (10 mM Tris-HCl, EDTA 0,1 mM). </li><li> Cuantificar el ADN utilizando un kit de ensayo de ADN de doble cadena y las instrucciones del fabricante. Realizar gel de agarosa (1%) electroforesis en 3 l de la ADN para comprobar su calidad. </li></ol> 5. SDS-PAGE gel de proteínas <ol><li> Preparar tampón de muestra (950 l de tampón de muestra Laemmli y 50 l β-mercaptoetanol). &lt;/ li&gt; <li> Añadir el volumen correspondiente de 15 g de proteína, o un máximo de 20 l a un volumen igual de tampón de muestra y hervir durante 4 min. Las muestras se pueden almacenar a -80 ° C hasta el SDS-PAGE se puede realizar. </li><li> Preparar 10% de acrilamida gel de resolución con un gel de apilamiento de acrilamida al 5%. </li><li> Cargar el gel con muestras y 4 l de una escalera de proteínas. Correr el gel a 120 V constante hasta que el 250 kDa marcador escalera solo ha alcanzado el gel de resolución. </li><li> Tinción del gel usando una tinción de Coomassie basado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li></ol> 6. En-gel tripsina Digest y Péptido Extracción Nota: Todos los pasos de aquí hasta 6,10 se realizan en una cabina de seguridad biológica para minimizar la contaminación. <ol><li> Corte el exceso de gel bajo la marca de 10 kDa escalera para cada carril. Cada carril se analizará en el MS / MS por separado. Cortar cada carril en 1 mm x 1 mm cuadrados para aumentar la superficie y colocar todos squares de la vía en un tubo de baja unión a micro-centrífuga. Repita esto para todos los carriles. (Ácido acético al 1% se puede utilizar para evitar que el gel se seque y convertirse en difícil de cortar). Nota: Reducir al mínimo la contaminación es crítica en esta etapa, por lo que el corte en lonchas gel se realiza en una cabina de seguridad biológica en el molde de gel SDS-PAGE de vidrio usado para hacer el gel. </li><li> De-mancha <ol><li> Dispensar 50 l de bicarbonato de amonio 100 mM en cada tubo de baja vinculante, cerca de la tapa y se incuba a 37 ° C durante 10 minutos. </li><li> Dispensar 50 l de acetonitrilo, cerca de la tapa y se incuba a 37 ° C durante 5 min. </li><li> Aspirar y desechar de 150 l. </li><li> Repita los pasos 6.2.1 y 6.2.2. </li><li> Aspirar y desechar 95 l. </li></ol></li><li> Deshidratación <ol><li> Dispensar 50 l de acetonitrilo, cerca de la tapa y espere 5 minutos. Aspirar y desechar 45 l y esperar 10 min. </li></ol></li><li> Reducción <ol><li> Dispensar 50 l de DTT (10 mM, diluido en amm 100 mMbicarbonato de onio), cerca de la tapa y espere 30 minutos a 37 ° C. </li></ol></li><li> Alquilación <ol><li> Dispensar 50 l yodoacetamida (55 mM, diluido en bicarbonato de amonio 100 mM), cerca de la tapa y espere 20 minutos a 37 ° C. </li><li> Prescindir de 100 l de acetonitrilo, cerca de la tapa y se incuba durante 5 minutos a 37 ° C. Aspirar y desechar de 195 l. </li></ol></li><li> lavar <ol><li> Prescindir de bicarbonato de amonio 50 l, cerca de la tapa y se incuba durante 10 minutos a 37 ° C. </li><li> Dispensar 50 l de acetonitrilo, cerca de la tapa y se incuba a 37 ° C durante 5 min. Aspirar y desechar de 120 l. </li></ol></li><li> Deshidratación <ol><li> Dispensar 50 l de acetonitrilo, cerca de la tapa y espere 5 minutos. Aspirar y desechar 45 l. </li><li> Dispensar 50 l de acetonitrilo, espere 5 min. </li><li> Aspirar y desechar 75 l y espere 5 minutos. </li></ol></li><li> Digestión <ol><li> Prescindir de 25 a 30 l de 6 ng / l tripsina (uasta todos los fragmentos de gel están cubiertos). Cerrar la tapa y espere 30 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Incubar durante la noche (mínimo 4,5 horas) a 37 ° C. </li><li> Deje reposar a temperatura ambiente durante 30 min. </li></ol></li><li> Extracción y Péptido Transferencia <ol><li> Dispensar 30 l de solución de extracción y cubrir con tapa durante 30 min en hielo. </li><li> Aspirar 30 l y dispensar el volumen aspirado en un nuevo tubo de baja unión marcado. </li><li> Dispensar 12 l de solución de extracción y 12 l de acetonitrilo en el tubo original (con gel). Cerrar la tapa y se incuba durante 30 minutos en hielo. </li><li> Aspirar 15 l y depositará en el nuevo tubo. </li><li> Repita los pasos (6.9.3 y 6.9.4). </li></ol></li><li> Coloque nuevos tubos en un SpeedVac hasta que se seque. </li><li> Resuspender en 50 l de solución de resuspensión. Vortex en medio durante 10 min para volver a suspender. </li><li> Solución de péptido Pipetear en cualquiera de nano / viales LC o placas de 96 pocillos adecuados para nano / LCTrabajo MS / MS. </li></ol>

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<li>Shevchenko, A., Tomas, J. H., Olsen, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature protocols. 1 (6), 2856-2860 (2007).</li>
<li>Thomas, T., Gilbert, J., Meyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomics+-+a+guide+from+sampling+to+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Informatics+and+Experimentation%22%5BJournal%5D)">Metagenomics - a guide from sampling to data analysis.</a> Microbial Informatics and Experimentation. 2 (1), 3(2012).</li>
<li>Huson, D. H., Auch, A. F., Qi, J., Schuster, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEGAN+analysis+of+metagenomic+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">MEGAN analysis of metagenomic data.</a> Genome research. 17 (3), 377-3786 (2007).</li>
<li>Huson, D. H., Mitra, S., Ruscheweyh, H. -J., Weber, N., Schuster, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+environmental+sequences+using+MEGAN4%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of environmental sequences using MEGAN4.</a> Genome research. 21 (9), 1552-1560 (2011).</li>
<li>Ea Ottesen,, Marin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metatranscriptomic+analysis+of+autonomously+collected+and+preserved+marine+bacterioplankton%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+journal%22%5BJournal%5D)">Metatranscriptomic analysis of autonomously collected and preserved marine bacterioplankton.</a> The ISME journal. 5 (12), 1881-1895 (2011).</li>
<li>Feike, J., Jürgens, K., Hollibaugh, J. T., Krüger, S., Jost, G., Labrenz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+unbiased+metatranscriptomics+in+suboxic+waters+of+the+central+Baltic+Sea+using+a+new+in+situ+fixation+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+journal%22%5BJournal%5D)">Measuring unbiased metatranscriptomics in suboxic waters of the central Baltic Sea using a new in situ fixation system.</a> The ISME journal. 6 (2), 461-470 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La preservación de la muestra es clave para estudios metaproteomic y el trabajo previo demostró que una solución de estabilización de ARN es un tampón de almacenamiento útil para almacenar las células antes de la extracción de proteínas 28. Idealmente, las muestras se conservan in situ para negar los cambios en la expresión de la proteína durante la manipulación 33,34. De hecho, in situ se han desarrollado tecnologías de muestreo y fijación, que permiten la colección autónomo y co...

Los microorganismos son ubicuos y juegan un papel esencial en los ciclos biogeoquímicos de la Tierra 1. Actualmente, existen numerosos enfoques moleculares disponibles para la caracterización de estructura de la comunidad microbiana y función. El más común es el análisis de secuencias de genes de ARNr 16S amplificó por PCR a partir de ADN ambiental 2 - 4 de. Una desventaja de análisis de genes 16S rRNA es que sólo proporciona información sobre la identidad filogenética y estructura de la comunidad, con poca información sobre la función metabólica. En contraste, los enfoques tales como la metagenómica, metatranscriptomics y metaproteomics proporcionan información sobre la estructura de la comunidad y el metabolismo. La metagenómica, o el análisis del contenido de genes de un conjunto de organismos, incluye información sobre la estructura y el potencial funcional de la comunidad 5-8. Aunque potente, este potencial funcional no puede corresponder a la metabólicalas actividades de los organismos. El genotipo de un organismo está representada por sus genes, cada uno de los cuales puede ser transcrito a ARN y traducido además a la proteína, dando como resultado un fenotipo. Por lo tanto, para ayudar en la comprensión de la actividad funcional microbiana en un ambiente, el análisis post-genómica se debe realizar 9. Metatranscriptomics, o el análisis de las transcripciones de ARN es útil porque revela que los genes se transcriben en cualquier ambiente dado. Sin embargo, los niveles de mRNA no siempre coinciden con sus correspondientes niveles de proteína debido a la regulación de la traducción, la vida media del ARN, y el hecho de que varias copias de la proteína se pueden generar para cada mRNA 10. Por estas razones metaproteomics ahora se reconoce como una herramienta importante para la microbiología ambiental. Metaproteomic Común analiza utilizar un enfoque proteómico escopeta donde el complemento completo cerca de las proteínas en una muestra compleja se purifican y analizan simultáneamente, por lo general a través de endigestión zymatic en péptidos y análisis sobre un espectrómetro de masas. Con posterioridad espectrometría de masas en tándem (MS / MS) &quot;huellas dactilares péptido&quot; se utiliza para determinar la secuencia del péptido y el potencial de proteínas de origen por la búsqueda de datos de proteínas (para una revisión ver 11). Trabajo proteómico ha recorrido un largo camino en los últimos 25 años gracias al aumento de la disponibilidad de datos genómica y el aumento de la sensibilidad y la precisión de los espectrómetros de masas que permitan la identificación de proteínas de alto rendimiento y cuantificación 11,12. Dado que las proteínas son el producto final de la expresión génica, los datos metaproteomic pueden ayudar a determinar qué organismos están activos en un entorno determinado y qué proteínas están expresando. Esto es una ventaja cuando se trata de determinar cómo un conjunto particular de variables ambientales afectará el fenotipo de un organismo o comunidad. Desde el principio, se utilizaron estudios metaproteomic basados ​​en MS MS / en el océano para identificar proteínas específicas dirigidaslinajes microbianos, con el primer estudio se centra en la luz impulsado protones bomba proteorhodopsin en bacterias marinas SAR11 13. Más recientemente, los análisis comparativos metaproteomic han dilucidado los patrones de expresión de proteínas diferenciales entre comunidades complejas. Los ejemplos incluyen la identificación de los cambios temporales en el metabolismo de la costa noroeste del Océano Atlántico 14 o la Península Antártica 5. Otros estudios han descrito variaciones en los patrones de expresión de proteínas a través de escalas espaciales, por ejemplo, a lo largo de un transecto geográfico de un giro oceánico bajo de nutrientes a un sistema de surgencia costera altamente productiva 15. Para más críticas del metaproteomics recomendamos Schneider et al. (2010) 9 y Williams et al. (2014) 16. Proteómica dirigidos también se ha empleado en los últimos años para cuantificar la expresión de las vías metabólicas específicas en el entorno 17,18. El Re son tres fases principales en el análisis metaproteomic. La primera fase es la preparación de muestras, que incluye la recogida de muestras, la lisis celular y la concentración de proteína. La recogida de muestras en microbiología marina a menudo implica la filtración de agua de mar a través de un pre-filtro para eliminar las células más grandes eucariotas, partículas y bacterias de partículas asociadas, seguido de filtración para la captura de células microbianas de estar libres, comúnmente con el uso de un cartucho de 0,22 micras unidad de filtro de 19,20. Estos filtros son incased en un cilindro de plástico y una lisis celular y el protocolo de extracción de proteínas que se pueden realizar dentro de la unidad de filtro sería una herramienta valiosa. Una vez que se obtiene la biomasa, las células deben ser lisadas para permitir la extracción de proteínas. Varios métodos pueden ser empleados, incluyendo guanidina-HCl sulfato de lisis 21 y sodio dodecil (SDS) basados ​​en métodos de lisis. Aunque los detergentes como SDS son muy eficientes en la interrupción de las membranas y solubilizar muchos tipos de proteínas, concentrations precio tan bajo como 0.1% puede interferir con la digestión de proteínas aguas abajo y el análisis MS 22. De mayor preocupación es los efectos negativos de la SDS en la eficiencia digestión con tripsina, poder de resolución de la cromatografía líquida en fase inversa y la supresión de iones o la acumulación dentro de la fuente de iones 23. La segunda fase es de fraccionamiento y análisis, donde las proteínas son sometidas a digestión enzimática seguida por análisis LC MS / MS, dando como resultado patrón de fragmentación am / z que se puede utilizar para determinar la secuencia primaria de aminoácidos del péptido tríptico inicial. Varios métodos de digestión se pueden realizar dependiendo de los tipos de detergentes utilizados, así como el flujo de trabajo aguas abajo espectrometría de masas. En nuestro protocolo, electroforesis PAGE 1-D seguido de la eliminación de SDS a partir del gel se utiliza con el fin de eliminar cualquier contaminación de detergente. El análisis de las proteínas que son difíciles de solubilizar, tales como proteínas de la membrana, requiere el uso de alta concentraciones de SDS u otros detergentes. Esto conduce a problemas de compatibilidad con electroforesis en SDS-gel. Si el objetivo de un estudio requiere la solubilización de estos duros para solubilizar las proteínas, el sistema de tubo de gel se puede utilizar 22,24. El método del tubo-gel incorpora proteínas dentro de la matriz de gel sin el uso de electroforesis. Posteriormente los detergentes utilizados para la solubilización se retiran antes de la digestión de proteínas. La tercera fase es la análisis bioinformático. En esta fase los datos de péptidos MS / MS se busca en una base de datos de secuencias de nucleótidos traducidas para determinar que están presentes en la muestra de péptidos y proteínas. La identificación de péptidos depende de la base de datos es buscado en contra. Datos metaproteomic Marinos son comúnmente búsquedas en contra de las bases de datos compuestas de genomas de referencia, datos de metagenómica como el conjunto de datos Global Océano Muestreo 25, así como los genomas celulares amplificadas individuales de li sin cultivarneages 26,27. Identificación de proteínas también se puede aumentar mediante la inclusión de secuencias metagenomic de la misma muestra como los datos metaproteomic se derivó 5. Aquí nos proporcionan un protocolo para la generación de péptidos adecuados para el análisis basado en MS MS / a partir de biomasa microbiana recogió por filtración y almacenados en una solución de estabilización de ARN. El protocolo descrito aquí permite ADN y proteínas para aislar a partir de la misma muestra para que todos los pasos que conducen a la proteína y las precipitaciones de ADN son idénticos. Desde una perspectiva práctica, se requiere menos de filtración ya que sólo se requiere un filtro para proteínas y extracción de ADN. También nos gustaría reconocer que este protocolo fue creado a través de la combinación, la adaptación y modificación de los dos protocolos previamente publicados. Los pasos de lisis celular son una adaptación de Saito et al. (2011) 28 y la tripsina en gel digerir componente se adapta de ShevcheNKO et al. (2007) 29.

<table><tbody><tr><td>Sterivex -GP 0.22 &mu; m unidad de filtro</td><td>Millipore</td><td>SVGP01050</td><td>Muestreo</td></tr><tr><td>RNAlater Solución de estabilización</td><td>Ambion</td><td>AM7021</td><td>Muestreo</td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Bio Basic</td><td>77-86-1 o TB0196-500G</td><td>Extracción de proteínas/ SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632-1G</td><td>Extracción de proteínas</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bio Basic</td><td>15-21-3</td><td>Extracción de proteínas/ SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio Basic</td><td>6381-92-6</td><td>Extracción de proteínas</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>56-81-5</td><td>Extracción</td></tr> <tr><td>de proteínas10K Filtro Amicon</td><td>Millipore</td><td>UFC801024</td><td>Extracción de proteínas</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179337-4L</td><td>Precipitación de proteínas</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-64-1</td><td>Precipitación de proteínas</td></tr><tr><td>MPC Reactivo de precipitación de proteínas</td><td>Epicentro</td><td>mmP03750</td><td>Precipitación</td></tr><tr><td>de ADN 2-Propanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-63-0</td><td>Precipitación de ADN</td></tr><tr><td>Kit de ensayo Qubit dsDNA BR</td><td>Life Technologies</td><td>Q32850</td><td>Cuantificación de ADN</td></tr><tr><td>Kit de ensayo de proteínas Qubit</td><td>Life Technologies</td><td>Q33211</td><td>Cuantificación de proteínas</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Bio Basic</td><td>57-50-1</td><td>GEL SDS</td></tr> PAGE <tr><td>TEMED</td><td>Bio Rad</td><td>161-0800</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>APS</td><td>Bio Rad</td><td>161-0700</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>30% Acrilamida</td><td>Bio Rad</td><td>161-0158</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bio Rad</td><td>161-0718</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>B-mercaptoetanol</td><td>Bio Basic</td><td>60-24-2</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>Laemmli Sample Buffer</td><td>Bio Rad</td><td>161-0737</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Escalera Caleidoscopio</td><td>Bio Rad</td><td>161-0375EDU</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>VWR</td><td>CABDH6044-4</td><td>In-gel Tripsina digest</td></tr><tr><td>NH4HCO3</td><td>Bio Basic</td><td>1066-33-7</td><td>In-gel Digestión de tripsina</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632-1G</td><td>In-gel Digestión de tripsina</td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0507-500ML</td><td>In-gel Digestión</td></tr> <tr>de tripsina<td>Grado HPLC H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270733-4L</td><td>Digestión de tripsina en gel</td></tr><tr><td>Yodoacetamida</td><td>Bio Basic</td><td>144-48-9</td><td>Digestión en gel de tripsina Tripsina</td></tr><tr><td></td><td>Promega</td><td>V5111</td><td>En gel Digestión de tripsina</td></tr><tr><td>Protein LoBind Tubo 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td>en gel Digestión de tripsina</td></tr><tr><td>2 ml Vial ROBO 9 mm</td><td>Candian Life Science</td><td>VT009/C395SB</td><td>Digestión de tripsina en gel</td></tr><tr><td>Inserto PP BM, sin muelle</td><td>Candian Life Science</td><td>4025P-631</td><td>Digestión de tripsina en gel</td></tr></tbody></table>

un aquatic microbial metaproteomics flujo de trabajo: a partir de células a tríptico péptidos adecuados para el análisis basado en la espectrometría de masas en tándem

An Aquatic Microbial Metaproteomics Workflow: From Cells to Tryptic Peptides Suitable for Tandem Mass Spectrometry-based Analysis

Las tecnologías metaómicas como la metagenómica, la metatranscriptómica y la metaproteómica pueden ayudar en la comprensión de la estructura y el metabolismo de la comunidad microbiana. Aunque poderosa, la metagenómica por sí sola solo puede dilucidar el potencial funcional. Por otro lado, la metaproteómica permite describir el metabolismo y la función de una comunidad expresados in situ. Aquí describimos un protocolo para la lisis celular, el aislamiento de proteínas y ADN, así como la digestión y extracción de péptidos de células microbianas marinas recolectadas en una unidad de filtro de cartucho (como la unidad de filtro Sterivetx) y conservadas en una solución de estabilización de ARN (como RNAlater). En los estudios proteómicos basados en espectrometría de masas, la identificación de péptidos y proteínas se realiza comparando espectros de masas en tándem de péptidos con una base de datos de secuencias de nucleótidos traducidas. Incluir el metagenoma de una muestra en la base de datos de búsqueda aumenta el número de péptidos y proteínas que se pueden identificar a partir de los espectros de masas. Por lo tanto, en este protocolo se aísla el ADN del mismo filtro, que se puede utilizar posteriormente para el análisis metagenómico.

Como demostración, se realizó el protocolo en dos muestras de agua de mar recogidas de la superficie y el máximo de clorofila del océano costero en el norte de Canadá. Mientras que en el mar, 6-7 de L de agua de mar se pasó a través de un GF / D prefiltro 3 micras, a continuación, se recogieron las células microbianas en una unidad de filtro de cartucho de 0,22 micras siguiendo el protocolo de Walsh et al. 20. Las células se almacenan inmediatamente en una solución de estabilización de ARN hasta su p...

Este protocolo es para la extracción y concentración de proteínas y ADN de la biomasa microbiana recogida del agua de mar, seguida de la generación de péptidos trípticos adecuados para el análisis proteómico basado en espectrometría de masas en tándem.

Un Aquatic Microbial metaproteomics Flujo de trabajo: a partir de células a tríptico péptidos adecuados para el análisis basado en la espectrometría de masas en tándem

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and ...

El objetivo de este procedimiento es la extracción de proteínas y ADN a partir de la biomasa microbiana de agua de mar, seguida de la generación de péptidos trípticos para el análisis proteómico basado en espectrometría de masas en tándem. Esto se logra primero lisando células previamente acumuladas en un filtro de cartucho. El segundo paso consiste en concentrar el lisado celular utilizando unidades de filtro ultracentrífugas.A continuación, el lisado se separa en dos fracciones, una para la precipitación de proteínas y otra para la precipitación de ADN. El paso final consiste en realizar la digestión en gel con tripsina de las proteínas y extraer péptidos adecuados para el análisis mediante cromatografía líquida y espectrometría de masas en tándem. En última instancia, mediante un análisis bioinformático posterior se pueden identificar las proteínas expresadas en la muestra, mientras que el ADN aislado puede utilizarse para análisis metagenómicos y/o del gen 16 S-R-R-N-A.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que tanto la proteína como el ADN pueden aislarse simultáneamente de la misma muestra. Para comenzar, expulse la solución de estabilización

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Los compuestos de captura se trifuncional pequeñas moléculas para reducir la complejidad del proteoma de funcionamiento reversible de moléculas pequeñas, la interacción de proteínas seguido por foto-reticulación y la purificación. Aquí se utiliza un compuesto de captura...

Perfiles de metiltransferasas y Otros S-Adenosil- L-Homocisteína proteínas que se unen mediante espectrometría de masas de captura compuesto (MCP)

Aquí se describe un método robusto para el fraccionamiento de las membranas de plasma de plantas en las membranas solubles resistentes y detergentes detergente a base de una mezcla de no marcado e in vivo completamente 15 N cultivos de células de Arabidopsis thaliana etiquetados. El procedimiento se aplica para los estudios proteómicos comparativos para entender los procesos de señalización.

Metabólicas etiquetado y de membrana de fraccionamiento para Comparativo Proteómica Análisis de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Culturas suspensión celular

Se presenta un protocolo rápido para la digestión proteolítica con un microrreactor tríptico de flujo continuo construido internamente acoplado a un espectrómetro de masas de ionización por electrospray (ESI). Se describe la fabricación del microrreactor, la configuración experimental y el proceso de adquisición de datos.

Tratamiento enzimático rápido de proteínas para la detección MS con un microrreactor de flujo continuo

Aquí presentamos protocolos para la purificación por afinidad de los complejos de proteínas y su separación por PAGE nativa azul, seguido por la proteína de perfiles de correlación utilizando etiqueta espectrometría de masa libre cuantitativo. Este método es útil para resolver interactomes en complejos de proteínas distintas.

Resolver purificado por afinidad Complejos de Proteína de Blue nativo PAGE y de proteínas de perfiles de correlación

Presentamos un protocolo para cuantificar con precisión las proteínas con etiquetado isobárico, fraccionamiento extensa, herramientas bioinformáticas y pasos de control de calidad en combinación con interfaz a un espectrómetro de masas de alta resolución de la cromatografía líquida.

Proteoma profundo perfiles de etiquetado isobárico, extenso de la cromatografía líquida, espectrometría de masas y asistida por el Software de cuantificación

Este protocolo describe un rendimiento único para técnicas complementarias analíticas y ómicas que culmina en una caracterización totalmente emparejado de materia orgánica natural y proteómica microbiana en diferentes ecosistemas. Este enfoque permite comparaciones robustas para la identificación de rutas metabólicas y transformaciones importantes para describir la producción de gas de efecto invernadero y predecir las respuestas al cambio ambiental.

Técnicas analíticas de alta resolución complementarias solo rendimiento para caracterizar mezclas complejas de materia orgánica Natural

El protocolo descrito proporciona un análisis proteómico cuantitativo optimizado de muestras de tejido utilizando dos enfoques: cuantificación basada en etiquetas y sin etiquetas. Los enfoques basados en etiquetas tienen la ventaja de una cuantificación más precisa de las proteínas, mientras que un enfoque sin etiquetas es más rentable y se utiliza para analizar cientos de muestras de una cohorte.

Flujo de trabajo integral de proteómica de escopeta basada en espectrometría de masas de muestras de tejido

Aquí describimos una caracterización proteómica basada en espectrometría de masas de linajes celulares con destinos tisulares conocidos en el embrión vertebrado de Xenopus laevis .

Proteómica de espectrometría de masas guiada por linaje celular en el embrión en desarrollo (rana)

La metaproteómica clínica ofrece información sobre el microbioma humano y sus contribuciones a la enfermedad. Aprovechamos el poder computacional de la plataforma Galaxy para desarrollar un flujo de trabajo bioinformático modular que facilita el análisis metaproteómico complejo basado en espectrometría de masas y la caracterización de diversos tipos de muestras clínicas relevantes para estudios de enfermedades.

Un flujo de trabajo de metaproteómica clínica implementado dentro de la plataforma Galaxy Bioinformatics para analizar las interacciones entre el huésped y el microbioma que subyacen a las enfermedades humanas

Aquí, establecemos un método proteómico basado en espectrometría de masas utilizando regiones aisladas de interés en secciones de tejido fijadas en formol e incluidas en parafina. Este protocolo se utiliza para analizar el proteoma de áreas específicas de tejido en secciones de tejido archivadas fijadas en formol e incluidas en parafina.

Un enfoque simplificado para la proteómica basada en espectrometría de masas utilizando regiones de tejido seleccionadas

Aprenda a extraer proteínas y ADN de biomasa microbiana marina mediante lisado, concentración y digestión con tripsina. Este flujo de trabajo genera péptidos aptos para análisis por espectrometría de masas en tándem.

Un Aquatic Microbial metaproteomics Flujo de trabajo: a partir de células a tríptico péptidos adecuados para el análisis basado en la espectrometría de masas en tándem (Video) | JoVE Journal

Un Aquatic Microbial metaproteomics Flujo de trabajo: a partir de células a tríptico péptidos adecuados para el análisis basado en la espectrometría de masas en tándem

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