Name: La detección in situ de las bacterias dentro de los tejidos embebidos en parafina utilizando un ADN sonda digoxina marcada focalización 16S rRNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Aprende a detectar bacterias en tejidos embebidos en parafina utilizando sondas de ADN marcadas con digoxigenina dirigidas al rRNA 16S. Este método de hibridación in situ permite visualizar la presencia bacteriana en el contexto de estructuras histológicas preservadas.

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Este estudio fue apoyado por una beca (2013R1A1A3005669) de la Fundación Nacional de Investigación de Corea y una subvención (HI13C0016) de la coreana Salud Tecnología Proyecto I + D del Ministerio de Salud y Bienestar Social.

1. Preparación de la sonda <ol><li> La amplificación por PCR de la sonda <ol><li> Para el P. sonda gingivalis específico de, amplificar un fragmento de ADN de 343 pb de P. gingivalis 16S rRNA mediante PCR utilizando el ADN genómico de P. gingivalis y los siguientes cebadores: 5&#39;-TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3 &#39;y 5&#39; ACTUAR CGT ATC GCC CGT TAT TC-3 &#39;10. Realizar amplificaciones con las siguientes condiciones de ciclo: 35 ciclos a 95 ° C durante 30 seg, 60 ° C durante 30 seg, y 72 ° C durante 1 min 20 seg seguido por una extensión de 5 min a 72 ° C 10,11. </li><li> Amplificar la eubacteriana usando un 70-bp fragmento de ADN (5&#39;-CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAG TCCCGCAACGAGCGCAACCC-3 &#39;) sintetizado como un oligonucleótido y los siguientes cebadores: 5&#39;-CTG CAG GTR CMT GGY-3&#39; y 5&#39;-AGG GTT GCG CTC GTT-3 &#39;11. Realizar amplificaciones con las siguientes condiciones de ciclo: 40 ciclos9 a 4 ° C durante 30 seg, 60 ° C durante 30 seg y 72 ° C durante 1 min 20 s, seguido de una extensión de 5 min a 72 ° C 11,12. </li><li> Precipitar los productos de PCR (≥500 mu l) mediante la adición de acetato de sodio 3 M (pH 5,2) y etanol 100% (a un 10: 1: 2 ratio) e incubando a -20 ° C durante 2 hr. </li><li> Centrifugar la mezcla a 14.000 xg durante 15 min, resuspender el precipitado en 100 l de tampón TE, y medir la concentración de ADN mediante densidad óptica a 260 nm. </li></ol></li><li> DIG etiquetado utilizando un kit de etiquetado y detección de ADN DIG <ol><li> Mezclar 3 g de la sonda con agua hasta un volumen final de 15 l. </li><li> Desnaturalizar el ADN a 95 ° C durante 10 minutos y enfriar rápidamente en hielo. </li><li> Añadir 2 l de 10x mezcla hexanucleotide, 2 l de mezcla de dNTP-etiquetado, y 1 l de enzima Klenow a 15 l de la DNA desnaturalizado. </li><li> Mezclar e incubar a 37 ° C durante 24 horas a 48 horas y detener la reacción por calentamiento a 65 ° C. </li></ol></li><li> Compruebe la sensibilidad de la sonda DIG-etiquetados utilizando un kit de etiquetado y detección de ADN DIG <ol><li> Cargar manualmente 1 l de diluciones seriadas de la sonda de control positivo en el kit y 1 ng de la sonda marcada con DIG en la membrana de nylon y seco durante 5 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Brevemente empapar la membrana en tampón 2x ​​SSC (NaCl 0,3 M, citrato de sodio 30 mM, pH 7,0) y se incuba la membrana a 80 ° C durante 1 hora para inmovilizar el ADN. </li><li> Brevemente empapar la membrana en tampón de ácido maleico (MAB, 0,1 M de ácido maleico, NaCl 0,15 M, pH 7,5) y se incuba con anti-DIG fosfatasa alcalina (AP) conjugada con anticuerpo diluido (1: 5000) en 6 ml de solución de bloqueo proporcionado en el kit a TA durante 30 min. </li><li> Se lava la membrana con MABT (MAB que contiene 1% de Tween 20) y aplicar 40 l de la solución de NBT / BCIP mezclado con 2 ml de tampón de detección (0,1 M Tris-HCl, NaCl 0,1 M, 0,05 M MgCl 2, pH 9,5) en el membrana durante 1 min. Si la sensibilidad de la sonda marcada esno satisfactoria, repita los pasos de 1.1.3 a 1.3.4. </li><li> Medir la concentración de ADN de la sonda marcada (OD260) y ajustar la concentración a 100 ng l -1. </li></ol></li><li> Compruebe la especificidad de la sonda marcada con DIG <ol><li> Desnaturalizar muestras de ADN genómico (25 ng de 3 l -1 por cada muestra) a partir de diversas especies bacterianas, incluyendo la bacteria blanco de la sonda específica, a 95 ° C durante 10 min y enfriar rápidamente en hielo. </li><li> Cargar manualmente el ADN desnaturalizado en la membrana de nylon y seco durante 20 min a TA. </li><li> Brevemente empapar la membrana en tampón 2x ​​SSC y se incuba la membrana a 80 ° C durante 2 horas para inmovilizar el ADN. </li><li> Bloquear la membrana con una solución de bloqueo a TA durante 1 hr. </li><li> Diluir la sonda a 1 ng l -1 en tampón de hibridación, desnaturalizar las sondas diluidas, y aplicar sobre la membrana. </li><li> Incubar la membrana a 45 ° C durante 1 hr. </li><li> Lavar la membrana de tresveces con tampón SSC 2x. </li><li> Brevemente remojo la membrana en el MAB. </li><li> Incubar con el anticuerpo anti-DIG AP-conjugado diluido (1: 2000) en 6 ml de solución de bloqueo a TA durante 1 hr. </li><li> Se lava la membrana con MABT y aplicar 40 l de la solución de NBT / BCIP mezclado con 2 ml de tampón de detección. </li><li> Cuando la sonda no logra la especificidad esperada, aumentar la temperatura de hibridación hasta que se observa la especificidad. </li></ol></li></ol> 2. Hibridación in situ Nota: Para evitar el secado de las muestras y reactivos, realice todas las incubaciones en una cámara húmeda llena de toallas de papel húmedas. <ol><li> De-paraffinization y la rehidratación de secciones de tejido <ol><li> Preparar 4 micras secciones de tejidos gruesos de los bloques incluidos en parafina. Formalina, paraformaldehído y fijador a base de zinc son compatibles con este protocolo. </li><li> Preparar todos los reactivos con agua tratada con DEPC. </li><li> Diapositivas de calor en un horno seco a 60 ° C durante 30 min y Incubar los portaobjetos a TA durante 30 min. </li><li> Sumergir los portaobjetos en 100% xileno durante 5 minutos tres veces; utilizar xileno nuevo cada vez. Nota: Realice este procedimiento de-encerado en una campana de extracción química. </li><li> Sumergir los portaobjetos en etanol al 100% durante 5 min dos veces, el uso de etanol fresco cada vez, y rehidratar especímenes en serie 90%, 80% y 70% de soluciones de etanol durante 5 min cada uno. </li><li> Sumergir los portaobjetos en agua tratada con DEPC por 1 min y lavar los portaobjetos en PBS tratada con DEPC (pH 7,4) durante 6 min. </li></ol></li><li> Pretratamientos de secciones de tejido <ol><li> Sumergir los portaobjetos en ácido clorhídrico 0,1 N durante 20 minutos y lavar los portaobjetos en agua tratada con DEPC durante 30 segundos. </li><li> Dibuja una barrera hidrofóbica rodea especímenes utilizando un lápiz de cera. Nota: El tamaño de la barrera hidrofóbica depende del tamaño de las muestras. Por lo tanto, los volúmenes de reactivos utilizados en los siguientes pasos varían dependiendo del tamaño de las muestras, pero tienen que llenar el HYbarrera drophobic (50 l para los pequeños especímenes y 400 l de grandes ejemplares). </li><li> Tratar especímenes con 50 a 400 l de proteinasa K (1 a 10 mg ml -1 en PBS tratada con DEPC) en un horno seco a 37 ° C durante 30 min y lavar los portaobjetos en PBS tratada con DEPC 1x durante 1 min. </li><li> Remojar los portaobjetos en 4% de paraformaldehído en PBS tratada con DEPC durante 10 min, a continuación, lavar los portaobjetos en PBS tratada con DEPC por 1 min. </li><li> Remojar las diapositivas en 0,1 M de trietanolamina-HCl (pH 8,0) que contenía anhídrido acético 0,5% durante 20 min y lavar los portaobjetos en agua tratada con DEPC para 30 seg. </li></ol></li><li> La hibridación con la sonda y el lavado <ol><li> Sumergir los portaobjetos en tampón SSC 2x durante 20 min. </li><li> Diluir la sonda a 1 ng l -1 en tampón de hibridación (4x SSC, 50% [vol / vol] formamida, 1X solución de Denhardt, 10% [p / v] sulfato de dextrano, 0,1% [peso / vol] de dodecil sulfato de sodio, 0,4 mg ml -1 de ADN de esperma de salmón). Para los controles negativos, mezclar la sonda marcada conuna cantidad en exceso de 10 veces de sonda no marcada. </li><li> Desnaturalizar las sondas diluidas y aplicar 50 a 400 l en secciones de tejido. Coloque una hoja de la cubierta de la diapositiva y sellar con esmalte de uñas. </li><li> Diapositivas de calor en la máquina PCR a 90 ° C durante 10 minutos e incubar los portaobjetos en una cámara húmeda O / N a 45 ° C o temperatura óptima determinada en el paso 1.4.11. </li><li> Enfriar las diapositivas a 4 ° C durante 30 minutos, retire cubreobjetos, y sumergir los portaobjetos en un tampón SSC serie como followings: 4x SSC durante 10 minutos, precalentado (45 ° C) 2x SSC durante 20 minutos, 2x SSC durante 10 min, y 0,2x SSC durante 10 min. </li></ol></li><li> Detección con anticuerpo anti-DIG conjugado AP- <ol><li> Lave las diapositivas en MABT durante 5 min. </li><li> Bloque con 50 a 400 l de solución de bloqueo con 1% de Tween 20 durante 20 min. </li><li> Añadir 50 a 400 l de anticuerpo anti-DIG-AP diluidos en solución de bloqueo (1: 1000) anld incubar a 37 ° C durante 90 min. </li><li> Lave las diapositivas en MABT durante 10 min. </li> &lt;li&gt; Sumergir los portaobjetos en tampón de detección que contiene 1% de Tween 20 durante 5 min. </li><li> Tratar con 50 a 400 μ de levamisol 1 mM (en tampón de detección que contiene 1% de Tween 20) durante 5 min para inactivar la fosfatasa alcalina endógena. </li><li> Distribuir 50 a 400 l de la solución premezclada NBT / BCIP (diluido en tampón de detección a 1: 100) en cada muestra e incubar los portaobjetos en una cámara humidificada a temperatura ambiente durante 2 a 3 horas hasta que la señal desarrollado es satisfactoria. </li><li> Enjuagar portaobjetos con agua desionizada para detener la visualización y aplicar 50 a 400 l de 0,05% [peso / vol] verde de metilo como una mancha contador a 37 ° C durante 10 min. </li><li> Enjuague diapositivas con agua desionizada, se deshidratan en etanol al 100%, y sumergirse en xileno. </li><li> Aplique 80 l de solución de montaje en cada diapositiva y cubrir con cubreobjetos. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Takarada, H., Cattoni, M., Sugimoto, A., Rose, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+studies+of+human+gingiva.+II.+The+lower+part+of+the+pocket+epithelium+in+chronic+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural studies of human gingiva. II. The lower part of the pocket epithelium in chronic periodontitis.</a> J. Periodontol. 45 (3), 155-169 (1974).</li>
<li>Allenspach-Petrzilka, G. E., Guggenheim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+invasion+of+the+periodontium%3B+an+important+factor+in+the+pathogenesis+of+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Bacterial invasion of the periodontium; an important factor in the pathogenesis of periodontitis.</a> J. Clin. Periodontol. 10 (6), 609-617 (1983).</li>
<li>Saglie, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+bacteria+in+the+oral+epithelium+in+periodontal+disease.+II.+Immunohistochemical+identification+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">The presence of bacteria in the oral epithelium in periodontal disease. II. Immunohistochemical identification of bacteria.</a> J. Periodontol. 57 (8), 492-500 (1986).</li>
<li>Christersson, L. A., Albini, B., Zambon, J. J., Wikesjö, U. M., Genco, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+localization+of+Actinobacillus+actinomycetemcomitans.+in+human+periodontitis.+I.+Light%2C+immunofluorescence+and+electron+microscopic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Tissue localization of Actinobacillus actinomycetemcomitans. in human periodontitis. I. Light, immunofluorescence and electron microscopic studies.</a> J. Periodontol. 58 (8), 529-539 (1987).</li>
<li>Saglie, F. R., Pertuiset, J., Rezende, M. T., Nestor, M., Marfany, A., Cheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ.+correlative+immuno-identification+of+mononuclear+infiltrates+and+invasive+bacteria+in+diseased+gingiva%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">In situ. correlative immuno-identification of mononuclear infiltrates and invasive bacteria in diseased gingiva.</a> J. Periodontol. 59 (10), 688-696 (1988).</li>
<li>Rautemaa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+localization+of+Porphyromonas+gingivalis.+thiol+proteinase+in+periodontal+tissues+of+chronic+periodontitis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Dis%22%5BJournal%5D)">Intracellular localization of Porphyromonas gingivalis. thiol proteinase in periodontal tissues of chronic periodontitis patients.</a> Oral Dis. 10 (5), 298-305 (2004).</li>
<li>Marttila, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+localization+of+Treponema+denticola.+chymotrypsin-like+proteinase+in+chronic+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Oral+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular localization of Treponema denticola. chymotrypsin-like proteinase in chronic periodontitis.</a> J. Oral Microbiol. 6, (2014).</li>
<li>Colombo, A. V., da Silva, C. M., Haffajee, A., Colombo, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+intracellular+oral+species+within+human+crevicular+epithelial+cells+from+subjects+with+chronic+periodontitis+by+fluorescence+in+situ.+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontal+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of intracellular oral species within human crevicular epithelial cells from subjects with chronic periodontitis by fluorescence in situ. hybridization.</a> J. Periodontal Res. 42 (3), 236-243 (2007).</li>
<li>Abrams, K., Caton, J., Polson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histologic+comparisons+of+interproximal+gingival+tissues+related+to+the+presence+or+absence+of+bleeding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Histologic comparisons of interproximal gingival tissues related to the presence or absence of bleeding.</a> J. Periodontol. 55 (11), 629-632 (1984).</li>
<li>Kim, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+Porphyromonas+gingivalis.+and+plasma+cell+dominance+in+gingival+tissues+with+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Dis%22%5BJournal%5D)">Presence of Porphyromonas gingivalis. and plasma cell dominance in gingival tissues with periodontitis.</a> Oral Dis. 16 (4), 375-381 (2010).</li>
<li>Choi, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porphyromonas+gingivalis.+and+dextran+sodium+sulfate+induce+periodontitis+through+the+disruption+of+physical+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Porphyromonas gingivalis. and dextran sodium sulfate induce periodontitis through the disruption of physical barriers.</a> Eur. J. Inflammation. 10, 419-431 (2013).</li>
<li>Choi, Y. S., Kim, Y. C., Ji, S., Choi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+bacterial+invasion+and+differential+expression+of+tight+junction+proteins%2C+growth+factors%2C+and+growth+factor+receptors+in+periodontal+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Increased bacterial invasion and differential expression of tight junction proteins, growth factors, and growth factor receptors in periodontal lesions.</a> J. Periodontol. 85 (8), e313-e322 (2014).</li>
<li>Baker, G. C., Smith, J. J., Cowan, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+and+re-analysis+of+domain-specific+16S+primers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Review and re-analysis of domain-specific 16S primers.</a> J. Microbiol. Methods. 55 (3), 541-555 (2003).</li>
<li>Hajishengallis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Low-abundance+biofilm+species+orchestrates+inflammatory+periodontal+disease+through+the+commensal+microbiota+and+the+complement%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">A Low-abundance biofilm species orchestrates inflammatory periodontal disease through the commensal microbiota and the complement.</a> Cell Host Microbe. 10 (5), 497-506 (2011).</li>
<li>Axon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+cancer+and+Helicobacter+pylori%5BTitle%5D)+AND+%22Aliment.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Gastric cancer and Helicobacter pylori.</a> Aliment. Pharmacol. Ther. 16 (suppl. 4), 83-88 (2002).</li>
<li>Fenhalls, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ.+detection+of+Mycobacterium+tuberculosis+transcripts+in+human+lung+granulomas+reveals+differential+gene+expression+in+necrotic+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">In situ. detection of Mycobacterium tuberculosis transcripts in human lung granulomas reveals differential gene expression in necrotic lesions.</a> Infect. Immun. 70 (11), 6330-6338 (2002).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí un protocolo para localizar las bacterias dentro de los tejidos embebidos en parafina utilizando una sonda de ADN marcada con DIG que se ha descrito. La sonda se dirige a las moléculas de ADN o ARN de origen bacteriano gen 16S rRNA, y las sondas de ARNr 16S-direccionamiento puede ser diseñado como cualquiera de las especies-específico o universal. La hibridación específica de la P. sonda específico de gingivalis a P. gingivalis pero no a otras bacterias orales se ha demostrado previamente...

Las bacterias desempeñan un papel en la etiología de diversas enfermedades orales tales como periodontitis, pulpitis, pericoronitis, celulitis, y osteomielitis. Con el fin de comprender el papel de las bacterias en la patogénesis de la enfermedad y para controlar el efecto de los tratamientos, la localización de las bacterias dentro del tejido es importante. La presencia de bacterias en el tejido gingival de pacientes con periodontitis se ha demostrado usando varios métodos, incluyendo microscopía electrónica de 1,2, inmunohistoquímica e inmunofluorescencia utilizando anticuerpos específicos de bacterias 3-7, y la hibridación fluorescente in situ (FISH) usando un 8 por fluorescencia sonda de oligonucleótido marcada orientación 16S rRNA. Sin embargo, estos métodos no son ampliamente utilizados debido a la limitación técnica o dificultades. En comparación con anticuerpos, sondas dirigidas a 16S rRNA son fáciles de producir y lograr especificidad de especie. FISH ha demostrado ser una excelente herramienta para la visualización de bacteria en sus entornos naturales como el biofilm de la placa. Sin embargo, la aplicación de FISH a las muestras de tejido es limitado debido a la autofluorescencia de los diversos componentes del tejido. Por ejemplo, el fuerte autofluorescencia de las células rojas de la sangre a menudo dificulta la aplicación de la tecnología de fluorescencia para los tejidos inflamados cuando implican sangrado 9. Con el fin de localizar las bacterias dentro de los tejidos gingivales inflamados, por lo tanto, un método de hibridación in situ utilizando un digoxigenina (DIG) sonda de ADN marcada con se ha desarrollado y aplicado con éxito 10,11. Aquí un protocolo detallado para la localización de las bacterias dentro de los tejidos incluidos en parafina utilizando P. gingivalis sondas específicos de eubacterial y universales se ha descrito. Se centra sobre todo en la estandarización del método de manera que resultados similares se pueden reproducir en otros laboratorios. Este protocolo permite la localización de las bacterias dentro de su contexto histológico y el results son altamente reproducible. El protocolo descrito se puede utilizar para localizar las bacterias ya sea de una manera específica de la especie o universal en varios tejidos. La sonda universal es especialmente útil para detectar bacterias en enfermedades polimicrobianas y para estudiar un posible papel de las bacterias en enfermedades en las que no se conoce el papel de las bacterias específicas.

<table><tbody><tr><td>Anhídrido acético</td><td>Sigma</td><td>6404</td><td></td></tr><tr><td>50% solución de sulfato de dextrano</td><td>Millipore</td><td>S4030</td><td></td></tr><tr><td>50X Denhardt' s solución</td><td>Sigma</td><td>D2532</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma</td><td>P159220</td><td></td></tr><tr><td>DIG Kit de detección y etiquetado de ADN</td><td>Roche</td><td>11 093 657 910</td><td></td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge&trade; Bolígrafo</td><td>Dako</td><td>H-400</td><td></td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>Vector</td><td>SP-5000</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Sigma</td><td>246964</td><td></td></tr><tr><td>Ácido maleico</td><td>Sigma</td><td>M0375</td><td></td></tr><tr><td>Verde de metilo</td><td>Sigma</td><td>M6776</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma</td><td>P1648</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Solución de ADN de esperma de salmón</td><td>Invitrogen</td><td>#15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sodio</td><td>Duksan</td><td>D1420</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio</td><td>Amresco</td><td>227</td><td></td></tr><tr><td>Trietanolamina-HCl</td><td>Sigma</td><td>90279</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Research organics</td><td>3098T</td><td></td></tr></tbody></table>

la detección in situ de las bacterias dentro de los tejidos embebidos en parafina utilizando un adn sonda digoxina marcada focalización 16s rrna

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

La presencia de bacterias dentro del epitelio de bolsa y el tejido conectivo subyacente en biopsias gingivales de pacientes con periodontitis se ha reportado utilizando varios métodos, incluyendo microscopía electrónica, inmunohistoquímica o inmunofluorescencia usando anticuerpos específicos de bacterias, e hibridación fluorescente in situ (FISH) usando una sonda de oligonucleótidos marcada con fluorescencia. Sin embargo, estos métodos no son ampliamente utilizados debido a limitaciones o dificultades técnicas. Aquí se ha introducido un método para localizar bacterias dentro de tejidos incluidos en parafina utilizando sondas de ADN marcadas con DIG. Los tejidos incluidos en parafina son la forma más común de tejidos de biopsia disponibles en los bancos de patología. Las bacterias pueden detectarse de forma específica de cada especie o de forma universal. Las señales bacterianas se detectan como formas discretas (coco, bastone, fusiforme y peluda) de bacterias o formas dispersas. La técnica permite obtener otra información histológica: se distinguen bien los epítelos, el tejido conectivo, los infiltrados inflamatorios y los vasos sanguíneos. Este método se puede utilizar para estudiar el papel de las bacterias en diversas enfermedades, como la periodontitis, los cánceres y las enfermedades inmunitarias inflamatorias.

La Figura 1 muestra dot blotting de sondas marcadas con DIG en comparación con la sonda de control positivo proporcionado en el kit para determinar su sensibilidad. El 343 pb P. sonda específico de gingivalis es 25 veces más sensible que la sonda eubacterial 70 pb. La Figura 2 muestra la hibridación in situ de los tejidos gingivales obtenidas de pacientes con periodontitis crónica para la detección de P. gingivalis y eubacterias. Las señales bacterian...

Aquí se ha descrito un método para localizar bacterias dentro de tejidos embebidos en parafina utilizando sondas de ADN dirigidas al ARNr 16S marcadas con DIG. Este protocolo se puede aplicar para estudiar el papel de las bacterias en diversas enfermedades como la periodontitis, los cánceres y las enfermedades inmunitarias inflamatorias.

La detección in situ de las bacterias dentro de los tejidos embebidos en parafina utilizando un ADN sonda digoxina marcada focalización 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

El objetivo general de este procedimiento es localizar bacterias dentro de tejidos incluidos en parafina mediante el uso de sondas de ADN marcadas con DIG que se dirigen al ARN ribosómico 16 s. Esto se logra primero mediante la preparación de la sonda mediante amplificación por PCR y marcado con DIG. El segundo paso consiste en preparar cortes de tejido para que tengan sitios diana más accesibles y menos unión de fondo.A continuación, las secciones de tejido preparadas se hibridan con la sonda marcada con dig. Por último, la sonda hibridada se detecta mediante anticuerpos anti-Dig marcados con fosfatasa alcalina. En definitiva, este método de hibridación in situ puede mostrar la presencia de bacterias en tejidos embebidos en parafina.La ventaja de este método frente a técnicas existentes como ING es que puede detectar bacterias SHS en el contexto de ciertas estructuras histológicas. Este método puede aportar información sobre la patogénesis, pero también sobre diversas afecciones inflamatorias como la periodontitis y el planeta R. La demostración visual de este procedimiento es fundamental, ya que los pasos de preparación del tejido y digestión por hibridación son difíciles de realizar porque las secciones de tejido se dañan fácilmente.Para elaborar la sonda para bacterias U, utilice un fragmento de ADN de 70 pares de bases como plantilla y dos cebadores de 15 pares de bases para amplificar la sonda mediante PCR. Recopile el amplicón en tampón a una concentración conocida. A continuación, marque la sonda con un kit de etiquetado y detección de ADN dig. Primero, mezcle tres microgramos de la sonda en 15 microlitros de agua. Desnaturalice la sonda en el bloque térmico durante 10 minutos a 95 grados Celsius. Luego, coloque la sonda desnaturalizada en hielo.A continuación, agregue dos microlitros de nucleótidos 10 XH, dos microlitros de DN NTPs y un microlitro de enzima canal. Una vez mezclado, deje que la sonda incube a 37 grados Celsius durante 24 a 48 horas. Detenga la reacción calentando la mezcla a 65 grados Celsius.Luego mida la concentración de ADN de la sonda marcada a 260 nanómetros y ajuste la concentración a 100 nanogramos por microlitro. Utilizando el kit, verifique primero la sensibilidad de la sonda en una membrana de nailon cargando un microlitro de control positivo diluido en serie. Sonda y sonda marcada con dig.Deje secar la membrana durante cinco minutos. Una vez seca, sumerja brevemente la membrana en dos XSSC y luego transfiérala a una incubadora a 80 grados Celsius durante una hora. Para inmovilizar el ADN después de la incubación, remoje brevemente la membrana en tampón de ácido málico, luego transfiérala al tampón de bloqueo concentrado con anticuerpos conjugados con fosfatasa alcalina en una dilución de uno a 5.000 después de media hora.Lave la membrana con MABT. Luego mezcle 40 microlitros de N-B-T-B-C-I-P en dos mililitros de tampón de detección. Y tras el baño, añada esta mezcla a la membrana durante un minuto.Después de eliminar la parafina y rehidratar los cortes de tejido según se describe en el protocolo escrito, prepárelos para la hibridación in situ sumergiendo primero los portaobjetos en ácido clorhídrico 0,1 N durante 20 minutos. Tras el baño ácido, lave los portaobjetos con agua tratada con DEPC durante 30 segundos. A continuación, utilice un rotulador de cera para delimitar los especímenes en cada portaobjeto.A continuación, agregue de 50 a 400 microlitros de solución de proteinasa K a las muestras, según su tamaño. Deje actuar la enzima durante 30 minutos a 37 grados Celsius y luego lave las laminillas en PBS 1X tratado con DEPC durante un minuto. Ahora transfiera las laminillas a paraformaldehído al 4 % en PBS tratado con DEPC durante 10 minutos.Lave el fijador con PBS como antes. A continuación, sumerja los portaobjetos en clorhidrato de trietanolamina 0,1 molar a pH ocho con ácido acético e hidruro al 0,5 % durante 20 minutos, luego lave los portaobjetos con agua limpia como antes. Ahora comience la hibridación in situ en C dos sumergiendo primero los portaobjetos en dos XSSC durante 20 minutos.Mientras tanto, diluya la sonda marcada a un nanogramo por microlitro en tampón de hibridación para un control negativo. Utilice 10 veces la concentración de sonda no marcada. Luego desnature las sondas calentándolas a 90 grados Celsius durante 10 minutos, seguido de un enfriamiento rápido en hielo.A continuación, aplique el mismo volumen de dilución de sonda a cada portaobjetos que el utilizado previamente para la proteinasa K. Luego, cubra cuidadosamente con una cubierta y selle las secciones utilizando esmalte de uñas. Ahora, caliente los portaobjetos en el bloque de una máquina de PCR a 90 grados Celsius durante 10 minutos y transfiéralos al día siguiente a un incubador húmedo a 45 grados Celsius durante la noche.Enfríe las laminillas a cuatro grados Celsius durante media hora y luego retire cuidadosamente las cubreobjetos. Los tejidos son frágiles. Por último, pase las laminillas a través de una serie de tampón SSC a temperatura ambiente.Primero, lave las dos láminas hibridadas de NC durante cinco minutos en MABT. Luego, aplique de 50 a 400 microlitros de solución bloqueante en tween 20 al 1 % durante 20 minutos. Después de la incubación con la solución bloqueante, aplique de 50 a 400 microlitros de anticuerpo anti-D dig fosfatasa alcalina en una dilución de uno a 1000 en solución bloqueante.Deje que se una durante 90 minutos a 37 grados Celsius después de aplicar el anticuerpo primario. Lave las laminillas en MABT durante 10 minutos. Luego, coloque las laminillas en tampón de detección con 1% de tween 20 durante cinco minutos.Ahora, aplique de 50 a 400 microlitros de oleína unimolar en solución tampón de detección sobre cada portaobjetos e incube durante cinco minutos para inactivar la fosfatasa alcalina endógena. A continuación, agregue de 50 a 400 microlitros de N-B-T-B-C-I-P diluido en tampón de detección a una relación de uno a 100 sobre cada portaobjetos y deje que los portaobjetos incuben de dos a tres horas en una cámara humidificada según la experiencia.Lave las laminillas con agua DI, luego aplique verde metilo al 0,05 % peso por volumen y deje que la contratinción actúe sobre el tejido durante 10 minutos a 37 grados Celsius. Lave nuevamente las laminillas con agua DI y luego deshidrátelas con etanol al 100 %, seguido de una inmersión en xileno.Finalmente, aplique 80 microlitros de medio de montaje y cubra con un cubreobjetos. Los portaobjetos después de que las sondas fueron marcadas con dig. Su sensibilidad se comparó con la dilución de la sonda de control positivo.La sonda específica de 343 pares de bases para P. gingivalis fue 25 veces más sensible que la sonda bacteriana diseñada de 70 pares de bases. Luego, ambas sondas se aplicaron a tejidos gingivales de pacientes con periodontitis crónica a alto aumento. Las diversas formas de bacterias fueron distinguibles utilizando la sonda bacteriana.Mientras que la sonda específica para P. gingivalis solo detectó bacterias con forma de bastón, se aplicó un agente químico que altera las uniones estrechas, el DSS, sobre la mucosa gingival de ratones. Se utilizaron muestras de tejido de estos ratones para comparar las sondas en un contexto diferente. Aquí, la sonda bacteriana U fue capaz de detectar las bacterias que la otra no pudo.A continuación, se evaluó la sonda bacteriana U para determinar su capacidad de detectar otras bacterias en secciones de tejido pulmonar que contenían tumores. Se detectaron bacterias tanto fuera como dentro del tumor. Al examinar tejidos de pacientes con liquen plano oral, una enfermedad de etiología desconocida, la sonda bacteriana detectó señales bacterianas dentro de las células del epitelio y de la lámina propia, donde se observó infiltración inflamatoria.Desde su desarrollo, esta técnica ha ayudado al investigador en el campo de las enfermedades infecciosas a explorar la invasión bacteriana en tejidos tanto de humanos como de animales siguiendo este procedimiento. Otros métodos, como la detección inmuniquímica del crecimiento de marcadores celulares, pueden emplearse con el fin de responder preguntas adicionales, como qué tipo de células albergan las bacterias dentro de los tejidos.

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