La detección in situ de las bacterias dentro de los tejidos embebidos en parafina utilizando un ADN sonda digoxina marcada focalización 16S rRNA

El objetivo general de este procedimiento es localizar bacterias dentro de los tejidos incluidos en parafina utilizando sondas de ADN ribosómicas 16 s marcadas con DIG. Esto se logra preparando primero la sonda con amplificación por PCR y marcaje DIG. El segundo paso es preparar las secciones de tejido para que tengan sitios objetivo más accesibles y menos unión de fondo.

A continuación, las secciones de tejido preparadas se hibridan con la sonda marcada con excavación. Finalmente, la sonda hibridada se detecta con fosfatasa alcalina, marcada como anticuerpos anti-D dig. En última instancia, este método de hibridación en C dos puede mostrar la presencia de bacterias con tejidos embrides en parafina.

La ventaja de dominio de esta detección sobre el método existente como ING es que este método puede detectar bacterias SHS dentro del contexto de algunas estructuras histológicas. Este método puede proporcionar información sobre la patogenia, pero será varios inflamatorios como la periodontitis y el planeta R. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de preparación del tejido y digestión híbrida son difíciles de ejecutar porque las secciones de tejido se dañan fácilmente.

Para hacer que la sonda de bacterias U use un par de 70 bases, un fragmento de ADN como molde y dos cebadores de 15 pares de bases para amplificar la sonda por PCR. Recoja el amplicón en el tampón a una concentración conocida. A continuación, etiquete la sonda con un kit de detección y etiquetado de ADN de excavación.

Primero mezcle tres microgramos de la sonda en 15 microlitros de agua. Desnaturalice la sonda en el bloque de calor durante 10 minutos a 95 grados centígrados. A continuación, coloque la sonda desnaturalizada en hielo.

A continuación, agregue dos microlitros de 10 nucleótidos XH, dos microlitros de DN NTP y un microlitro de enzima canal. Una vez mezclada, deje que la sonda se incube a 37 grados centígrados durante 24 a 48 horas después. Detenga la reacción calentando la mezcla a 65 grados centígrados.

A continuación, mida la concentración de ADN de la sonda marcada a 260 nanómetros y ajuste una concentración a 100 nanogramos por microlitro. Con el kit, verifique primero la sensibilidad de las sondas en una membrana de nailon, cargue un microlitro de control positivo diluido en serie. Sonda y sonda etiquetada de excavación.

Deje que la membrana se seque durante cinco minutos. Una vez seca, sumerja brevemente la membrana en dos XSSC y luego transfiérala a una incubadora a 80 grados centígrados durante una hora. Para inmovilizar el ADN después de la incubación, remoje brevemente la membrana en tampón de ácido maleico, luego transfiéralo a un tampón de bloqueo concentrado con anticuerpos conjugados AP en una dilución de 1 a 5.000 después de media hora.

Lave la membrana en MABT. A continuación, mezcle 40 microlitros de N-B-T-B-C-I-P en dos mililitros de tampón de detección. Y después del baño, agregue esta mezcla a la membrana durante un minuto.

Después de retirar la parafina y rehidratar las secciones de tejido como se describe en el protocolo de texto, prepárelas para la hibridación en C dos, sumerja primero los portaobjetos en ácido clorhídrico normal 0,1 durante 20 minutos. Después del baño de ácido, lave los portaobjetos con agua tratada con DEPC durante 30 segundos. Luego, con un bolígrafo de cera, delinee los especímenes en cada diapositiva.

A continuación, agregue de 50 a 400 microlitros de solución de proteinasa K a las muestras, dependiendo de su tamaño. Deje que la enzima actúe durante 30 minutos a 37 grados centígrados y luego lave los portaobjetos en un XPBS tratado con DEPC durante un minuto. Ahora transfiera los portaobjetos a un 4% de aldehído paraformado en PBS tratado con DEPC durante 10 minutos.

Lave el fijador con PBS como antes. A continuación, bañe los portaobjetos en clorhidrato de trietanolamina 0,1 molar a pH ocho con 0,5% de acético e hidruro después de 20 minutos, lave los portaobjetos con agua limpia como antes. Ahora comience el en C dos sumergiendo primero las diapositivas en dos XSSC durante 20 minutos.

Mientras tanto, diluya la sonda marcada a un nanogramo por microlitro en tampón de hibridación para un control negativo. Utilice 10 veces la concentración de la sonda no marcada. A continuación, desnaturalice las sondas calentándolas a 90 grados centígrados durante 10 minutos, seguido de un enfriamiento rápido en hielo.

A continuación, aplique el mismo volumen de dilución de sonda a cada portaobjetos que la proteinasa K que se había aplicado anteriormente. Luego, cubra con cuidado las secciones deslizantes y selle con esmalte de uñas. Ahora, caliente los portaobjetos en un bloque de máquina de PCR a 90 grados centígrados durante 10 minutos y transfiéralos a una incubadora humidificada a 45 grados centígrados durante la noche del día siguiente.

Enfríe los portaobjetos a cuatro grados centígrados durante media hora y luego retire con cuidado los cubreobjetos. Los tejidos son frágiles. Por último, pase los portaobjetos a través de una serie de tampones SSC a temperatura ambiente.

En primer lugar, lavar los dos portaobjetos NC hibridados durante cinco minutos en MABT. A continuación, aplique de 50 a 400 microlitros de solución bloqueante en 1%tween 20 durante 20 minutos. Después de la incubación en bloque, aplique de 50 a 400 microlitros de uno a 1000 anticuerpo de fosfatasa alcalina anti-D dig y solución de bloqueo.

Déjalo unir durante 90 minutos a 37 grados centígrados después de que se haya aplicado el primario. Lave los portaobjetos en MABT durante 10 minutos. A continuación, durante cinco minutos, coloque las diapositivas en el búfer de detección con 1%tween 20.

Ahora aplique de 50 a 400 microlitros de un milímetro de ole en solución tampón de detección a cada portaobjetos e incube durante cinco minutos para inactivar la fosfatasa alcalina endógena. A continuación, agregue de 50 a 400 microlitros de N-B-T-B-C-I-P diluido en la detección. Coloque un tamponamiento de uno a 100 en cada portaobjetos, y deje que los portaobjetos se incuben durante dos o tres horas en una cámara humidificada según la experiencia.

Enjuague los portaobjetos con agua desionizada, luego aplique verde de metilo al 0,05% de peso por volumen y deje que la contramancha actúe en el tejido durante 10 minutos. A 37 grados centígrados. Vuelva a lavar los portaobjetos con agua desionizada y luego deshidratarlos con etanol al 100%, seguido de un baño en xileno.

Finalmente, aplique 80 microlitros de medios de montaje y cubreobjetos. Los portaobjetos después de las sondas fueron etiquetados con excavación. Su sensibilidad se comparó con la dilución de la sonda de control positivo.

La sonda específica p gingivalis de 4 43 pares de bases fue 25 veces más sensible que la sonda de bacterias de 70 pares de bases diseñada. A continuación, las dos sondas se aplicaron a los tejidos gingivales de pacientes con periodontitis crónica a gran aumento. Las diversas formas de bacterias fueron discernibles usando la sonda de bacterias.

Mientras que la sonda específica de p gingivalis solo detectó bacterias en forma de bastoncillo, se aplicó un DSS químico que interrumpe la unión estrecha en la mucosa gingival de ratones. Se utilizaron muestras de tejido de estos ratones para comparar las sondas en un contexto diferente. En este caso, la sonda bacteriana U fue capaz de detectar las bacterias que la otra no pudo.

A continuación, se probó la capacidad de la sonda de bacterias U para detectar otras bacterias en secciones de tejido pulmonar que contenían tumores. Se detectaron bacterias tanto fuera como dentro del tumor. Al examinar tejidos de pacientes con liquen plano oral, una enfermedad de etiología desconocida, la sonda bacteriana detectó señales bacterianas dentro de las células del epitelio y la lámina propia, donde se observó infiltración inflamatoria.

Desde su desarrollo, esta técnica ha ayudado al investigador en el campo de las enfermedades infecciosas a explorar la invasión de bacterias en tejidos tanto en humanos como en animales siguiendo este procedimiento. Otros métodos, como la detección inmunoquímica, el crecimiento a marcador celular pueden ser ED para responder preguntas adicionales como qué tipo de células albergan las bacterias dentro de los tejidos.