Diseño y Construcción de Artificial matriz extracelular (AECM) Las proteínas de Escherichia coli Para la piel Ingeniería de Tejidos

El objetivo general de este procedimiento es demostrar los pasos involucrados en la construcción y producción de proteínas artificiales de ECM o repeticiones similares a ECM que contienen elastina. Esto se logra primero construyendo genes recombinantes que codifican las proteínas A ECM. A continuación, los genes recombinantes se insertan en los huéspedes bacterianos.

En este punto, las proteínas recombinantes se expresan en los huéspedes bacterianos y luego se cosechan después de la extracción de proteínas a través de la lisis celular. El paso final es purificar las proteínas mediante un ciclo de transición inversa o ITC, que explota el comportamiento único de transición de fase de la elastina. Como los polipéptidos.

Los ciclos de centrifugación se realizan a cuatro grados centígrados y a 37 grados centígrados. En última instancia, se utilizan técnicas de electroforesis en gel y Western blot para identificar las proteínas recombinantes y determinar sus purezas. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como las columnas de afinidad, es que podemos extraer grandes cantidades de proteínas de forma relativamente barata.

Comience este procedimiento con todo el diseño de ligamentos como se describe en el protocolo de texto. Una vez obtenidos los oligómeros, se analizan los oligómeros de ADN para obtener la secuencia génica deseada. En primer lugar, disuelva los oligonucleótidos de ADN en un tampón de oligonucleótidos de ADN hasta una concentración final de un microgramo por microlitro.

Agregue cuatro microlitros de cada ligamento a 32 microlitros de ADN y tampón de rodillas para lograr una mezcla total de 40 microlitros. A continuación, hierve un vaso de precipitados con agua con una placa caliente y sumerge la mezcla durante cinco minutos. A 95 grados centígrados, retire el vaso de precipitados y enfríe gradualmente toda la instalación en una caja de espuma de poliestireno durante la noche, los oligómeros ahora han estado arrodillados y listos para la digestión.

Agregue las enzimas de restricción correspondientes para digerir los oligómeros al y los vectores del huésped por separado, como se describe en el texto del Resumen del Protocolo durante tres o cuatro horas a 37 grados Celsius. Después de ejecutar los productos de digestión en un gel de agarosa y purificar el ADN, combine el gen de interés secuencialmente ligando el inserto de ADN digerido en el vector plásmido con T cuatro ligasa. Usando la receta que se encuentra en el protocolo de texto, incube la mezcla de ligadura a temperatura ambiente durante dos horas.

A continuación, transforma las celdas usando el choque térmico de Ali. Cotizando 50 microlitros de celdas competentes en tubos de microcentrífuga limpios y preenfriados. Pipetear cinco microlitros de la mezcla de ligadura en las células, pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar.

Deja la mezcla en hielo durante 20 minutos. A continuación, sumerja el tubo de microcentrífuga que contiene la mezcla de células en un baño de agua a 42 grados centígrados durante dos minutos y vuelva a ponerlo en hielo durante dos minutos. Agregue 500 microlitros de medio SOC en el tubo de microcentrífuga e incube a 37 grados centígrados agitando durante una hora.

Después de la incubación, esparcir de 50 a 500 microlitros de la mezcla de ligadura celular en una placa de barrena dos veces YT que contenga ampicilina que se haya precalentado a temperatura ambiente. Incuba las placas boca abajo a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, recoja las colonias de ADN de la placa de la barrena con puntas de pipeta limpias.

Cultiva las colonias en cinco mililitros de dos veces. YT medios que contenían ampicilina durante la noche a 37 grados centígrados durante la noche con temblores al día siguiente. Utilice un kit de aislamiento de plásmidos de acuerdo con el protocolo del fabricante para extraer los plásmidos de ADN de cada colonia.

Eluido elegido, el ADN con 50 microlitros de agua después de la transformación del plásmido recombinante en el huésped de expresión bacteriana como se describe en el protocolo de texto. Elija una colonia de la placa de barrena transformada con una punta de pipeta inoculada. 10 mililitros de caldo estéril o medio antituberculoso que contiene antibióticos ampicilina y cloranfenicol en un tubo de ensayo.

Incubar este cultivo iniciador a 37 grados centígrados durante la noche con agitación a 225 RPM. A continuación, transfiera 10 mililitros del cultivo iniciador a un litro de medios de tuberculosis frescos y estériles. Suplementado con los mismos antibióticos en un matraz Meyer erlin de tres litros.

Incubar el cultivo a 37 grados centígrados con agitación a 225 RRP M durante dos o tres horas. Observe la densidad óptica del cultivo a 600 nanómetros o OD 600 para confirmar que ha alcanzado de 0,6 a 0,8 pipeteando un mililitro de cultivo en un Q vet vacío para su lectura. A continuación, inducir el cultivo con IPTG a una concentración final de un milimolar e incubar a 37 grados centígrados agitando a 225 RPM durante otras cuatro horas.

Cosechar las células transfiriendo el cultivo a una centrífuga de un litro, botellas y centrifugando a 12.000 Gs durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Después de desechar el sobrenadante, pesar los gránulos de la célula y volver a suspender en 10 tampones a 0,5 gramos por mililitro. Congele el cultivo celular resuspendido a menos 80 grados centígrados durante la noche.

Al día siguiente, descongele el cultivo celular congelado en un baño de agua a temperatura ambiente o con hielo. A L las células añaden desoxi ribonucleasa, una ribonucleasa a y fluoruro de fenil metilsuen. Mientras descongela la solución, homogeneice la solución agitando lentamente.

Después de descongelar todas las células resuspendidas, ajuste la solución a pH 9.0 para aumentar la solubilidad de las proteínas en agua con mucho cuidado. Adición de seis N de hidróxido de sodio gota a gota con agitación sobre hielo para lograr una consistencia homogénea. A continuación, pique las células mediante interrupción ultrasónica durante 20 minutos en hielo, utilizando una punta plana de dos milímetros de diámetro y un pulso de cinco segundos.

Centrifugar la solución celular a 12.000 Gs durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera el supernat a una botella limpia y vacía y guárdelo a cuatro grados centígrados para purificarlo más tarde. Mientras tanto, vuelva a suspender el pellet celular con 10 tampones y guarde 20 microlitros del lisado celular.

Para la caracterización de la página SDS, vuelva a congelar el pellet de la célula resuspendida a menos 80 grados Celsius para completar la lisis celular. Repita el proceso de congelación, descongelación y sonicación hasta tres veces. Recopilar el lisado celular de anteriormente y proceder a purificar las proteínas A ECM utilizando ITC en el que se realizan ciclos de centrifugación a diferentes temperaturas en condiciones de alta salinidad.

Divida el lisado celular en una centrífuga de 50 mililitros, botellas y centrífuga a 40.000 g durante dos horas a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante pipeteando para obtener una separación limpia del pellet. Recoja el sobrenadante en frascos de centrífuga limpios y agregue cloruro de sodio hasta una concentración final de un molar.

Calentar la solución a 37 grados centígrados durante dos horas agitando a 225 RPM. Siguiente centrífuga. El sobrenadante a 40.000 Gs durante dos horas a 37 grados centígrados.

Después de la decantación, el sobrenadante tritura el pellet con una espátula de metal y vuelve a suspender los trozos de pellet en hielo. Agua destilada fría en autoclave con agitación vigorosa durante la noche a cuatro grados centígrados utilizando una barra de agitación magnética y una placa hasta que el pellet se disuelva por completo. Repita estos ciclos hasta que el pellet a 37 grados centígrados esté blanco, momento en el que se puede disolver en agua durante la noche y centrifugar.

Para obtener la solución proteica, desala la solución proteica dializándola contra agua destilada a cuatro grados centígrados, cambiando el agua cada cuatro horas u ocho horas durante la noche durante dos o tres días después de guardar 20 microlitros de la proteína purificada para la página SDS Liofilizar el resto de la proteína purificada como se muestra aquí. Una banda de proteína intensa tiene el peso molecular predicho en la muestra inducida. También se muestra el gel de página SDS que contiene una muestra de proteína purificada con un peso molecular de 22 kilodaltons correspondiente a la laminina cinco A ECM.

La pureza estimada de las proteínas A ECM es de aproximadamente 90 a 95%Este valor se derivó comparando las proporciones de las intensidades de banda de la proteína objetivo y otras bandas de proteínas presentes en el gel SDS. Finalmente, para determinar si la proteína purificada era efectivamente la proteína A ECM, se realizó un Western blot aquí. La pureza proteica de las tres proteínas A ECM se muestra con un gel de página SDS y se compara con una imagen de la membrana de nitrocelulosa para Western blot.

El análisis revela la presencia de las proteínas diana colágeno cuatro A ECM y laminado cinco A ECM marcados con anticuerpos anti hexa histidina tag conjugados con peroxidasa de rábano picante. Los rendimientos finales de las proteínas A ECM oscilaron entre 60 miligramos por litro y 120 miligramos por litro. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo contraer y purificar proteínas que contienen dominios ligeros de elastina para su aplicación específica.