Name: Derivación de adultos fibroblastos humanos y de su conversión directa en células progenitoras neurales expandible (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 58 s
Description: Aprende a convertir directamente fibroblastos humanos en células progenitoras neurales inducidas mediante factores de reprogramación viral. Este método acelera la generación de células neuronales y gliales para aplicaciones terapéuticas personalizadas.

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Nos gustaría dar las gracias a todos los miembros de la célula de vástago y Regenerativa Grupo Medicina de la Universidad de Würzburg para sugerencias útiles y Martina Gebhardt, así como Heike Arthen para soporte técnico excelente. Este trabajo fue apoyado por becas de la Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (ED79 / 1-2), el Ministerio de Educación alemán e Investigación BMBF (01 GN 0813), las de investigación bávara Red pluripotentes inducidas Células Madre &quot;forIPS&quot; y la &quot;Stiftung Sibylle Assmus &quot;. La figura 1 se produjo usando Servier Medical Art, disponible de www.servier.com.

Los fibroblastos humanos utilizados en este estudio se obtuvieron a partir de una biopsia de la piel después de obtener el consentimiento informado y la aprobación ética por el comité de ética de la Universidad de Würzburg, Alemania (informe de ética no: 96/11 de fecha 06/10/2011). 1. Golpe Biopsia <ol><li> Desinfectar la piel del paciente. Anestesiar parte de la piel de los que la biopsia se tomará de (preferentemente una zona menos expuesta al sol) con 0,5 a 1 ml de clorhidrato de mepivacaína intracutáneamente y preparar biopsia de la piel utilizando un punzón de biopsia 3mm estéril, enjuague biopsia con DPBS + 1 l / 1 ml de gentamicina y quitar grasa. Enjuague biopsia dos veces con DPBS + Gentamicina, aspirado DPBS biopsia por completo y portada con dispasa II (2,4 U / ml) e incubar 16-18 horas a 4 ° C. </li><li> Aspirar Dispasa completamente, lavar dos veces con DPBS y eliminar la epidermis con pinzas. Lavar dos veces con DPBS biopsia, añadir 2 ml de colagenasa de tipo 2 (500 U / ml CDU), la transferencia en el tubo de 15 ml y añadir CollagenaSE hasta 5 ml de volumen total. Incubar durante 45 min a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Centrífuga 5 min a 180 xg y desechar el sobrenadante después. Resuspender pellet en 10 ml de DMEM-FCS-gentamicina-media (10% de FCS, 1 l / ml de gentamicina) y centrifugar de nuevo durante 5 min a 180 x g. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1,5 ml de DMEM-FCS-gentamicina-medios de comunicación. Transferencia a T25 matraz de cultivo de tejido adherente y se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Cambie medios cada 3 días. </li><li> Después de aproximadamente 2 semanas, cuando las células son confluentes alrededor de las partes de la piel, células de división utilizando tripsina / EDTA (0,05%): Lavar las células una vez con DPBS, se incuban 5 min a 37 ° C, 5% de CO 2 después de la adición de 2 ml de tripsina / EDTA (0,05%), añadir 2 ml de DMEM-FCS-gentamicina-media, traslado al tubo de 15 ml y centrifugar a 180 xg durante 5 min; deseche pellet sobrenadante y resuspender en cantidad apropiada de DMEM-FCS-gentamicina-medios de comunicación. </li><li> Ampliar aún más las células cambiando el medio cada 3 rd día y la división como se describió anteriormente cuando las células son confluentes; adición de gentamicina puede ser detenido después del paso 2. </li><li> Antes de utilizar las células para los experimentos de conversión directa, asegúrese de excluir la contaminación por micoplasma mediante ensayos normalizados. </li><li> Cuando las células se han ampliado, puede iniciar directamente la conversión o congelar las células hacia abajo usando DMSO al 10% y el 90% de FCS. Las células deben ser almacenados en -80 ° C durante 2 días y luego transferidas a nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo. </li><li> Para la preparación de conversión, lavar las células una vez con DPBS, aspirado DPBS y añadir 2,5 ml de tripsina / EDTA (0,05%). Mantenga durante 5 min a 37 ° C, 5% de CO 2. Frasco Toque suavemente para separar las células, resuspender en 2,5 ml de medio de fibroblastos (DMEM incl. L-Glu + 10% FCS + 1% + 1% NEAA piruvato de sodio) y traslado al tubo de 15 ml. Centrifugar a 180 xg durante 5 min y aspirar el sobrenadante. Resuspender las células en 1 ml de medio de fibroblastos y pipeta de arriba y abajo para generar la suspensión de células individuales. &lt;/ Li&gt; <li> Contar el número de células por medio de una cámara de recuento Fuchs-Rosenthal- o de células Neubauer y la placa 3 x 10 4 células por pocillo de una placa de 24. Incubar O / N a 37 ° C, 5% de CO 2. </li></ol> 2. La infección de fibroblastos humanos con Sendai Virus y transdiferenciación NOTA: Para garantizar la seguridad, los siguientes pasos que manipulen virus tienen que realizarse en una cabina de seguridad biológica y una campana de flujo laminar, y con el equipo adecuado personal de seguridad, sobre todo una máscara quirúrgica, para evitar la exposición de la mucosa. <ol><li> Interruptor de células a 100 l de medios de fibroblastos (Paso 1.9). Descongele alícuotas de Oct4-, Klf4-, Sox2- y virus c-myc-Sendai y resuspender cada virus en 1 ml de medio de fibroblastos. Añadir cada virus con una MOI de 3 para las células (título de virus varía de lote a lote, pero una parte alícuota de cada virus generalmente se puede utilizar para la infección de 10 pocillos de una placa de 24 pocillos) y mezclar suavemente. Incubar O / N a 37 ° C, 5% de CO 2 </sub&gt;. </li><li> Después de 24 hr aspirado el medio y añadir 500 l de medios de comunicación neuroinduction (1: 1 DMEM / F-12: Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 1% GlutaMAX, 10 ng / ml hLIF, 3 M CHIR99021, 2 M SB431542) y cultivo a 39 ° C, 5% de CO 2 a partir de ahora. Cambie los medios de comunicación cada dos días. </li><li> El día 6 después de la infección preparar 6-así placas recubiertas con laminina: diluir laminina a 1 g / ml en DPBS, añadir 1 ml de solución sobre 6 pocillos placas y mantener a 4 ° C durante 24 horas. </li><li> En el día 7 después de la infección dividir las células utilizando DPBS / EDTA: Aspirar los medios de comunicación y lavar las células una vez con DPBS, a continuación, añadir 500 l de DPBS / EDTA y se incuba durante 10 minutos a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Añadir 500 l de DMEM / F12 y retirar la suspensión de la placa en un tubo de 15 ml y centrifugar a 180 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 1,5 ml de medio neuroinduction, placa en 6 pocillos placas recubiertas con laminina y añadir ROCA inhibidor Y27632 en un conce definitivantration de 10 mM a las células, de cultivo a 39 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Cambie los medios de comunicación cada dos días. </li><li> De día 14 después de la infección las células de cultivo a 37 ° C, 5% de CO 2. Colonias neuroepiteliales se manifiestan alrededor de 17 días después de la infección por microscopía de contraste de fase. Deben ser lo suficientemente grande como para ser recogidos alrededor del día 20 después de la infección. </li></ol> 3. El aislamiento de colonias Putativos INPC <ol><li> Un día antes de recoger, capa un 48 bien plato con laminina: diluir laminina a 1 g / ml en DPBS, añadir 300 l de solución en placas y mantener a 4 ° C durante 24 horas. Un día después aspirado de la laminina de las placas y añadir 200 l de medios de comunicación neuroinduction a los pocillos. </li><li> Lave bien las placas que contenían las colonias para ser recogidos una vez con DPBS y añaden DPBS 6 2 ml por pocillo de 6 pocillos de la placa. Escoja las colonias mecánicamente: raspar alrededor de las colonias utilizando una aguja fina para deshacerse de las células circundantes; establecer el 2001; l Pipetman en 50 l y recoger las colonias utilizando las respectivas puntas de pipeta. </li><li> Transferir una colonia cada uno en un pocillo de una placa de 48 pocillos-laminina-revestido y generar una única suspensión de células mecánicamente por pipeteando arriba y abajo 10 veces. Añadir Y27632 inhibidor de ROCK en una concentración final de 10 mM a las células. </li><li> Cultivar las células en la placa de pocillos 48 a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 2 días. Cambie los medios de comunicación cada dos días hasta que las células alcanzan el 80 - 90% de confluencia (aprox. 3 - 4 días). </li></ol> 4. Ampliación y Cryo-preservación de iNPCs <ol><li> Pases y Expansión de iNPCs <ol><li> Aspirar el medio y lavar las células con DPBS. Aspirar el DPBS y añadir 200 l DPBS / EDTA y se incuba durante 10 min a 37 ° C, 5% de CO 2, añadir 200 l de DMEM / F12 y retirar la suspensión de la placa en un tubo de 15 ml, centrifugar a 180 xg durante 5 min . </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 0,5 ml de Neuroimedios nduction (Paso 2.2), la placa de 12 pocillos en placas recubiertas con laminina y añadir Y27632 inhibidor de ROCK en una concentración final de 10 mM a las células, de cultivo a 37 ° C, 5% de CO 2. Después las células alcanzan el 80 - 90% de confluencia que puede ser o bien más expandido o congelados de la siguiente manera. </li></ol></li><li> Congelación de iNPCs <ol><li> Aspirar el medio y lavar las células con DPBS. Aspirar el DPBS y añadir 300μl DPBS / EDTA y se incuba durante 10 min a 37 ° C, 5% de CO 2, añadir 300 l de DMEM / F12 y retirar la suspensión de la placa en un tubo de 15 ml, centrifugar a 180 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 0,5 ml de medio de congelación NSC comercial. Suspensión de transferencia a viales de congelación y poner en un recipiente de congelación de células. Conservar a -80 ° C durante 2 días, luego traslado al nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo. </li></ol></li></ol> 5. Diferenciación de iNPCs <ol><li> Diferenciación hacia neuronaal linaje <ol><li> Células de cultivo en placas recubiertas con laminina como se describió anteriormente. Cambiar medios para neuro-diff-media (DMEM / F-12, 1x N2, 1x B27, 300 ng / ml de AMPc, 200 mM de vitamina C, 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF) cuando las células son de aproximadamente 70% confluente. Cambie medios cada dos días durante tres semanas. Haga células no divididas durante la diferenciación. </li><li> Después de tres semanas células deben expresar la Tuj1 marcador neuronal. Para obtener más neuronas maduras y subtipos neuronales continuar la diferenciación de hasta 3 meses. </li></ol></li><li> Diferenciación hacia el linaje glial <ol><li> Cambio de medio a medio de inducción glial (1: 1 DMEM / F-12: Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 10 mM β-mercaptoetanol, 100 mM de aminoácidos no esenciales, 1,5 mM L-glutamina, insulina 5 mg / ml, 40 ng / ml T3) incluyendo 20 ng / ml de EGF para inducir la diferenciación en células precursoras gliales. Retire la mitad de los medios de comunicación y reemplazar por medio fresco cada dos días durante 2 semanas. Durante este período, las células deben dividirse1: 3 en presencia de 10 mM inhibidor ROCA Y27632 cuando se alcanza 100% de confluencia. </li><li> Después de 2 semanas diferenciar las células más en astrocitos: cuando las células son los medios de comunicación de cambio de casi confluentes a los medios de comunicación disponibles astrocito comercial, cambio de medio cada dos días. Después de aproximadamente 7 días las células comienzan a expresar marcadores de astrocitos (por ejemplo, GFAP). Si las células consiguen 100% confluentes durante el protocolo de diferenciación, dividirlos en una proporción de 1: 2 en presencia de 10 mM inhibidor ROCA Y27632. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Aquí mostramos el aislamiento y la conversión directa de fibroblastos humanos en células progenitoras neurales-transgenes libre expandibles y su progenie diferenciada como base putativo para la terapia de células de reemplazo o aplicación en los análisis de detección de drogas. Conversión linaje directo de las células somáticas en los NPCs se ha logrado mediante la expresión forzada de transcripción específicos de linaje factores 26,33,34. Sin embargo, en muchos casos se utilizaron fibroblastos fetales para l...

En 2006 Yamanaka y sus colegas pudieron mostrar por primera vez la posibilidad de reprogramación de células somáticas en un estado pluripotente 1. Este desdiferenciación se logró mediante la sobreexpresión de cuatro factores de transcripción Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc y en fibroblastos murinos. Los llamados células madre pluripotentes inducidas generadas (iPSCs) muestran equivalencia funcional a las células madre embrionarias (CES) y por lo tanto pueden diferenciarse en todos los tipos celulares del organismo adulto. Un año más tarde la reprogramación de células iPS también podría lograrse para los fibroblastos humanos 2. Los experimentos en modelos animales demuestran que las células derivadas de IPSC generalmente se pueden utilizar para la terapia de reemplazo celular, por ejemplo, en la enfermedad de Parkinson (PD) 3-5. Sin embargo, varias limitaciones asociadas con el uso de iPSCs representan obstáculos para la plena realización de su potencial terapéutico. En primer lugar, la reprogramación de las células en un estado pluripotente y posteriorcontrol de calidad es generalmente un tiempo y proceso ineficiente rendimiento en los procedimientos extensos y por lo tanto costosos de cultivo celular. En segundo lugar, iPSCs necesitan ser re-diferenciado en el tipo de célula deseada de interés antes de la aplicación biomédica y la probabilidad de células pluripotentes residuales en la población diferenciada alberga un potencial tumorigénico significativa y por lo tanto muestra un alto riesgo después de trasplante de células 6. En tercer lugar, el proceso de reprogramación se consigue normalmente mediante la inducción de los factores de reprogramación por la infección lenti- o retroviral. La integración de estos virus en el genoma huésped podría conducir a la mutagénesis de inserción y / o reactivación incontrolada de los transgenes 7,8. Los sistemas no integrativos se han desarrollado para entregar los factores de reprogramación a las células diana, que minimizan el riesgo de mutagénesis por inserción y la reactivación del transgén. Ejemplos de estos enfoques transgenes libre son la reprogramación de las células utilizando no la integraciónAdeno o virus Sendai 9,10, vectores basados ​​en ADN 11 o la aplicación de métodos de ADN libre, como la transfección de ARNm sintético 12 o transducción de proteínas recombinantes 13,14. Otro método prometedor para la derivación de-transgén libre IPSC es el uso de constructos de reprogramación lentiviral modificado loxP-y la posterior eliminación de los transgenes utilizando el sistema de recombinación Cre-loxP de ADN 15,16. Un enfoque más directo para generar células neurales de la terapia de reemplazo celular representa la conversión directa de los fibroblastos en neuronas post-mitóticas 17-20. Vierbuchen et al. Informó de que la sobreexpresión de factores de transcripción Ascl1, Brn2 y Myt1l resultados en la generación de 20% neuronas de fibroblastos murinos 17. En 2011 se demostró, que los mismos tres factores de transcripción en combinación con sobreexpresión de NeuroD1 permiten transdiferenciación de fibroblastos humanos en neuRons 19. Neuronas inducida humanos también podrían ser generados por la sobreexpresión de Ascl1 y Ngn2 bajo dual SMAD- e inhibición GSK3β- 20. En particular, la conversión directa de los fibroblastos en neuronas genera una población de células no proliferativa, post-mitótico que no permite una mayor expansión y bancos biológicos. Recientemente, la conversión directa de fibroblastos en una población de células neurales madre / progenitoras proliferantes se informó 21-26. Para mayor claridad, todos estos tipos de células se denominan como células progenitoras neuronales inducidas (iNPCs) en este informe. Han et al. Sobreexpresa Brn4, Sox2, c-Myc y Klf4 para generar iNPCs. Al igual que sus contrapartes de células madre neurales derivadas de células de tejido, ya sea primaria o pluripotentes estos iNPCs son tripotential y podrían diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos 21. Nuestro grupo informó de un protocolo de conversión ligeramente diferente que implica la sobreexpresión de Sox2, Klf4, Y c-Myc y inducida Oct4-expresión para sólo 5 días. Con este enfoque podemos generar de forma estable en proliferación iNPCs desde embrionarias y adultas fibroblastos murinos que exhiben silenciamiento completo de la reprogramación factores 22. En contraste con la CMPI, iNPCs no presentan un potencial tumorigénico después del trasplante 27. Utilizamos células convertidos con éxito en un modelo animal de la desmielinización, ratas con deficiencia de mielina, lo que demuestra que iNPCs son clínicamente útil 22. Hasta entonces, los NPCs podrían solamente generan a partir de células madre pluripotentes o tejido neuronal primaria 28-32. iNPCs son células de forma estable expandibles que pueden ser criopreservados y son capaces de diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. Se han hecho grandes esfuerzos para adaptar el protocolo de conversión directa de ratón para células humanas 23,26,33,34. En 2012 se publicó que la sobreexpresión de la Sox2 solo factor en fibroblastos es suficiente para generar murinos y humanos iNPCs <shasta&gt; 33. Los autores informaron generación de iNPCs humanos de fibroblastos de prepucio fetales y les caracterizan por tinción contra Sox2 y Nestina. Sin embargo, las células diana utilizados para la reprogramación representan un tipo de célula muy particular que no va a estar disponible en la práctica clínica y no había caracterización funcional de las células convertidas por el trasplante en un modelo animal realizado. Una publicación más reciente describe la generación de los progenitores restringidas neuronales a partir de fibroblastos fetales humanos por la sobreexpresión de Sox2, c-Myc y, o bien Brn2 o Brn4 34. Las líneas celulares generadas mostraron la capacidad de auto-renovación y podrían diferenciarse en varios tipos de neuronas terminales. Sin embargo, el uso de fibroblastos fetales es desfavorable, ya que estas células son de origen heterogéneo y uno no puede excluir la presencia de, por ejemplo residual, las células madre de la cresta neural en las preparaciones. En 2014, Zhu et al. Reportaron la conversión directa de un adulto humano y el neonatales fibroblastos en células progenitoras neurales tripotential por la sobreexpresión de Sox2 junto con Oct4 o Oct4 solo y adición de pequeñas moléculas a los medios de cultivo celular. En particular, sobre la base de sus estudios Sox2 sola fue insuficiente para inducir la conversión directa 26. Más recientemente, Lu et al. Informó de que la sobreexpresión de la Yamanaka factores de Oct4-, Sox2-, Klf4-, c-Myc por el virus de Sendai durante 24 horas y la posterior inactivación del virus por el aumento de temperatura da como resultado la generación de neural tripotential expandible células precursoras 23. En conclusión, aunque los protocolos de conversión publicados para las células humanas hasta ahora tienen en común la sobreexpresión de al menos uno o más de los factores Yamanaka, a menudo en una manera oportuna restringido, no hay ninguna indicación clara de los factores moleculares mínimos necesarios para conducir directa conversión en iNPCs. La sobreexpresión oportuna restringido de Oct4 por medios genéticos, la transfección con mRNA sintético, o cproteína ell-permeante junto con la expresión constitutiva de Sox2, Klf-4, y c-Myc no resultó en líneas estables INPC humanos todavía. Por lo tanto, la aplicación de virus Sendai para sobreexpresar todos los factores Yamanaka y oportuna restringir su actividad por la inactivación por calor del virus 23 junto con las condiciones de inducción neural medios optimizados 22,31 representa la estrategia preferida hasta el momento. Varios estudios demuestran la funcionalidad celular de NSCs o sus homólogos diferenciados en diferentes modelos de enfermedad animal. Progenitores neuronales a partir de células madre pluripotentes humanas se han trasplantado en modelos de ratón de la enfermedad neuroinflamatoria esclerosis múltiple 35,36. La aplicabilidad de las células progenitoras neuronales de células madre derivadas de la EAE (encefalomielitis autoinmune experimental) -mice fue mostrado por primera vez en 2008 35. Células precursoras neuronales multipotentes fueron inyectadas en los ventrículos del cerebro de ratón, y el resultado del trasplanteed en la reducción de los signos clínicos de EAE. Kim et al. Generada precursores oligodendrogliales de hESCs y trasplantado los intracerebroventricular en EAE-ratones. Aunque los trasplantes no sobrevivieron durante más de 10 días, los ratones mostraron una mejoría significativa de la función neurológica y la reducción de las células inmunitarias proinflamatorias en la materia blanca 36. Terapia con células madre también se ha aplicado para preclínicamente focalización de la enfermedad de Parkinson como NPCs podrían ser empleados con éxito en los modelos animales respectivos. Para ello, las células progenitoras o bien se derivan de tejido cerebral fetal 37 diferenciadas a partir de células madre pluripotentes 38-40 o células madre mesenquimales 41 se han utilizado. En 2012 se demostró que iNPCs ratón son capaces de producir la proteína proteolipídica, el principal componente de proteína de la mielina, después del trasplante en el cerebro de ratas (md) mielina deficientes 22. Por ese experimento el applicabil terapéutica prueba de principiodad de iNPCs fue probado en primer lugar y luego confirmado por otro estudio 32. Sin embargo, el potencial de uso terapéutico de iNPCs humanos queda por explorar. Aquí mostramos un proceso robusto e integrado de (i) obtención de células primarias humanas de pacientes adultos a través de biopsia de la piel, (ii) la conversión directa de los fibroblastos humanos en un estado progenitor neural y (iii) la capacidad de iNPCs a diferenciarse en neuronal y linajes gliales. El uso de este protocolo ayudará a acelerar la generación de células humanas autólogas para aplicaciones terapéuticas.

<table><tbody><tr><td>Medios de astrocitos</td><td>ScienCell</td><td>1801</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>LifeTechnologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>Punzón de biopsia</td><td>pfm medical</td><td>48301</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma</td><td>A6885</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Axon medchem</td><td>1386</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa Tipo2</td><td>Worthington Bioquímico</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>Dispasa</td><td>PAN&nbsp;</td><td>P10-032100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>LifeTechnologies</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F12</td><td>LifeTechnologies</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Roth</td><td>4720</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>LifeTechnologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0313</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biochrom AG</td><td>50115</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Sigma</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>GFAP-anticuerpo</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>LifeTechnologies</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>hLIF</td><td>Peprotech</td><td>300-05</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Seralab</td><td>GEM-700-112-P</td><td></td></tr><tr><td>Ki67-anticuerpo</td><td>NeoMarkers</td><td>RM-9106-S</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>LifeTechnologies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>LifeTechnologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Nestina-anticuerpo</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1259</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>LifeTechnologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales</td><td>LifeTechnologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>NSC medios de congelación</td><td>Sigma</td><td>C6295</td><td></td></tr><tr><td>Oct4-anticuerpo</td><td>Santa Cruz</td><td>sc9081</td><td></td></tr><tr><td>Pax6-anticuerpo Covance</td><td></td><td>PRB-278P</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Virus Invivogen</td><td>inh-sb43</td><td></td></tr><tr><td>Sendai: Kit de reprogramación CytoTune Sendai</td><td>&nbsp; LifeTechnologies</td><td>A1378001</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Life Technologies</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>Sox1-anticuerpo</td><td>R& D Systems</td><td>AF3369</td><td></td></tr><tr><td>Sox2-anticuerpo</td><td>R& D Systems</td><td>MAB2018</td><td></td></tr><tr><td>T3 Santa</td><td>Cruz</td><td>sc-205725</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>TUJ1-anticuerpo</td><td>Covance</td><td>MMS-435P-250</td><td></td></tr><tr><td>Vitamina C</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Calbiochem</td><td>CAS 146986-50-7</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td></td><td>21985023</td><td></td> LifeTechnologies</tr></tbody></table>

derivación de adultos fibroblastos humanos y de su conversión directa en células progenitoras neurales expandible

Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

Generación de células madre pluripotentes inducidas (CMPI) a partir de fibroblastos de la piel de adultos y la posterior diferenciación en células somáticas ofrece perspectivas fascinantes para la derivación de los trasplantes autólogos que eluden las barreras de histocompatibilidad. Sin embargo, la progresión a través de un estado pluripotente y la posterior diferenciación en linajes deseados completa sigue siendo un obstáculo para la traducción clínica de la tecnología de IPSC debido a la inestabilidad potencial y genómico neoplásica asociada. Recientemente, nosotros y otros mostraron que las células somáticas no sólo pueden ser convertidos en iPSCs sino también en diferentes tipos de células madre somáticas multipotentes mediante el uso de factores definidos, eludiendo así la progresión a través del estado pluripotente. En particular, la conversión directa de fibroblastos humanos en células progenitoras neuronales inducidas (iNPCs) anuncia la posibilidad de una nueva fuente de células autólogas para diversas aplicaciones tales como el reemplazo de células, el modelado de la enfermedady la detección de drogas. Aquí se describe el aislamiento de fibroblastos primarios humanos adultos por biopsia de la piel y su conversión directa eficiente en iNPCs por expresión oportuna restringido de Oct4, Sox2, Klf4, así como c-Myc. Colonias neuroepiteliales Sox2 positivos aparecen después de 17 días de inducción y líneas INPC se pueden establecer de manera eficiente por el aislamiento y la expansión monoclonal. Ajuste preciso de la multiplicidad de la infección viral y la suplementación de factor inhibidor de leucemia durante la fase de inducción representan factores críticos para lograr eficiencias de conversión de hasta el 0,2%. Hasta el momento, INPC líneas específicas del paciente podrían ampliarse por más de 12 pasajes y uniformemente muestran rasgos morfológicos y moleculares de las células madre / progenitoras neuronales, como la expresión de nestina y Sox2. Las líneas INPC pueden diferenciarse en neuronas y astrocitos, a juzgar por la tinción contra Tuj1 y GFAP, respectivamente. En conclusión, se presenta un protocolo robusto para la derivación y gravect conversión de fibroblastos humanos en células progenitoras neurales de forma estable expandibles que podrían proporcionar una fuente celular para aplicaciones biomédicas, tales como el reemplazo de células neurales autólogo y el modelado de la enfermedad.

Aquí presentamos descripción de un proceso integrado que permite la generación de células progenitoras neuronales inducidas (iNPCs) a partir de fibroblastos humanos que se han obtenido por una biopsia en sacabocados de la piel en menos de 8 semanas (Figura 1). INPCs-Paciente specifc se pueden diferenciar aún más en linajes neuronales y gliales y albergan un enorme potencial para la terapia de reemplazo celular y el modelado de la enfermedad. La infección de los fibroblastos ...

Generación de células madre pluripotentes inducidas ofrece perspectivas fascinantes para la derivación de los trasplantes autólogos. Sin embargo, la progresión a través de un estado pluripotente y laborioso re-diferenciación todavía dificulta traducción clínica. Aquí se describe la derivación de fibroblastos humanos de adultos y su conversión directa en células progenitoras neuronales inducidas y la posterior diferenciación en linajes neuronales.

Derivación de adultos fibroblastos humanos y de su conversión directa en células progenitoras neurales expandible

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

El objetivo general de este procedimiento es acortar el enfoque clásico de IPS de Yamanaka mediante la generación directa de células progenitoras neuronales inducidas a partir de una biopsia de piel del paciente para aplicaciones terapéuticas. Esto se logra primero realizando una biopsia por punch en el paciente para obtener células fibroblásticas primarias que pueden cultivarse in vitro. El segundo paso consiste en expandir y posteriormente infectar los fibroblastos cultivados con virus que codifican factores de reprogramación para inducir la transdiferenciación.A continuación, las colonias de células progenitoras neurales inducidas (INPC) putativas convertidas deben seleccionarse cuidadosamente mediante validación visual y posteriormente aislarse mediante selección manual aproximadamente 20 días después de la infección. El paso final consiste en obtener una línea monoclonal, expandir las IPC en medio de inducción neural y, finalmente, dirigirlas hacia una diferenciación in vitro, utilizando además microscopía de inmunofluorescencia para demostrar que las IPC directamente convertidas a partir de células del propio paciente son capaces de diferenciarse en células neuronales y gliales, convirtiéndolas así en una fuente prácticamente ilimitada para aplicaciones biomédicas. La ventaja de esta técnica de conversión directa frente a métodos existentes, como la obtención de células madre pluripotentes inducidas al estilo Yamanaka y su posterior diferenciación, es doble.La conversión directa en células madre neurales inducidas pluripotentes, a las que llamamos células INS, no solo es considerablemente más rápida, sino también más segura. Por lo tanto, el procedimiento de transdiferenciación hará mucho más accesible la producción de células específicas del paciente para aplicaciones terapéuticas y presentará un riesgo drásticamente menor de formación de tumores en comparación con las células IPS. De este modo, ahora podemos superar dos de los principales obstáculos actuales en el avance de la medicina regenerativa.Esa es la seguridad y eficacia clínicas. Para comenzar la biopsia por punch, desinfecte la piel del paciente e inyecte anestesia en la zona donde se tomará la biopsia con 0,5 a un mililitro de mepivacaína hidrocloruro por vía intradérmica. Obtenga la biopsia de piel utilizando un punch estéril de tres milímetros.Lave la biopsia con solución salina tamponada con fosfato tipo Dobe o DPBS más un microlitro por mililitro de gentamicina. Retire la grasa de la biopsia utilizando un escalpelo y pinzas. Luego, lave la biopsia dos veces más con el tampón antes de aspirarla completamente.Cubra la biopsia con dis paste two e incube de 16 a 18 horas a cuatro grados Celsius. Tras la incubación, aspire completamente el dis paste two antes de lavar la biopsia dos veces con DPBS. Retire la epidermis con pinzas y luego lave la biopsia otras dos veces con DPBS.A continuación, agregue dos mililitros de colagenasa tipo dos y transfiera a un tubo de 15 mililitros. Añada colagenasa hasta un volumen total de cinco mililitros. Incube durante 45 minutos a 37 grados Celsius.Centrifugar la muestra durante cinco minutos a 180 ×g y desechar el sobrenadante posteriormente. Suspender nuevamente el precipitado en 10 mililitros de medio DMEM con suero de feto bovino y gentamicina, y luego centrifugar nuevamente durante cinco minutos a 180 ×g. Desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 1,5 mililitros del mismo medio. A continuación, transferir la muestra a un frasco de cultivo de tejidos adherentes T 25 e incubar a 37 grados Celsius en atmósfera con 5 %CO₂, cambiando el medio cada tres días tras aproximadamente dos semanas.Una vez que las células sean confluentes alrededor de las partes de la piel, divida las células utilizando tripsina EDTA según se describe en el protocolo escrito. Amplíe más las células cambiando el medio cada tercer día y dividiéndolas cuando estén confluentes. Después de descartar la contaminación por micoplasma mediante ensayos estándar, prepare las células para el experimento de conversión directa lavándolas una vez con DPBS, luego aspire el DPBS y agregue 2,5 mililitros de tripsina EDTA. Tras incubar las células durante cinco minutos a 37 grados Celsius, 5 %CO2, golpee suavemente el matraz para desprender las células.Re-suspenda las células en 2,5 mililitros de medio para fibroblastos y transfiera a un tubo de 15 mililitros. Centrifugue el tubo a 180 ×g durante cinco minutos y aspire el sobrenadante. Re-suspenda las células en un mililitro de medio para fibroblastos y pipeteé arriba y abajo para obtener una suspensión de células individuales.Cuente el número de células utilizando una cámara de recuento celular antes de sembrarlas. 30.000 células por pocillo. Incube las células durante la noche en una placa de 24 pocillos a 37 grados Celsius, 5 %CO2. Los pasos que involucren el manejo del virus deben realizarse en una cabina de seguridad biológica con equipo de protección personal adecuado, incluyendo una mascarilla quirúrgica para prevenir la exposición mucosa.Para realizar la infección, primero reemplace el medio celular existente con 100 microlitros de medio para fibroblastos. Luego, resuspenda los alícuotas descongelados de los virus T cuatro, KLF cuatro, SOX dos y cmix sendi en un mililitro de medio para fibroblastos. Añada cada virus a un MOI de tres a las células y mezcle suavemente. Incube las células durante la noche a 37 grados Celsius, 5 %CO2. Después de 24 horas, aspire el medio y añada 500 microlitros de medio de inducción neuronal. Cultive las células a 39 grados Celsius, 5 %CO2 a partir de ahora, cambiando el medio cada dos días. En el día seis tras la infección, prepare placas de seis pocillos recubiertas con laminina.Añada un mililitro de laminina a una concentración de un microgramo por mililitro en DPBS sobre placas de seis pocillos y mantenga las placas a cuatro grados Celsius durante 24 horas el día siete después de la infección, divida las células utilizando D-P-B-S-E-D-T-A según se describe en el protocolo del texto. Añada 500 microlitros de D-M-E-M-F 12 y transfiera la suspensión a un tubo de 15 mililitros. Luego, centrifugue la muestra a 180 ×g durante cinco minutos.Aspire el sobrenadante y resuspenda el sedimento en 1,5 mililitros de medio de inducción neuronal. Siembre las células en placas de seis pocillos recubiertas con laminina y añada inhibidor de quinasa RO hasta una concentración final de 10 micromoles. Incube las células a 39 grados Celsius y 5 %CO₂, cambiando el medio cada dos días a partir del día 14. Tras la infección, cultive las células a 37 grados Celsius y 5 %CO₂; alrededor del día 17 después de la infección, se observan colonias de epitelio neural mediante microscopía de contraste de fase.Deben ser lo suficientemente grandes como para seleccionarlos alrededor del día 20 después de la infección un día antes de seleccionar el recubrimiento 1 placa de 48 pozos con laminina según se describe en el protocolo del texto; un día después, aspire el laminado de las placas y agregue 200 microlitros de medio de inducción neuronal a los pozos. Lave las placas de seis pozos que contienen las colonias a seleccionar, una vez con DPBS antes de agregar dos mililitros de inducción neuronal.Medio por pocillo de una placa de seis pocillos, seleccione mecánicamente las células raspando alrededor de las colonias usando una aguja fina para eliminar las células circundantes y recogiendo las colonias con puntas de pipeta. Montado en una pipeta de 200 microlitros ajustada a 50 microlitros. Transfiera cada colonia a un pocillo de una placa de 48 pocillos recubierta con laminina y genere una suspensión de células individuales mecánicamente pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces.Añada inhibidor de la quinasa R en una concentración final de 10 micromolar a las células. Incube las células en la placa de 48 pocillos a 37 grados Celsius, 5 %CO2 durante dos días. Cambie el medio cada segundo día hasta que las células alcancen una confluencia del 80 al 90 %.Véase el protocolo escrito para la expansión y criopreservación de las IPC para la diferenciación de las IPC hacia un cultivo de linaje neuronal. Las células en placas recubiertas con laminina. Como antes, cambie el medio a medio de diferenciación neuronal cuando las células tengan aproximadamente un 70 % de confluencia y continúe cambiando el medio cada dos días durante tres semanas.No separe las células durante la diferenciación después de tres semanas; las células deben expresar el marcador neuronal TUJ1 para obtener neuronas más maduras y subtipos neuronales. Continúe la diferenciación hasta tres meses para la diferenciación de CIP, específicamente hacia una línea glial. Cambie el medio a medio de inducción glial, que incluye 20 nanogramos por mililitro de factor de crecimiento epidérmico para inducir la diferenciación en células precursoras gliales.Retire la mitad del medio y sustitúyalo por medio fresco cada dos días durante aproximadamente dos semanas. Durante este período, las células deben dividirse uno a tres en presencia de 10 micromolar de inhibidor de R cinasa cuando se alcance la confluencia al 100% después de dos semanas. Diferencie aún más las células hacia astrocitos cambiando el medio a medio para astrocitos disponible comercialmente cuando las células estén casi confluentes, y continúe cambiando el medio cada segundo día; aproximadamente siete días después, las células comienzan a expresar marcadores de astrocitos.Si las células alcanzan una confluencia del 100 % durante el protocolo de diferenciación, divídalas en una proporción de uno a dos. En presencia de 10 micromoles del inhibidor de la quinasa RO, la infección de los fibroblastos con los virus T 4K LF cuatro, SOX dos, y cmix sendi y el cultivo en condiciones de medio neuroinductivo provocaron un cambio en la morfología de los fibroblastos y la posterior aparición de colonias. Diecisiete días después de la infección, las líneas celulares monoclonales generadas pueden ampliarse y presentar tinción positiva para marcadores de células madre neurales como SOX dos, SOX uno nestina y PAC seis, así como para el marcador de proliferación KI 67, mientras que no expresan el marcador asociado a pluripotencia T cuatro.Además, mediante la adición de factores de crecimiento neuronal al medio de cultivo celular, las células progenitoras neurales pueden diferenciarse en neuronas aplicando una diferenciación en astrocitos. Las líneas celulares de progenitores neurales inducidas por protocolo también pueden diferenciarse en linajes gliales, según el análisis de cambios morfológicos típicos y tinción frente a GFAP. Mediante esta conversión directa, generamos células progenitoras neurales inducidas multipotentes a partir de fibroblastos de pacientes en tres o cuatro semanas.Estas células podrían utilizarse para numerosas aplicaciones biomédicas. Las implicaciones de esta técnica abarcan terapia, diagnóstico y modelado de trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson, así como otras afecciones neurológicas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

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