Un Aquatic Microbial metaproteomics Flujo de trabajo: a partir de células a tríptico péptidos adecuados para el análisis basado en la espectrometría de masas en tándem

El objetivo de este procedimiento es la extracción de proteínas y ADN a partir de la biomasa microbiana de agua de mar, seguida de la generación de péptidos trípticos para el análisis proteómico basado en espectrometría de masas en tándem. Esto se logra primero lisando células previamente acumuladas en un filtro de cartucho. El segundo paso consiste en concentrar el lisado celular utilizando unidades de filtro ultracentrífugas.

A continuación, el lisado se separa en dos fracciones, una para la precipitación de proteínas y otra para la precipitación de ADN. El paso final consiste en realizar la digestión en gel con tripsina de las proteínas y extraer péptidos adecuados para el análisis mediante cromatografía líquida y espectrometría de masas en tándem. En última instancia, mediante un análisis bioinformático posterior se pueden identificar las proteínas expresadas en la muestra, mientras que el ADN aislado puede utilizarse para análisis metagenómicos y/o del gen 16 S-R-R-N-A.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que tanto la proteína como el ADN pueden aislarse simultáneamente de la misma muestra. Para comenzar, expulse la solución de estabilización de ARN desde la unidad de filtro del cartucho hacia un tubo microcentrífugo de dos mililitros, utilizando una jeringa de 60 mililitros conectada al extremo con cierre tipo luer del filtro centrífugo. Centrifugue el tubo microcentrífugo de dos mililitros durante 10 minutos a 17.000 × g para formar un precipitado de cualquier resto celular tras la centrifugación. Transfiera el sobrenadante a una unidad de filtro ultracentrífugo de 10 K para capturar cualquier proteína procedente de células que se hayan lisado en la muestra.

No deseche el precipitado. Realice la centrifugación de la unidad de filtro ultracentrífugo a 3.270 × g durante 30 minutos o hasta que el volumen se haya reducido a aproximadamente 600 microlitros. Mientras tanto, derrita la punta de una punta P10 y bloquee el lado del cartucho del filtro que no tiene bloqueo de seguridad con el extremo abierto de la punta.

Esto garantizará que ni el tampón de extracción ni la biomasa se escapen durante los pasos posteriores. Suspender el precipitado en un mililitro de solución de extracción de SDS y pipetearlo hacia la unidad original del filtro de cartucho. La forma más sencilla de pipetear dentro de la unidad de filtro de cartucho es colocar una punta P200 encima de una punta P1000 y utilizar esta doble punta para la pipetación. Añadir un mililitro adicional de solución de extracción de SDS a la unidad de filtro de cartucho para que el volumen total sea de aproximadamente dos mililitros.

Para film. Cierre el extremo del bloqueo de atracción de la unidad de filtro de cartucho y coloque la unidad de filtro de cartucho en el tubo de 50 mililitros. A continuación, coloque tres toallitas de laboratorio arrugadas en la parte inferior de un tubo cónico de 50 mililitros.

Cierre la tapa y coloque el tubo en el horno de hibridación para incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación. Después de 10 minutos, coloque el filtro sobre un flotador de espuma y sujételo en su lugar con una jeringa de cinco mililitros en el extremo de bloqueo del anzuelo; cargue e incube en un baño de agua a 95 grados Celsius durante 15 minutos. Luego, deje que la unidad de filtro con cartucho se enfríe y gire a temperatura ambiente durante una hora. Una vez frío, expulse la solución de extracción de SDS, lisado celular, del filtro mediante una jeringa de 60 mililitros hacia la misma unidad de filtro ultracentrífuga.

Como antes, agregue un mililitro de solución fresca de extracción con SDS a la unidad de filtro de cartucho y mezcle durante 30 segundos manualmente. Luego, expulse el contenido del filtro hacia la unidad de filtro ultracentrífugo utilizando la jeringa de 60 mililitros para enjuagar y asegurar que todas las proteínas hayan sido eliminadas y recolectadas. Realice la centrifugación en la unidad de filtro ultracentrífugo durante 45 minutos a 3.270 × g, o hasta que el volumen en la unidad de filtro sea inferior a 600 microlitros.

Deseche el flujo y complete el filtro ultracentrífugo con solución fresca de extracción de SDS. Centrifugue la unidad de filtro durante otros 45 minutos a 3.270 veces la gravedad antes de repetir este paso dos veces más. Asegúrese de que el volumen final en la unidad de filtro ultracentrífugo sea como máximo de 600 microlitros al final de la última centrifugación.

En este momento, mida el volumen del concentrado y divídalo en dos partes. Una fracción se utilizará para la precipitación de ADN y la otra para la precipitación de proteínas. Para la precipitación de proteínas, agregue cuatro volúmenes de metanol y acetona en una proporción de 50 a 50 por cada volumen de concentrado, vortexee durante 10 segundos e incube durante la noche a menos 20 grados Celsius.

Al día siguiente, centrifugar la mezcla a 17.000 × g durante 30 minutos; después de decantar el sobrenadante, dejar secar el precipitado en un evaporador al vacío durante una hora. No secar en exceso el precipitado, ya que esto podría dificultar su resuspensión.

Suspenda el sedimento en 25 microlitros de solución de extracción de SDS. Déjelo reposar durante una hora y luego resuspenda pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Realice electroforesis SDS-PAGE en las proteínas según se detalla en el protocolo del texto, trabajando en una cabina de seguridad biológica para minimizar la contaminación, y corte el exceso de gel por debajo de la marca de 10 kilodalton en cada carril.

Cada carril se analizará en el espectrómetro de masas en tándem. Cortar por separado cada carril en cuadrados de un milímetro por un milímetro para aumentar la superficie y colocar todos los cuadrados del carril en un tubo microcentrífugo de baja unión. Repetir para todos los carriles; se puede usar ácido acético al 1% para evitar que el gel se seque y se vuelva difícil de cortar.

Continúe con la digestión en gel con tripsina y la extracción de péptidos según se describe en el protocolo escrito o con la precipitación de ADN en la solución de extracción de SDS hasta la fracción concentrada que se utilizará para la precipitación de ADN hasta la marca de 500 microlitros. Este paso simplemente tiene como objetivo aumentar el volumen de la solución, facilitando así su manipulación. A continuación, agregue 0,583 volúmenes de un reactivo de precipitación de proteínas, como el reactivo MPC de precipitación de proteínas, y vortexee.

Durante 10 segundos, una forma blanca de precipitado se centrifuga a 17.000 × g y cuatro grados Celsius durante 10 minutos. Tras la centrifugación, transfiera el sobrenadante a otro tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros y añada 0,95 volúmenes de isopropanol; invierta la mezcla de 30 a 40 veces antes de centrifugar durante 10 minutos a cuatro grados Celsius a velocidad máxima. Decante con cuidado y deseche el sobrenadante. Luego, lave el precipitado dos veces con 750 microlitros de etanol al 70 %.

Elimine tanto etanol como sea posible mediante pipeteo y luego deje secar el pellet al aire. No seque en exceso el ADN, ya que esto podría dificultar su resuspensión una vez seco. Resuspenda el pellet en 25 microlitros de tampón bajo en T, pH 8.

Cuantifique el ADN utilizando un kit de ensayo de ADN de doble cadena y las instrucciones del fabricante. Asimismo, realice electroforesis en gel de agarosa con tres microlitros del ADN para comprobar su calidad. Los péptidos se sometieron a análisis de espectrometría en tándem a partir de los péptidos. Se generaron más de 23 000 espectros por muestra, a partir de los cuales se identificaron péptidos y proteínas.

La composición taxonómica y funcional de los metaproteomas se analizó mediante una combinación de blast P y el analizador de metagenomas. El paquete de software asignó las proteínas a las alfa proteobacterias, que fueron las más representadas en el conjunto de datos. La gran mayoría de estas se asignaron al clado SAR R 11.

El clado Roter de Alphaproteobacteria también estuvo altamente representado e identificado. Con mayor frecuencia en aguas superficiales. Las proteínas asignadas a enfermedades bacterianas se distribuyeron uniformemente entre la superficie y el máximo de clorofila, pero las proteínas de bacterias flageladas se identificaron en mayor grado en el máximo de clorofila.

Las proteínas de las gamma proteobacterias se distribuyeron uniformemente a lo largo de la columna de agua, mientras que las proteínas de las beta proteobacterias se encontraron predominantemente en la superficie. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en tres días si se lleva a cabo correctamente.