Los métodos para aumentar la sensibilidad de alta resolución de fusión polimorfismo de nucleótido único Genotipado de la Malaria

El objetivo general del siguiente experimento de fusión de alta resolución es aumentar la sensibilidad de detección de alelos mutantes presentes en bajas concentraciones dentro de muestras individuales. Esto se logra primero preparando el ADN extraído mediante la dilución de la plantilla a los volúmenes y concentraciones necesarios. El segundo paso consiste en preparar los ensayos con proporciones asimétricas del cebador directo y del cebador inverso para incrementar el producto de sonda de la plantilla.

Después de preparar las reacciones, la temperatura de recocido se establece entre las temperaturas de fusión de la sonda cuando está unida a la plantilla de tipo silvestre o mutante. El último paso consiste en analizar los productos amplificados en la plataforma HRM adecuada. En última instancia, el sesgo en la amplificación del alelo mutante y la PCR asimétrica basada en sondas permiten una detección más sensible de mutaciones SNP desafiantes en bajas concentraciones presentes en las muestras.

Esta sensibilidad aumentada es útil para la vigilancia de mutaciones en poblaciones. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la fusión estándar de alta resolución o la genotipificación TaqMan, es que permite una mayor sensibilidad para alelos presentes en bajas concentraciones, y también permite la genotipificación de SNP ubicados próximos entre sí en el genoma. Aunque este método puede proporcionar información sobre la propagación de la resistencia a fármacos en el parásito de la malaria.

También puede aplicarse a otros sistemas, como la vigilancia de otros tipos de enfermedades infecciosas, por ejemplo el VIH, o la detección de variantes raras de cáncer en una población de células. La procedimiento lo demostrará Caitlin Durphy, una técnica de nuestro laboratorio.

Las plantillas para la fusión de alta resolución o HRM se preparan a partir de muestras de plasmodium falciparum obtenidas directamente de la sangre de pacientes que participan en estudios de campo. Las muestras pueden almacenarse en papel filtro, en pruebas de detección rápida o como muestras de glóbulos rojos en pellet; también pueden adaptarse al cultivo para crecer in vitro. Algunas cepas de laboratorio estándar para análisis pueden solicitarse al centro de recursos de reactivos de investigación y referencia de malaria. Las muestras pueden extraerse de sangre completa, glóbulos rojos o papel filtro, o usarse directamente a partir de glóbulos rojos en pellet o cultivo para la amplificación directa a partir de glóbulos rojos en pellet.

Primero determine el porcentaje de parasitación de los glóbulos rojos mediante microscopía de frotis delgado siguiendo el procedimiento del Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades. Los glóbulos rojos con parasitación superior al 0,5 % se diluyen luego uno a 400. En tampón TE, se utilizarán tres microlitros de glóbulos rojos diluidos para cada reacción de cinco a 10 microlitros debido a la variabilidad entre muestras; siempre se deben incluir controles positivos y negativos en los análisis de HRM.

Prepare diluciones de 10 picogramos a 10 nanogramos por un microlitro de plásmido o estándares con genotipos snip de secuencia verificada como controles positivos. Utilice agua de grado PCR como control negativo sin molde para las reacciones de amplificación. Inicie este procedimiento preparando soluciones de trabajo al 10 x de los cebadores y sondas.

El mismo protocolo es aplicable a ensayos que utilizan placas de 96 pocillos, placas de 384 pocillos, tiras de ocho tubos o capilares de vidrio. Sin embargo, para efectos de esta demostración, solo se utilizarán placas de 96 pocillos y capilares de vidrio. Esta tabla muestra las concentraciones recomendadas de almacén de trabajo 10 x, así como las concentraciones finales para la genotipificación HRM basada en sonda bloqueada.

Prepare mezclas de reacción para cada uno. Añada un microlitro de cada reactivo principal directo e inverso y sondas en concentración de trabajo 10 x, cuatro a cinco microlitros de la mezcla maestra HRM, un microlitro de molde y agua libre de nucleasas para obtener un volumen total de reacción de 10 microlitros.

Haga lo mismo con cada capilar de vidrio. Cubra las placas y los capilares de vidrio. Utilice sellos ópticos para placas en los sistemas de amplificación basados en placas y tapones de plástico para los sistemas basados en capilares.

Asegúrese de que la cobertura sea completa y de que las placas y las tapas estén completamente selladas y aseguradas para prevenir la evaporación durante la amplificación. Centrifugue las muestras para eliminar las burbujas de aire.

Centrifugar las placas en una centrífuga de mesa durante tres minutos a 1.800 ×g. Centrifugar los capilares de vidrio en una microcentrífuga durante 10 a 15 segundos. Colocar la placa de reacción y los capilares de vidrio en un termociclador y ejecutar los protocolos estándar de sonda bloqueada o amplificación MAAB. Tras la amplificación por PCR, proceder al análisis de desnaturalización desde la interfaz de software del sistema.

Derrita la placa de 40 grados Celsius a 80 grados Celsius para producir picos de fusión tanto de la sonda como del amplicón. El primer paso del análisis de fusión en el ciclador ligero cuatro 80 es la normalización a partir de la vista de la derivada negativa de la fluorescencia normalizada respecto a la temperatura. Mueva las barras de normalización para que rodeen la región de fusión de la sonda.

La región de fusión de la sonda es la de temperatura más baja de las dos regiones de fusión. Las barras de normalización deben estar en la base de los picos de fusión. Después de la normalización, seleccione calcular grupos para asignar automáticamente las muestras a grupos si es necesario, o reasigne manualmente las muestras a grupos específicos.

Seleccione muestras que no amplificaron o que presentan picos de fusión irregulares. Luego, vaya a nueva llamada y seleccione negativo. Después de seleccionar cualquier muestra restante mal clasificada, vaya a nueva llamada, seleccione el agrupamiento adecuado y haga clic en aplicar cambio. Asigne genotipos para cada grupo según los patrones establecidos.

Después de confirmar que los grupos calculados son correctos, seleccione editar nombres de grupo en la pestaña de agrupación. Ingrese los genotipos de los patrones en el cuadro de color correspondiente. Por ejemplo, si el patrón 3D siete tiene un genotipo C conocido y está en el grupo uno, entonces todas las muestras en el grupo uno tienen el genotipo C; presione resultados y los genotipos se muestran junto a las muestras.

Por último, exporte los resultados como un archivo TXT para un análisis adicional de la población de muestras. Después de que finalice la corrida en el ciclador térmico 2.0, registre los nombres de las muestras y sus posiciones en los datos de la muestra. Antes de comenzar el análisis, etiquete los controles negativos y los genotipos de los patrones de fusión. Inicie el análisis de fusión seleccionando análisis, eligiendo genotipificación dentro del análisis de curva de fusión y presionando Aceptar.

Para aumentar la sensibilidad del agrupamiento automático, seleccione todas las muestras de modo que se muestren en la gráfica de curvas de fusión. Deslice la barra de normalización hasta el límite superior de los picos de fusión de la sonda. Confirme que las muestras hayan sido agrupadas correctamente seleccionando individualmente cada grupo debajo del nombre del grupo.

Exporte los genotipos de cada muestra seleccionando todas las muestras, copiando los datos y pegándolos en una hoja de trabajo. La gráfica de la derivada negativa de la fluorescencia normalizada con respecto a la temperatura es generalmente la forma más sencilla de visualizar los picos de fusión y determinar los genotipos. Establecer la ventana de análisis únicamente en una región de sonda permite diferenciar claramente los picos correspondientes a SNPs específicos.

Las coincidencias perfectas producen picos de fusión más altos indicados en rojo. Mientras que los desajustes de SNP presentan temperaturas de fusión más bajas indicadas en gris cuando ambos alelos están presentes en una muestra. El análisis HRM basado en probabilidad representa ambos alelos como dos curvas de pico mostradas en naranja, con picos que coinciden con muestras de un solo alelo mostradas en rojo y gris; reducir progresivamente la temperatura de fusión durante la amplificación provoca un sesgo hacia el alelo mutante, representado por el pico del lado izquierdo en una muestra poligenómica o polialélica.

El sesgo de amplificación de este alelo mutante resulta en una sensibilidad HRM para detectar alelos menores presentes en menos del 1 % en muestras poligenómicas o polialélicas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la calidad de la muestra es fundamental. Diferencias menores en las concentraciones de tampón pueden desplazar las curvas HRM.

El uso de controles es una forma útil de estandarizar los resultados. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar la PCR asimétrica con sonda y el sesgo de amplificación de alelos mutantes para genotipar con precisión y sensibilidad SNPs de la malaria a partir de diversos tipos de muestras.