Name: Diseño y Construcción de Artificial matriz extracelular (AECM) Las proteínas de Escherichia coli Para la piel Ingeniería de Tejidos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Aprende a construir y purificar proteínas de matriz extracelular artificial con repeticiones tipo elastina usando tecnologías recombinantes en Escherichia coli. Este método avanza la ingeniería de tejidos.

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Los autores desean agradecer a la financiación del Ministerio de Educación ACRF Tier 1 (RG41) y puesta en marcha beca de la Universidad Tecnológica de Nanyang. Bajo y Tjin son financiados por la Beca Estudiantil de Investigación (RSS) de la Universidad Tecnológica de Nanyang, Singapur.

1. Clonación de plásmidos que codifican recombinante para AECM Proteínas <ol><li> Diseño de la secuencia de aminoácidos del dominio funcional (por ejemplo, el dominio de unión celular y elastina repeticiones similares). Sitios de restricción Diseño flanquean los extremos de los dominios funcionales para facilitar la sub-clonación usando software libre de acuerdo con las instrucciones del software (por ejemplo, http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/). Aquí, seleccionar sitios de restricción únicos que no están presentes en el dominio funcional para confinar la digestión a los sitios previstos. Elige sitios de restricción que aparecen en el sitio de clonación múltiple (MCS) del vector de host (por ejemplo, pET22b (+)) para sub-clonación. </li><li> Invertir traducir la secuencia de aminoácidos en la secuencia de nucleótidos utilizando sitios web gratuitos acuerdo con las instrucciones de software. (Por ejemplo, http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html). Asegurarse de codones están optimizados para E. anfitriones coli. </li><li> Gen de interés puede ser purchasoligonucleótidos ed comercialmente como una sola cadena (es decir, si los oligonucleótidos &lt;100 pares de bases (pb)) y realizar el recocido de ADN (véase el paso 1.4) para reducir el costo. De lo contrario, los genes de más de 100 pb, que podían ser adquiridos a través de empresas comerciales. </li><li> Recocido de ADN de los oligonucleótidos <ol><li> Recocer la oligómeros de ADN para obtener la secuencia del gen deseado. Disolver oligonucleótidos de ADN en un tampón de oligómero de ADN (mM Tris 10: 2-amino-2- (hidroximetil) propan-1,3-diol, pH 8,0, filtrada) a una concentración final de 1 g / l. </li><li> Añadir 4 l de cada oligómero a 32 l de tampón de hibridación de ADN (Tris 10 mM, NaCl 100 mM y 100 nM de MgCl 2) para conseguir un total de mezcla de 40 l. </li><li> Hervir un vaso de precipitados de agua utilizando una placa caliente y sumergir la mezcla durante 5 min, 95 ° C. Retire el vaso de precipitados y enfriar gradualmente la totalidad de configurar en una caja de espuma de poliestireno O / N. Los oligómeros han sido recocidas y están listos para la digestión. </li></ol></li&gt; <li> Añadir las enzimas de restricción correspondientes a digerir los oligómeros hibridados (es decir, referido como inserto) y vector huésped (es decir, pET22b (+)) por separado. Utilice la siguiente receta (1-2 g de ADN, 2 l de cada enzima de restricción, 5 l de tampón 10x enzima de restricción, y agua hasta un total mezcla de 50 l) durante 3-4 horas a 37 ° C. NOTA: El pET22b (+) plásmido vector es resistente a los antibióticos ampicilina y contiene un 6x-His tag en el extremo C-terminal. El 6x-His presente en pET22b (+) nos permite utilizar sus-etiquetados anticuerpos para identificar la proteína diana a través de Western Blot en el paso 7. </li><li> Agregar colorante de carga 6x a cada mezcla de digestión. Ejecutar las mezclas de digestión por separado incluyendo una escalera de ADN en 1.2% geles de agarosa de ADN que contiene una mancha de ADN fluorescente UV durante 1 hora a 100 V. visualizar el DNA en gel de agarosa 1,2% con un iluminador de luz UV. </li><li> Cortar el gel para extraer productos de ADN digeridos utilizando kits de purificación de gel comercial. Elute utilizando el volumen mínimo de la columna para lograr una concentración mínima de ADN de 50-100 ng / l. </li><li> Combinar el gen de interés secuencialmente ligando el inserto de ADN digerido (es decir, repeticiones de elastina o dominios de unión de células obtenidos por recocido de ADN) en el vector de plásmido usando la ligasa de T4 utilizando la siguiente receta: (2 l de vector, 1 l de T4 ligasa, 1,5 l de tampón de ligación T4, x l de inserto, 10,5 x-l de agua para un total mezcla de 15 l). Incubar la mezcla de ligación a RT durante 2 hr. NOTA: la concentración molar del vector para insertar debe variar para optimizar la eficiencia de la ligadura. Volumen de inserto descrito como x en la receta depende de la concentración de ADN eluido de la etapa 1.7. </li><li> Descongele E. células químicamente competentes coli DH5a (o cualquier cepa de clonación) en hielo. Placas de agar 2xYT caliente (Tabla 1) que contiene ampicilina (25 mg / ml) a 37 ° C. </li><li> Transformar las células utilizandoGolpe de calor: <ol><li> Alícuota de 50 l de células competentes en tubos de microcentrífuga limpio, pre-refrigerados. Pipetear 5 l (entre 100 pg a 100 ng) de la mezcla de unión en las células, pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Deje la mezcla en hielo durante 20 min. </li><li> Sumergir el tubo de micro-centrífuga que contiene la mezcla de células en un baño de agua 42 ° C durante 2 min y vuelto a en hielo durante 2 min. Tiempo de la duración de inmersión para minimizar el daño por calor a las células. </li><li> Añadir 500 l de medio SOC (Tabla 1) en el tubo de microcentrífuga y se incuba a 37 ° C con agitación durante 1 hr. </li><li> Spread 50 500 l de la mezcla de células / ligadura sobre una placa de agar 2xYT que ha sido pre-calentado a RT, que contiene ampicilina (25 mg / ml) e incubar las placas al revés a 37 ° CO / N (12-16 hr) . </li></ol></li><li> Al día siguiente, escoja colonias de ADN de la placa de agar utilizando puntas de pipeta limpias. Cultivar las colonias en 5 ml de medio 2YT (Tabla1) que contiene ampicilina (25 mg / ml) O / N a 37 ° CO / N (12-16 hr) con agitación (225 rpm). </li><li> Al día siguiente, utilice un kit de aislamiento de plásmido para extraer los plásmidos de ADN para cada colonia elegido de acuerdo con el protocolo del fabricante. Eluir el ADN con 50 l de agua. </li><li> Realice una prueba de digerir con enzimas de restricción utilizando la siguiente receta: (ADN 5 l, 0,2 l de cada enzima de restricción, de amortiguamiento de la enzima 1 l 10x restricción y recarga de agua para un total mezcla de 10 l), se incuba durante 2 horas a 37 ° C para la detección de colonias que probablemente contienen el inserto y se ejecutan en un 1,2% en gel de agarosa de ADN como en el paso 1.6. NOTA: Después de la digestión, una ligadura de éxito debe resultados en dos grupos, uno para cada vector y el inserto que se corresponden con su respectivo peso molecular (Figura 1). </li><li> Enviar las posibles colonias para la secuenciación de ADN utilizando promotor T7 cebadores directo e inverso a secuenciadores comerciales. </li></ol><ol><li> Desde el resultado de la secuenciación, seleccionar una colonia que ha sido ligado con éxito y utilizar el plásmido de ADN para la transformación en una E. huésped de expresión coli. </li><li> Descongele E. cepa de expresión coli (BL21 (DE3) pLysS) en hielo. Mientras tanto, las placas de agar caliente que contiene ampicilina (25 mg / ml) y cloranfenicol (34 mg / ml) a RT. NOTA: El plásmido presente en bacterias pLysS cepa BL21 (DE3) pLysS contiene un gen de resistencia a cloranfenicol. El plásmido pLysS contiene un gen represor T7 que se expresa constitutivamente a limitar la expresión de la proteína con fugas AECM. El cloranfenicol es necesario seleccionar para las células de bacterias que contiene pLysS durante el cultivo. </li><li> Repita el paso 1,10 para obtener transformó E. células de E. coli que están listos para expresar las proteínas artificiales. Envolver las placas de agar en Parafilm y almacenar al revés en 4 6; C durante un máximo de un mes. </li></ol> 3. Expresión bacteriana de AECM Proteínas <ol><li> Consulte la Figura 2, elegir una colonia de la placa de agar transformada con una punta de pipeta e inocular en 10 ml de caldo Terrific (TB) medios estériles (Tabla 1) que contiene tanto los antibióticos ampicilina y cloranfenicol en un tubo de ensayo. Incubar este cultivo iniciador a 37 ° CO / N (12.16 h) con agitación a 225 rpm. </li><li> Transferir 10 ml del cultivo iniciador en 1 L de medios de TB frescos y estériles suplementado con los mismos antibióticos en un matraz Erlenmeyer de 3 l. Incubar el cultivo a 37 ° C con agitación a 225 rpm durante 2-3 hr y observar la densidad óptica del cultivo (OD 600) alcanzado 0,6-0,8 pipeteando 1 ml de cultivo en una cubeta vacía para la lectura. Guardar 1 ml de cultivo antes de la inducción para la caracterización de SDS-PAGE. <ol><li> Para medir OD 600 del cultivo celular, preparar 1 vial de medios de comunicación de TB en una cubetapara una medición en blanco. Por otra parte, la transferencia de 1 ml de cultivo del matraz de cultivo en una nueva cubeta vacía. Medir la densidad óptica del cultivo usando un espectrofotómetro contra el blanco de control a una absorbancia de 600 nm. </li><li> Guardar la muestra (para el análisis SDS-PAGE posterior) mediante la transferencia de los 1 ml de muestra de cultivo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, se centrifuga a 12.000 xg durante 2 min, y decantar el sobrenadante. </li></ol></li><li> Inducir la cultura con isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 1 mM y se incuba a 37 ° C con agitación a 225 rpm durante otras 4 h. Guardar 1 ml de cultivo al final de la inducción a 4 hr para la caracterización de SDS-PAGE. </li><li> Recoger las células mediante la transferencia de la cultura a botellas de centrífuga de 1 L y se centrifuga a 12.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Descartar el sobrenadante, sopesar los sedimentos de células y resuspender en tampón TEN (Tris 1 M, 0,01 M EDTA, 0,1 M NaCl, pH = 8,0) a 0,5 g / ml. </li></ol> 4. La lisis de cultivos bacterianos <ol><li> Congelar la re-suspendido de cultivo celular a -80 ° CO / N. Descongelar el cultivo celular congelado en un baño de agua a temperatura ambiente o en hielo para lisar las células. Añadir 10 g / ml Deoxyribonuclease I (DNasa I), 10 mg / ml de ribonucleasa A (RNasa I), y 50 mg / ml de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) mientras que la descongelación y homogeneizar la solución con agitación lenta. </li><li> Después de todas las células resuspendidas se descongelan, ajustar la solución a pH 9,0 para aumentar la solubilidad de la proteína en agua 12. Añadir 6 N de NaOH gota a gota con agitación en hielo para alcanzar una consistencia homogénea. Lyse por la interrupción de ultrasonidos durante 20 min en hielo utilizando una punta plana de diámetro 2 mm, 5 pulso seg. </li><li> Centrifugar la solución de células a 12.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Transferir el sobrenadante a un frasco vacío y limpio y se almacena a 4 ° C para la purificación posterior. </li><li> Mientras tanto, volver a suspender el sedimento celular nuevo con tampón TEN y volver a congelar a -80 ° C. Alisis celular completa, repetición de congelación / descongelación y sonicación proceso hasta tres veces. Ahorra un 20 lisado celular l para la caracterización de SDS-PAGE. </li></ol> 5. Purificación de proteínas usando AECM Inverse Transición Cycling <ol><li> Intercalar el lisado celular de la etapa 4.3 y proceder a purificar las proteínas AECM utilizando ITC, similar a la utilizada para la purificación de proteínas basado en elastina 21. Ciclos se hará con las diferentes temperaturas que son 4 ° C (referidos como &quot;frío&quot;) y 37 ° C (referidos como &quot;calientes&quot;) ciclos respectivamente. </li><li> Dividir el lisado celular en 50 ml botellas de centrífuga, y se centrifuga a 40.000 xg durante 2 horas a 4 ° C. El aspecto del sedimento celular debe ser de color marrón oscuro y buscar nasal. </li><li> Eliminar el sobrenadante con la pipeta para conseguir una separación limpia del sedimento. Recoger el sobrenadante en botellas de centrífuga limpio y añadir NaCl a una concentración final de 1 M (hasta un máximo de 3 M). Calientela solución a 37 ° C durante 2 horas con agitación a 225 rpm. NOTA: La adición de NaCl se disparará la transición del componente elastina de la AECM causando agregación. El sobrenadante se volverá turbia. Si la concentración de proteína es lo suficientemente alta, la proteína blanco espumoso se puede ver en los lados de la botella de centrífuga. </li><li> Centrifugar el sobrenadante del paso 5.3 a 40.000 xg durante 2 horas a 37 ° C. Decantar el sobrenadante. Triturar el sedimento usando una espátula de metal y resuspender los bits de pellets en autoclave de agua destilada enfriada con hielo (50 mg / ml) con agitación vigorosa O / N a 4 ° C utilizando una barra de agitación magnética y la placa. El sedimento debe ser completamente disuelto. </li><li> Repita los pasos 5.2 a 5.4 durante otros tres a cinco veces para obtener una mayor pureza de la proteína. </li><li> Después del ciclo final de la purificación, desalar la solución de proteína por diálisis contra agua destilada a 4 ° C. Dializar solución de proteína contra el agua durante 2-3 días con los cambios de agua cada 4hr o 8 horas de O / N. Ahorre 20 l de la proteína purificada por SDS-PAGE y liofilizar el resto de la proteína purificada y almacenar a -80 ° C hasta su uso posterior. </li></ol> 6. Caracterización de AECM proteínas utilizando SDS-PAGE electroforesis <ol><li> Preparar un gel de SDS-PAGE al 12% (si el peso molecular es grande, utilice 8% en geles de SDS-PAGE para una mejor separación). Añadir tampón de carga SDS 2x a cada muestra, calentar las muestras durante 10 min a 100 ° C y ejecutar muestras en el gel durante 1 hora a 100 V o hasta que la escalera de proteína correspondiente al peso molecular de la proteína AECM alcanza el medio de la gel. </li><li> Recuperar el gel de la SDS-PAGE configurar y añadir Coomassie Brilliant mancha azul (Tabla 2) con un volumen de sumergir el gel durante 1 hora en una placa de Petri. Enjuague el gel en una solución decolorante (Tabla 2) durante 5 min en un eje de balancín. Cambie la solución decolorante, y continuar destain el gel con balanceo hasta que el fondo de tél gel se vuelve claro. Las bandas de proteínas deben ser claramente visibles. </li><li> Comparación de la posición de la proteína diana contra la escalera de proteínas para determinar el peso molecular de la proteína diana. </li><li> Para confirmar aún más la presencia de la proteína diana, lleve a cabo el Western Blot como en el paso 7. </li></ol> 7. Caracterización de AECM proteínas usando Western Blotting <ol><li> Ejecute las muestras en un gel SDS-PAGE al 12%, como en la sección 6 sin manchas. </li><li> Cortar membrana de nitrocelulosa a un tamaño ligeramente mayor que el gel SDS-PAGE. Cortar 4 trozos de papel de filtro para el mismo tamaño. </li><li> Moje un pedazo de papel de filtro con transferencia Western Buffer (20% v / v de metanol, 25 mM Tris, 190 mM de glicina, pH 8,3), colocar el gel SDS-PAGE en la parte superior del papel de filtro, seguido de otro pedazo de papel de filtro , a continuación, la membrana de nitrocelulosa y una final otros dos trozos de papel de filtro. Asegúrese de que el conjunto de configuración se sumerge con tampón de transferencia occidental suficiente. NOTA: El gel y la membrana no deben estar en contacto en este punto de tiempo como proteínas podrían unirse a la membrana tras el contacto. </li><li> Transferir las proteínas en la membrana de nitrocelulosa mediante la colocación de dos papeles de filtro en una unidad de transferencia semiseca occidental, seguido de la membrana de nitrocelulosa, y coloque cuidadosamente el gel SDS-PAGE de dentro y de la membrana, por último colocar el último papel de filtro húmedo en dos el gel SDS-PAGE. Ejecutar la transferencia oeste a 45 mA, 30 min. Añadir búfer si el voltaje es superior a 30 V. NOTA: De preferencia colocar el gel SDS-PAGE en la membrana con un intento y evitar cambiar el gel de forma innecesaria en la membrana como proteínas podrían unirse a la membrana al entrar en contacto. </li><li> Recuperar y bloquear la membrana de nitrocelulosa con solución de bloqueo (leche desnatada al 5% en PBS pH 7,4, se filtró con papel de filtro) durante 2 horas a RT. Deshágase de tampón de bloqueo y añadir PBS para enjuagar. NOTA: El cambio a los nuevos guantes para evitar la contaminación de la membrana con prote no deseadoins. </li><li> Incubar anticuerpo anti-His primaria con la dilución en PBS a 1: 1000 a RT durante 1 hr con balanceo. Preparar una mezcla en un volumen que podría sumergir toda la membrana, por ejemplo, con relación de dilución 1: 1.000, añadir 1 l de anticuerpo (concentración Stock: 1 mg / ml) a 999 l de PBS para una mezcla total de 1 ml. </li><li> Enjuague la membrana con 5 ml de PBST (PBS con 0,1% de Tween 20). </li><li> Incubar con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) con una dilución en PBS a 1: 5000 a RT durante 1 hr con balanceo. Preparar una mezcla en un volumen que podría sumergir toda la membrana, por ejemplo, con relación de dilución 1: 5.000, añadir 1 l de anticuerpo (concentración Stock: 1 mg / ml) a 4999 l de PBS para una mezcla total de 5 ml. </li><li> Se lava la membrana con 5 ml de PBST y repetir dos veces. </li><li> Aplicar el sustrato quimioluminiscente a la membrana con un volumen para cubrir la membrana y se incuba siguiendo las instrucciones para el sustrato utilizado. NOTA: La sensibilidad de la detección de la proteína sustrato que puede variar, se recomienda un sustrato con la máxima sensibilidad para señales muy bajas en el caso de aumento de la concentración de anticuerpo no aumenta señales. </li><li> Captura de las señales de quimioluminiscencia utilizando un generador de imágenes basada cámara CCD. Ajustar la relación de dilución de anticuerpo primario y secundario si las señales son débiles y no específica. Incubar ya en solución de bloqueo si la señal de fondo es alto. </li></ol>

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<li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+synthesis+of+protein-based+polymers+with+precisely+specified+molecular+weight+and+sequence+by+recursive+directional+ligation%3A+examples+from+the+elastin-like+polypeptide+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system.</a> Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Ingeniería de proteínas recombinantes es una técnica versátil para crear materiales de proteínas novedosas utilizando un enfoque de abajo hacia arriba. Los materiales basados ​​en proteínas pueden ser diseñados para tener múltiples funcionalidades, adaptado de acuerdo con la aplicación de interés. Debido a la creciente avance en las tecnologías de clonación y expresión de proteínas, se ha convertido en relativamente simple (y rentable) para crear una variedad de proteínas artificiales de una manera reproducible y escala...

Durante varias décadas, se han explorado tanto los materiales sintéticos como los naturales para su uso como andamios en la ingeniería de tejidos1,2. Si bien los materiales sintéticos, como los polímeros, ofrecen una excelente integridad estructural y propiedades mecánicas ajustables, a menudo tienen una bioactividad insuficiente para promover el crecimiento y la infiltración de tejidos. Por otro lado, los materiales naturales, como las proteínas de la matriz extracelular (MEC), tienen una excelente actividad biológica, pero tienen limitaciones como la variabilidad de un lote a otro, la rápida degradación y los problemas de inmunogenicidad. Como tal, las proteínas recombinantes son deseables, ya que pueden diseñarse para imitar solo las propiedades deseables de las proteínas nativas3,4.
La ingeniería de proteínas recombinantes ha despertado un amplio interés como plataforma versátil para el diseño y la producción de nuevos biopolímeros de proteínas artificiales. Mediante el control de la secuencia genética, las funcionalidades de las proteínas artificiales pueden adaptarse a una amplia variedad de aplicaciones5,6. En particular, las proteínas de la matriz extracelular artificial (aECM) pueden adaptarse para que tengan múltiples funcionalidades para aplicaciones en ingeniería de tejidos, regeneración y reparación de heridas2,7. Y lo que es más importante, los avances en las tecnologías de clonación y purificación han aumentado la escalabilidad y reducido enormemente el coste de fabricación de proteínas recombinantes. Es posible producir grandes cantidades de proteínas recombinantes a bajos costos de producción, que son económicas para su uso en la clínica5. 
Se han desarrollado proteínas de matriz extracelular artificial para aplicaciones de ingeniería de tejidos8-11. Por ejemplo, Tirrell et al. diseñaron un injerto vascular de pequeño diámetro utilizando proteínas artificiales que contenían la secuencia de fibronectina CS5 y repeticiones similares a la elastina (ELP-CS5). Demostraron que las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs) eran capaces de adherirse y crecer en estos materiales12. Otros también han incorporado secuencias bioactivas cortas tomadas de fibronectina, colágeno, laminina, fibrinógeno y vitronectina, así como dominios estructurales que imitan la elastina, la seda de araña y los colágenos para crear una variedad de proteínas de fusión10. Las películas reticuladas a granel hechas de proteínas aECM basadas en elastina también mostraron propiedades mecánicas similares a las de la elastina nativa (los módulos elásticos oscilan entre 0,3 y 0,6 MPa)13. Posteriormente, también se informó que las proteínas aECM que contienen fragmentos de fibronectina más largos aceleran la cicatrización de heridas in vitro debido al aumento de las afinidades de unión a integrinas8. 
Recientemente, Tjin y sus colaboradores han desarrollado proteínas ECM artificiales específicas de integrina14. Cada proteína aECM contiene un dominio de unión celular bioactivo tomado de los componentes de la ECM de la piel humana nativa2,7,15, como la laminina-5, el colágeno-IV y la fibronectina. Por ejemplo, se ha demostrado que la integrinaα 3Β1 se une a la secuencia PPFLMLLKGSTR que se encuentra en el dominio globular 3 de la cadena alfa-3 de laminina-5 (LG3)16,17. En su informe, demostraron que los queratinocitos epidérmicos primarios de la piel humana involucran preferentemente diferentes integrinas para unirse a cada una de las proteínas aECM, dependiendo del tipo de dominio de unión celular presente.
Las proteínas aECM discutidas en el trabajo de Tjin et al. contienen dominios flanqueantes similares a la elastina {(VPGIG)2VPGKG(VPGIG)2}8 que confieren elasticidad que imita las propiedades mecánicas de la piel humana. Además, la incorporación de residuos de lisina dentro de las repeticiones similares a la elastina también aumenta la solubilidad general de las proteínas en disolventes acuosos. Además, los residuos de lisina también sirven como sitios de reticulación para facilitar la formación de películas de aECM reticuladas12. La inclusión de repeticiones similares a la elastina dentro de la secuencia de proteínas aECM permite que las proteínas se purifiquen fácilmente a través del ciclo de transición inversa (ITC)14. Las elastinas experimentan una transición de fase brusca y reversible a una temperatura específica conocida como temperatura de solución crítica más baja (LCST) o temperatura de transición inversa (Tt)18-20. Las elastinas y las repeticiones similares a la elastina adoptan conformaciones de bobinas aleatorias hidrofílicas por debajo de su LCST y se vuelven solubles en agua, mientras que por encima de su LCST, las elastinas se agregan rápidamente en partículas de tamaño micrométrico. Estas transiciones de fase son reversibles y, por lo tanto, pueden aprovecharse para permitir que las proteínas aECM basadas en elastina se purifiquen fácilmente mediante la técnica ITC21.
En este trabajo, informamos de un procedimiento generalizado para diseñar, construir y purificar proteínas artificiales de ECM que contienen dominios de unión celular bioactivos, fusionados con repeticiones similares a la elastina. Se describe el proceso para diseñar y clonar los plásmidos que codifican para las secuencias de aminoácidos de las proteínas aECM. Se describen los pasos necesarios para purificar las proteínas aECM mediante ITC. Finalmente, se discuten los métodos para determinar la pureza de las proteínas aECM obtenidas mediante electroforesis SDS-PAGE y Western Blotting.

<table><tbody><tr><td>pET22b (+)</td><td>Novagen</td><td>69744</td><td>Vectores de expresión T7 con resistencia a la ampicilina&nbsp;</td></tr><tr><td>BL21(DE3)pLysS&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>C6060-03</td><td>antibióticos adicionales - cloranfenicol</td></tr><tr><td>Isopropil-beta-D-tiogalactósido (IPTG)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C</td><td>1 M solución madre con agua esterilizada en autoclave, refrescar antes de la inducción.</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>kit de aislamiento de plásmidos</td></tr><tr><td>T4 ligasa</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Affymetrix</td><td>11259</td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Affymetrix</td><td>23660</td><td></td></tr><tr><td>Zymoclean&trade; kit de recuperación de ADN en gel</td><td>Zymo Research</td><td>D4001</td><td></td></tr><tr><td>XL10-gold cepa</td><td>Agilent Technologies</td><td>200315</td><td></td></tr></tbody></table>

diseño y construcción de artificial matriz extracelular (aecm) las proteínas de<em&gt; escherichia coli</em&gt; para la piel ingeniería de tejidos

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

La tecnología recombinante es una plataforma versátil para crear nuevas proteínas artificiales con propiedades sintonizables. Durante la última década, se han reportado muchas proteínas artificiales que han incorporado dominios funcionales derivados de la naturaleza (o creados de novo). En particular, se han desarrollado proteínas de matriz extracelular artificial (aECM); estas proteínas aECM consisten en dominios biológicos tomados de fibronectina, lamininas y colágenos y se combinan con dominios estructurales que incluyen repeticiones similares a la elastina, repeticiones de seda y colágeno. Hasta la fecha, las proteínas aECM han sido ampliamente investigadas para aplicaciones en ingeniería de tejidos y reparación de heridas. Recientemente, Tjin y sus colaboradores desarrollaron proteínas aECM específicas de integrinas diseñadas para promover la unión y propagación de queratinocitos en la piel humana. En su trabajo, las proteínas aECM incorporan dominios de unión celular tomados de la fibronectina, la laminina-5 y el colágeno IV, así como repeticiones flanqueantes similares a la elastina. Demostraron que las proteínas aECM desarrolladas en su trabajo eran candidatas prometedoras para su uso como sustratos en piel artificial. Aquí, describimos el diseño y la construcción de dichas proteínas aECM, así como su proceso de purificación utilizando las características termosensibles de la elastina.

En el diseño de proteínas de fusión que contienen repeticiones tipo elastina, es importante para mantener un contenido de elastina en general, gran parte suficiente de la proteína de fusión 18. Esto es para asegurar que el constructo de proteína de fusión conserva sus características tipo elastina, con el fin de utilizar ITC para la purificación. El diseño y las secuencias de proteínas descritas en esta sección AECM se tomaron específicamente de la obra por Tjin et al. 14. En este trabajo,...

Las tecnologías recombinantes han permitido a los diseñadores de materiales crear nuevas proteínas artificiales con funcionalidades personalizadas para aplicaciones de ingeniería de tejidos. Por ejemplo, las proteínas de la matriz extracelular artificial pueden diseñarse para incorporar dominios estructurales y biológicos derivados de las MEC nativas. Aquí, describimos la construcción y purificación de proteínas aECM que contienen repeticiones similares a la elastina.

Diseño y Construcción de Artificial matriz extracelular (AECM) Las proteínas de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Para la piel Ingeniería de Tejidos

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar los pasos involucrados en la construcción y producción de proteínas de matriz extracelular artificiales o A ECM que contienen repeticiones similares a la elastina. Esto se logra primero mediante la construcción de genes recombinantes que codifican las proteínas A ECM. A continuación, los genes recombinantes se insertan en hospedadores bacterianos.En este momento, las proteínas recombinantes se expresan en los hospedadores bacterianos y luego se recolectan tras la extracción de proteínas mediante lisis celular. El paso final consiste en purificar las proteínas utilizando el ciclo de transición inversa o ITC, que aprovecha el comportamiento único de transición de fase de la elastina, como los polipéptidos.Los ciclos de centrifugación se realizan a cuatro grados Celsius y a 37 grados Celsius. Finalmente, se utilizan técnicas de electroforesis en gel y transferencia western para identificar las proteínas recombinantes y determinar sus grados de pureza. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como las columnas de afinidad es que podemos extraer una gran cantidad de proteínas de forma relativamente económica.Comience este procedimiento con todo el diseño de ligandos descrito en el protocolo escrito. Una vez obtenidos los oligómeros, anile los oligómeros de ADN para obtener la secuencia génica deseada. Primero, disuelva los oligonucleótidos de ADN en tampón para oligos de ADN hasta una concentración final de un microgramo por microlitro.Añada cuatro microlitros de cada ligamento total a 32 microlitros de ADN y tampón de alineación para obtener una mezcla final de 40 microlitros. Luego, hierva un vaso de precipitados con agua utilizando una placa calefactora e introduzca la mezcla durante cinco minutos. A 95 grados Celsius, retire el vaso de precipitados y enfríe gradualmente todo el conjunto en una caja de poliestireno durante la noche; los oligómeros ya han sido alineados y están listos para la digestión.Agregue las enzimas de restricción correspondientes para digerir por separado los oligómeros al y los vectores huésped, como se describe en el protocolo de digestión del texto, durante tres a cuatro horas a 37 grados Celsius. Después de correr los productos de digestión en un gel de agarosa y purificar el ADN, combine secuencialmente el gen de interés ligando el inserto de ADN digerido al vector plasmídico con ligasa T4. Usando la receta que aparece en el protocolo de texto, incube la mezcla de ligación a temperatura ambiente durante dos horas.A continuación, transforme las células mediante choque térmico siguiendo el método de Ali. Transfiera 50 microlitros de células competentes a tubos pequeños de centrifugación limpios y previamente enfriados. Añada cinco microlitros de la mezcla de ligación a las células, pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar.Deje la mezcla en hielo durante 20 minutos. Luego, sumerja el tubo de microcentrífuga que contiene la mezcla celular en un baño de agua a 42 grados Celsius durante dos minutos y regrese al hielo durante dos minutos. Añada 500 microlitros de medio SOC al tubo de microcentrífuga e incube a 37 grados Celsius con agitación durante una hora.Después de la incubación, distribuya de 50 a 500 microlitros de la mezcla de ligación celular sobre una placa de agar YT 2 veces que contenga ampicilina y que haya sido precalentada a temperatura ambiente. Incube las placas boca abajo a 37 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, seleccione colonias de ADN de la placa de agar utilizando puntas de pipeta limpias.Crecer las colonias en cinco mililitros de medio YT dos veces, con ampicilina, durante la noche a 37 grados Celsius con agitación, al día siguiente. Utilice un kit de aislamiento de plásmidos según el protocolo del fabricante para extraer los plásmidos de ADN de cada colonia.Eluir el ADN con 50 microlitros de agua tras la transformación del plásmido recombinante en el huésped bacteriano de expresión según se describe en el protocolo del texto. Elegir una colonia de la placa transformada con un puntero de pipeta e inocular 10 mililitros de caldo terrifico estéril, o medio TB, que contenga ambos antibióticos, ampicilina y cloranfenicol, en un tubo de ensayo.Incube esta cultura inicial a 37 grados Celsius durante la noche con agitación a 225 RPM. Luego, transfiera 10 mililitros de la cultura inicial a un litro de medio TB fresco y estéril, suplementado con los mismos antibióticos, en un matraz Erlenmeyer de tres litros.Incube el cultivo a 37 grados Celsius con agitación a 225 RRP M durante dos o tres horas. Observe la densidad óptica del cultivo a 600 nanómetros o OD 600 para confirmar que ha alcanzado entre 0,6 y 0,8 pipeteando un mililitro de cultivo en un vial Q vacío para la lectura. A continuación, induzca el cultivo con IPTG hasta una concentración final de un milimolar e incube a 37 grados Celsius con agitación a 225 RPM durante otras cuatro horas.Recolecte las células transfiriendo el cultivo a botellas de centrifugación de un litro y centrifugando a 12.000 G durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Después de desechar el sobrenadante, pese los pellet celulares y resuspenda en tampón 10 a 0,5 gramos por mililitro. Congele el cultivo celular resuspendido a menos 80 grados Celsius durante la noche.Al día siguiente, descongele la cultura celular congelada en un baño de agua a temperatura ambiente o sobre hielo. A las células añádales desoxirribonucleasa, ribonucleasa A y fluoruro de fenilmetilsulfonilo. Mientras se descongela la solución, homogenice la solución con agitación lenta.Después de que todas las células resuspendidas se hayan descongelado, ajuste la solución a pH 9,0 para aumentar la solubilidad de la proteína en agua, con mucho cuidado. Añada hidróxido de sodio 6 N gota a gota con agitación sobre hielo para lograr una consistencia homogénea. Luego lice las células mediante disrupción ultrasónica durante 20 minutos sobre hielo, utilizando una punta plana de dos milímetros de diámetro y un impulso de cinco segundos.Centrifugar la solución celular a 12.000 G durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Transferir el sobrenadante a un frasco limpio y vacío, y almacenar a cuatro grados Celsius para su posterior purificación. Mientras tanto, resuspender nuevamente el sedimento celular con 10 unidades de tampón y guardar 20 microlitros del lisado celular.Para la caracterización por electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS, volver a congelar el pellet celular resuspendido a menos 80 grados Celsius para completar la lisis celular. Repetir los ciclos de congelación-descongelación y sonicación hasta tres veces. Recopilar el lisado celular obtenido previamente y proceder a purificar las proteínas A ECM mediante ITC, en el que los ciclos de centrifugación se realizan a diferentes temperaturas en condiciones de alta salinidad.Divida el lisado celular en botellas de centrífuga de 50 mililitros y centre a 40.000 G durante dos horas a cuatro grados Celsius. Retire el sobrenadante mediante pipeteo para obtener una separación limpia del precipitado. Recopile el sobrenadante en botellas de centrífuga limpias y agregue cloruro de sodio hasta una concentración final de un molar.Caliente la solución a 37 grados Celsius durante dos horas con agitación a 225 RPM. A continuación, centrifugue. El sobrenadante a 40.000 Gs durante dos horas a 37 grados Celsius.Después de decantar, use una espátula metálica para triturar el sobrenadante con el precipitado y resuspenda los fragmentos del precipitado en hielo. Autoclave agua destilada fría con agitación vigorosa durante la noche a cuatro grados Celsius utilizando una barra magnética y una placa de agitación hasta que el precipitado se disuelva completamente. Repita estos ciclos hasta que el precipitado a 37 grados Celsius sea blanco, momento en el cual puede disolverse en agua durante la noche y centrifugarse.Para obtener la solución proteica, dese la solución proteica mediante diálisis frente a agua destilada a cuatro grados Celsius, cambiando el agua cada cuatro u ocho horas durante la noche, durante dos o tres días, después de guardar 20 microlitros de la proteína purificada para SDS-PAGE. Liofilice el resto de la proteína purificada como se muestra aquí. Una banda proteica intensa se encuentra en el peso molecular predicho en la muestra inducida. También se muestra el gel de SDS-PAGE que contiene una muestra de proteína purificada con un peso molecular de 22 kilodalton, correspondiente a la laminina A cinco de la MEC.La pureza estimada de las proteínas A ECM es de aproximadamente 90 a 95 %. Este valor se obtuvo comparando las relaciones de las intensidades de las bandas de la proteína diana y de otras bandas proteicas presentes en el gel de SDS. Finalmente, para determinar si la proteína purificada correspondía efectivamente a las proteínas A ECM, se realizó una inmunotransferencia. La pureza proteica de las tres proteínas A ECM se muestra mediante un gel SDS-PAGE y se compara con una imagen de la membrana de nitrocelulosa utilizada en la inmunotransferencia.El análisis revela la presencia de las proteínas diana colágeno cuatro A ECM y laminina cinco A ECM marcadas utilizando anticuerpos anti-etiqueta hexa-histidina conjugados con peroxidasa de rábano picante. Los rendimientos finales de las proteínas A ECM oscilaron entre 60 miligramos por litro y 120 miligramos por litro. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo expresar y purificar proteínas que contienen dominios de elastina tipo elastina para su aplicación específica.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

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