Aplicación de Ensayo inmunoensayo de largo plazo culta Interferón-γ ligado a enzimas para la evaluación efectoras y de memoria T respuestas celulares en el ganado

El objetivo general de este procedimiento es evaluar las respuestas de las células T efectoras y de memoria mediante ensayos de punto de interferón gamma L cultivado a corto y largo plazo, respectivamente. La evaluación de la respuesta de memoria central se lleva a cabo mediante el cultivo de células mononucleares de sangre periférica bovina bajo estimulación antigénica durante 13 días. El cultivo a largo plazo permite que se produzcan y disminuyan las respuestas de las células T efectoras.

La interleucina dos se añade a los cultivos para el mantenimiento de las células T de memoria. En el día 13, las células a largo plazo se transfieren a placas de punto L recubiertas con el anticuerpo de captura gamma IFN. La respuesta de las células a largo plazo a los antígenos micobacterianos individuales se evalúa en presencia o ausencia de células presentadoras de antígenos autólogos.

APCs Las APC se aíslan de las BMC p frescas por adherencia en el día 13. Además, se evalúa la respuesta de pbmc recién aislada en condiciones ex vivo como un correlato de las respuestas efectoras. En varios estudios, se ha demostrado que la respuesta a largo plazo de los sbot cultivados en bovinos a los antígenos micobacterianos después de la vacunación se correlaciona positivamente con la eficacia de la vacuna.

Además, los cultivos de linfocitos T a largo plazo contienen principalmente linfocitos T de memoria central tanto en humanos como en bovinos. Para realizar el ensayo de punto L cultivado a largo plazo. Se recogen 60 mls de sangre de animales infectados o vacunados por yugular, venopunción y se aíslan las BMC P por densidad. Centrifugación en gradiente.

La concentración celular debe ajustarse a 4 millones de células por ml. En los medios RPMI completos, se comienza con la siembra de 500 microlitros de antígenos microbacterianos, en este caso TB 10.4 y antígeno 85 A y el derivado proteico purificado del cultivo em bovis llamado PPDB. Luego agregue 500 microlitros de pbmc aislado de cada animal con cuatro réplicas por animal.

Tenga en cuenta que todos los pozos deben ser estimulados. En este paso, incubar la placa a 39 grados centígrados la temperatura normal del ganado durante 13 días. En los días tres y siete, deseche 500 microlitros de cada pipeteo de pocillo con cuidado para no alterar la capa celular en el fondo de los pocillos.

Reponga el volumen con PMI completo que contenga IL Dos. Coloque la placa en la incubadora el día 10, deseche 750 microlitros del sobrenadante de cada pocillo, reponga con RPMI completo sin IL dos el día 12, pipetee y deseche un ml de sobrenadante de cada pocillo repuesto con RPMI completo sin IL dos. Prepare también la placa de punto L para recubrirla con IFM Gamma capture anticuerpos, primero pipetee 15 microlitros de alcohol al 35% en cada pocillo utilizando una pipeta multicanal, este paso aumenta la definición del punto.

Lavar bien seis veces con 300 microlitros de PBS. Añadir 100 microlitros de anticuerpo de captura a ocho microgramos por ml en PBS. El pipeteo debe realizarse con cuidado durante todos los procedimientos, no permitiendo que las puntas de las pipetas toquen o dañen la membrana en la parte inferior del pocillo, coloque la placa dentro de una bolsa de plástico e incube a cuatro grados centígrados durante la noche.

El día 13 se recogieron 60 ml de sangre por punción de la vena yugular de los mismos animales muestreados en el primer día. Aísle el pbmc y ajuste la concentración a 2 millones de células por ml. Etiquete correctamente la placa de punto L para cada conjunto de muestras.

Células de larga duración más APCs, células de larga duración sin APCs y células ex vivo. Deseche el anticuerpo de captura de los pocillos de lavado de placa puntual Ellis con 300 microlitros de PBS que contienen tween. Repita seis veces, deseche, lave el líquido y pipetee.

50 microlitros de BMC de p recién aislados en los pocillos asignados para las células a largo plazo. Además de APC. Bloquear otros pocillos de la placa del punto L con 200 microlitros por pocillo de RPMI completo Para evaluar el fenotipo de las células mediante citometría de flujo en paralelo con la placa de ensayo del punto L.

50 microlitros de células recién aisladas en una placa de 96 pocillos de fondo redondo debidamente etiquetada. Se trata de un ensayo auxiliar que se realiza junto con el ensayo de la mancha amarilla para determinar el fenotipo de las células que responden. Incubar placas durante 90 minutos a 39 grados centígrados en una incubadora de CO2 al 5%, permitiendo que las células presentadoras de antígenos se adhieran.

También incube 200 ml de RPMI completo para calentarlo durante este paso de incubación de 90 minutos. Coseche las células cultivadas a largo plazo de la placa de 24 pocillos. Combinando los duplicados cuádruples de cada animal en un solo tubo cónico de 15 milésimas de pulgada.

Centrifugar los tubos durante cinco minutos a 400 Gs. Deseche el sobrenadante por inversión del tubo, desaloje el pellet de celda y agregue cinco ml de PBS, resuspenda suavemente el pellet si es necesario. Lave las células dos veces y luego ajuste la concentración de células a 200.000 células por ml. Después de la incubación de 90 minutos, saque la placa LPO y el RPMI completo de la incubadora.

Coloque la placa LPO en un agitador de placas durante 30 segundos. A continuación, retire las células de no adherencia mediante pipeta de inversión de placa de 150 microlitros por pocillo de RPMI completo caliente. Agite el plato y deseche el líquido de lavado.

Repita tres veces, deseche la mayor cantidad de líquido posible y agregue cien microlitros por pocillo de cada antígeno en los pocillos apropiados que contengan APC adherentes. A continuación, pipetee 100 microlitros por pocillo de suspensión celular cultivada a largo plazo. 200.000 células por ML en los pocillos etiquetados como células de larga duración más APC.

Asegúrese de que las células a largo plazo agregadas en este paso sean del mismo animal que las APC que ya están en el pozo. No mezcle APC y células cultivadas a largo plazo de diferentes animales. Además, pipetee 100 microlitros por pocillo de suspensión celular cultivada a largo plazo a una concentración de 200.000 células por ml en pocillos sin APC para evaluar las respuestas a largo plazo.

En ausencia de presentación de antígenos, se deben añadir 100 microlitros por pocillo de células a corto plazo, además de células recién aisladas y ajustadas a 2 millones de células por ML para la evaluación de la respuesta ex vivo. Si realiza un análisis de citometría de flujo, lave la placa de pocillos de fondo redondo 96 y agregue las células y antígenos recién aislados a largo plazo a los pocillos siguiendo los mismos procedimientos. Empleado para placas IFN Gamma LPO Incubar placas durante la noche a 39 grados Celsius en una incubadora de CO2 al 5%.

Asegúrese de que los platos queden planos y no apile los platos el día 14. Deseche los líquidos de los pocillos y lave las placas seis veces con 300 microlitros por pocillo de PBS que contenga pregeneración colocándolos en el agitador de placas cada vez durante 10 segundos antes y entre lavados. A continuación, lavar una vez con el mismo volumen de agua destilada y seis veces más con PBS que contenga tween.

Por último, lavar las celdas dos veces con 300 microlitros por pocillo de PBS. Retire el líquido de lavado golpeando la placa sobre toallas de papel o almohadillas absorbentes. Añadir 100 microlitros por pocillo de anticuerpo de detección a cinco microgramos por ml diluido en PBS con albúmina sérica bovina al 1%.

Incubar las placas durante 120 minutos a 39 grados centígrados. Durante este paso de incubación, prepare la solución de fosfatasa alcalina a partir del estándar del kit VTA STAIN A BC AP siguiendo las instrucciones del fabricante 30 minutos antes de su uso o 90 minutos después de la adición del anticuerpo de detección a los pocillos. Diluya el reactivo en PBS que contenga interpolación después de 120 minutos de incubación, deseche el anticuerpo de detección mediante placas de lavado de inversión de placa seis veces con 300 microlitros por pocillo de PBS que contenga interpolación.

Retire el líquido de lavado golpeando el plato con toallas de papel. A continuación, añada 100 microlitros por pocillo de solución de fosfatasa alcalina. Incubar las placas durante 45 minutos a temperatura ambiente.

Deseche el líquido y lave cada plato seis veces con PBS Containing tween. Prepare la solución de sustrato a partir del kit de sustrato vector blue AP tres siguiendo las instrucciones del fabricante. Diluir los reactivos en tampón HCL tris 0,1 molar a pH 8,2.

Pipetear 50 microlitros de sustrato D.Cada pocillo incubar a temperatura ambiente hasta que el color azul comience a desarrollarse aproximadamente 30 minutos. Deseche el líquido y lave las placas con grandes cantidades de agua destilada. Retire la placa inferior para exponer la membrana de lavado de los pocillos y deje que la placa se seque al aire.

Mida la respuesta con un analizador de imágenes inmunopuntual o mantenga las placas en la oscuridad a temperatura ambiente hasta que se mida la respuesta. Debido a la alta estabilidad del sustrato de reacción, la calidad del sustrato se conserva durante varios años. Si se evalúa el fenotipo y la respuesta de las citocinas por citometría de flujo, se deben realizar procedimientos de tinción estándar de las células plateadas en el fondo redondo 96, se muestran las respuestas de la placa TCM representativa del pocillo en presencia o ausencia de APCs, se muestran las respuestas puntuales de IFN gamma L ex vivo tripuladas de animales infectados y animales no infectados.

Las respuestas específicas a m bovis se evalúan mediante estimulación antigénica PBDB o ESAT six, CFP 10. Las manchas en la parte inferior de las placas son el producto coloreado del ensayo de manchas amarillas. Cada mancha suele representar una célula productora de citocinas individual, lo que proporciona una medida cuantitativa de las células T productoras de IFN gamma con células de animales infectados.

Las respuestas puntuales a largo plazo de IFN gamma L presentadas como células formadoras de manchas o SFC se visualizan claramente, la producción de IFN gamma en respuesta a la estimulación de antígenos se observa con células de ganado no infectado y con células no estimuladas de ganado infectado o no infectado. Debería producirse una respuesta robusta de las células T en respuesta al mitógeno de la marihuana, como se ha demostrado en la MTC y las respuestas ex vivo a PPDB y ESAT seis. Se detectó CCFP 10 en todos los animales infectados con 3M bovis y se detectaron respuestas mínimas o nulas de MTC y ex vivo en el animal de control.

Se requería la presencia de APC para que los animales infectados respondieran de manera óptima a la MTC, como lo demuestran las respuestas muy reducidas de las células cultivadas a largo plazo. En ausencia de APCs autólogas, se presentaron células formadoras de manchas de animales em, bovis infectados y no infectados. El número de SFC de cada animal se calculó mediante un número promedio de SFC de 10 a la sexta celda en muestras duplicadas en respuesta a PPDB menos la respuesta respectiva solo a los medios, las respuestas difirieron según el estado de infección, la presencia o ausencia de APC y la duración del cultivo, es decir, el cultivo a largo plazo frente al cultivo ex vivo.