Name: Generación y multi-fenotípicos cribado de alto contenido de Coxiella burnetii transposón mutantes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Aprende a generar mutantes de transposón fluorescentes de Coxiella burnetii y analizar sus fenotipos de internalización, replicación y citotoxicidad mediante microscopía automatizada. Este método permite identificar genes esenciales en el ciclo infeccioso de este patógeno intracelular.

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Este trabajo fue apoyado por una beca Avenir/ATIP a Matteo Bonazzi y una Marie Curie CIG (N° 293731) a Eric Martinez. Los autores desean agradecer al Dr. Robert Heinzen por compartir cepas, anticuerpos y herramientas de C. burnetii, a Virginie Georget y Sylvain DeRossi (Montpellier Rio Imaging-MRI, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier) por su asistencia técnica y análisis de datos.

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El estudio de las interacciones huésped / patógeno ha demostrado ser un método notable de entender infecciones bacterianas y desarrollar estrategias alternativas para contrarrestar las enfermedades infecciosas. Sin embargo, debido a la diversidad de estrategias elaboradas por diferentes patógenos bacterianos, la identificación y caracterización de factores de virulencia bacterianos y del huésped vías de señalización que están dirigidos durante las infecciones representan un verdadero desafío. Esto requiere el desarrollo de nuevos enfoques para la identificación a gran escala de los centros principales de interacción huésped / patógeno. El reciente desarrollo de innovadores, de alto rendimiento y técnicas de selección de alto contenido representa un recurso muy valioso que se puede adaptar al estudio de patógenos bacterianos intracelulares 15. En este caso, hemos utilizado el zoonótica bacteriana Coxiella burnetii patógeno como modelo para desarrollar enfoques de cribado que combinan mutagénesis de transposones y ensayos basados ​​en fluorescencia. Importantly, este método de cribado permite la monitorización simultánea de múltiples pasos del ciclo intracelular Coxiella, proporcionando una visión global de las estrategias desarrolladas por esta bacteria invadir, replicarse y persistir en las células infectadas. El método descrito aquí se basa en dos técnicas bien establecidas, mutagénesis de transposones y ensayos basados ​​en fluorescencia, que se han aplicado con éxito para el estudio de patógenos bacterianos. La combinación de estas técnicas en el contexto de las pantallas de alto rendimiento / alto contenido nos permite evaluar los efectos de un elevado número de mutaciones bacterianas mediante el análisis de un número muy elevado de eventos (típicamente 15.000 células infectadas por mutaciones bacterianas son fotografiados y analizados). Esto proporciona un importante análisis estadístico de eventos tales como la invasión bacteriana de las células huésped y la replicación intracelular, que son, por naturaleza, sujetos a una alta variabilidad. Es importante tener en cuenta que las líneas celulares distintas de epithelial se puede utilizar para este tipo de cribado. Sin embargo, las células epiteliales planas y grandes son óptimas para análisis de imagen como orgánulos de la célula huésped son más fáciles de detectar. Debido a que la mayoría de los microscopios automatizados puede manejar automáticamente un gran número de platos, prácticamente no hay límites para el número de mutantes que se proyectará simultáneamente. Dependiendo del patógeno, la lata usuario privilegio el uso de un epifluorescencia o un microscopio confocal. El tiempo de adquisición de la imagen dependerá sobre todo de la sensibilidad de la cámara microscopio, en el número de campos adquiridos por pocillo y en el número de canales adquiridos por campo de visión. El usuario puede decidir cómo ajustar estos factores para optimizar el protocolo de cribado. Como ejemplo, tenemos fotografiado uno de 96 pocillos placa / hr utilizando las condiciones indicadas en el punto 5.1. Análisis de la imagen depende en gran medida de la máquina (o grupo de máquinas) que se utiliza. Utilizamos un 12 núcleos (2 x 3.06 GHz 6-Core), estación de trabajo de RAM 48 GB. Esta máquina requiere aproximadamente 40 minutos para analizar las imágenes adquiridas de una placa. Un aspecto importante a tener en cuenta en el desarrollo de estos ensayos es la puesta en marcha de nuevo (o la optimización de los existentes) protocolos para permitir la manipulación y el procesamiento de un gran número de muestras. Un ejemplo típico es el desarrollo del enfoque de PCR colonia único cebador, lo que nos permitió amplificar rápidamente y fragmentos de ADN Coxiella secuencia que contienen el sitio de inserción de cada transposón, desde muestras muy pequeñas. Basándonos en nuestra experiencia, la alta fidelidad de la polimerasa tiene que ser cuidadosamente seleccionados y probados a fin de obtener resultados reproducibles. La única limitación de este enfoque puede ocultar en la observación de que, en la mayoría de los casos, aproximadamente el 30% de las muestras procesadas no son explotables, ya sea debido a la PCR o los pasos de secuenciación. Sin embargo, teniendo en cuenta que el aislamiento de nuevos mutantes de transposón Coxiella no es un paso limitante de la velocidad, esto no repreenviado un problema importante. Del mismo modo, el desarrollo de un ensayo fiable para cuantificar la concentración bacteriana de las poblaciones de mutantes ha sido clave para este enfoque. Debido a la tendencia de Coxiella a agregarse cuando en suspensión, el uso de lecturas de densidad óptica no es aplicable para calcular la concentración de las culturas Coxiella y la única alternativa existente era PCR cuantitativa (qPCR). Aquí, el uso de un agente de intercalación de ADN marcado con fluorescencia aceleró significativamente bacterias cuantificación. Este enfoque también puede tomar ventaja de la utilización de líneas celulares estables que expresan marcadores fluorescentes para varios compartimentos intracelulares dependiendo del patógeno utilizado. Otro aspecto importante es el uso de medios de cultivo celular exento de rojo de fenol. Hemos observado que este indicador de pH tiene una fluorescencia natural que abarca el espectro rojo y verde que satura la señal grabada en el lector de fluorescencia automatizado. Tél estrategia que aquí se presenta se basa en la mutagénesis de transposones azar. Para los mutantes de interés, se recomienda validar transposiciones únicos (y clonalidad) mediante Southern blot y PCR amplificaciones de la zona de inserción del transposón. Además de los equipos descritos en la sección de protocolo, equipos interesados ​​en utilizar el enfoque de selección que aquí se presenta, se llevarán una gran ventaja en la puesta en marcha de una base de datos relacional para la recopilación de datos, un servidor de almacenamiento de datos y una estación de trabajo para el análisis de imágenes rápida. Es importante destacar que el método aquí descrito es adecuado para el estudio de otros patógenos bacterianos intracelulares siempre que exista un método de mutagénesis aleatoria para el patógeno, las líneas celulares pueden ser infectadas por el patógeno y éste muestra un fenotipo específico durante la infección.

La bacteria Coxiella burnetii endémica emergente es responsable de grandes brotes de fiebre Q, una zoonosis parecida a la gripe debilitante con la salud graves e impacto económico 1. Los principales reservorios de Coxiella son animales domésticos y de granja, y se estima que más del 90% de las vacas lecheras en los EE.UU. llevar C. burnetii 2. Los seres humanos son huéspedes accidentales que están infectados por inhalación de aerosoles contaminados. Fiebre Q humano se manifiesta ya sea como una enfermedad aguda o crónica, que puede tener complicaciones fatales con una tasa de mortalidad de llegar a 65% de 1,3. Con una dosis infecciosa de 1 - 10 organismos, Coxiella es el patógeno más infecciosa conocida y ha sido investigado como un arma potencial bio 4. El reciente brote explosivo de la fiebre Q en los Países Bajos (2007 - 2010), con casos crecientes de 182 a más de 2.000 por año, se erige como un ejemplo de la severa virulencia de este patógeno5. La notable eficacia de infecciones Coxiella probablemente se asocie con su resistencia al estrés ambiental, combinado con su adaptación única a las células huésped. De hecho, Coxiella está presente en el medio ambiente en forma de pequeñas variantes metabólicamente inactivos celulares (SCV), que son notablemente resistentes a varias condiciones duras (desecación, temperatura, etc.). SCVs son hasta tomada por las células fagocíticas a través de α V β 3 integrinas 6 mientras que la invasión de células no fagocíticas está mediada por la Coxiella adhesión / invasión OmpA 7 y un receptor aún no identificado. Tras la absorción, Coxiella reside en vacuolas ajustados, positivos para los marcadores endosomales primeros Rab5 y EEA1 8. Las bacterias responden a la acidificación endosomal convirtiendo a las variantes de células grandes metabólicamente activas (LCV) y la activación de un sistema de secreción tipo 4 Dot / ICM (T4SS) 9, Altamente homóloga a la de Legionella pneumophila 10. La secreción de efectores Dot / ICM permite Coxiella para generar un compartimento ácida gran LAMP1-positivo que contiene enzimas lisosomales activos donde las bacterias pueden prosperar y proteger activamente las células infectadas de la apoptosis 11. Por lo tanto, el ciclo intracelular de Coxiella es controlado por la translocación mediada por Icm Dot / de efectores bacterianos 12, sin embargo, los factores microbianos implicados en la invasión de células huésped, la replicación bacteriana y la difusión de la infección siguen siendo en gran medida desconocido. Combinando mutagénesis de transposones y ensayos basados ​​en fluorescencia, estamos desarrollando métodos imparciales para la identificación simultánea de factores bacterianos implicados en los pasos principales de infecciones Coxiella: 1) la internalización en las células huésped, 2) la replicación intracelular, 3) de propagación de célula a célula y 4) la persistencia. Hasta la fecha, hemos proyectado más de 1.000 mutations en 500 secuencias Coxiella codificación, que nos proporcionaron conocimientos sin precedentes en las interacciones huésped-patógeno que regulan Coxiella patogénesis 7. De nota, este enfoque puede ser aplicado al estudio de otros patógenos intracelulares que comparten características de biología celular con Coxiella.

<table><tbody><tr><td>Ácido cítrico</td><td>Sigma</td><td>C0759-500G</td><td>ACCM-2 componente medio</td></tr><tr><td>Citrato de sodio</td><td>Sigma</td><td>S4641-500G</td><td>ACCM-2 componente medio</td></tr><tr><td>Fosfato de potasio</td><td>Sigma</td><td>60218-100G</td><td>ACCM-2 componente medio</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Sigma</td><td>M2670-100G</td><td>ACCM-2 componente medio</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma</td><td>C5080-500G</td><td>ACCM-2 componente medio</td></tr><tr><td>Sulfato de hierro</td><td>Sigma</td><td>F8633-250G</td><td>ACCM-2 componente medio</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma</td><td>S9625-500G</td><td>ACCM-2 componente medio</td></tr><tr><td>L-cisteína</td><td>Sigma</td><td>C6852-25G</td><td>ACCM-2 componente medio</td></tr><tr><td>Bacto Neopeptona</td><td>BD (Beckton-Dickinson)</td><td>211681</td><td>ACCM-2 componente medio</td></tr><tr><td>Ácidos casamino</td><td>BD (Beckton-Dickinson)</td><td>223050</td><td>ACCM-2 componente medio</td></tr><tr><td>Metil-B-ciclodextrina</td><td>Sigma</td><td>C4555-10G</td><td>ACCM-2 componente medio</td></tr><tr><td>RPMI con glutamax</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td>ACCM-2 componente medio</td></tr><tr><td>RPMI con glutamax, sin rojo fenol</td><td>Gibco</td><td>32404-014</td><td>Para cultivo celular e infección</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>GE SH30071 sanitaria</td><td></td><td>Para cultivo celular</td></tr><tr><td>Tripsina EDTA (0,25%)</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td>Para cultivo celular</td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma</td><td>47036</td><td>Para tinción por inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>Cloruro de amonio</td><td>Sigma</td><td>A9434</td><td>Para tinción por inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>Para tinción por inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>Cubeta de electroporación 0,1 cm</td><td>Eurogentec</td><td>ce0001-50</td><td>Para la transformación Coxiella</td></tr><tr><td>Tubos con tapa de rosca Trackmates con tapones</td><td>Thermo Scientific</td><td>3741</td><td>Tapón de rosca con código de barras 2D</td></tr><tr><td>Microplaca de 96 pocillos con paredes y fondo negros</td><td>Greiner</td><td>655076</td><td>Fondo plano y oscuro, para cuantificación de dsDNA</td></tr><tr><td>Microplaca de PCR de 96 pocillos</td><td>Biorad</td><td>2239441</td><td>Placa de 96 pocillos libre de ADNasa/ARNasa</td></tr><tr><td>, pocillo profundo</td><td>Labcon</td><td>949481</td><td>Para infecciones Coxiella mutantes</td></tr><tr><td>PicoGreen</td><td>Life Technologies</td><td>P7581</td><td>Para la cuantificación de dsDNA</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284-500ML</td><td>Para la cuantificación de dsDNA</td></tr><tr><td>Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td>Para solo colonia de cebadores PCR</td></tr><tr><td>Celltracker Red CMTPX</td><td>Life Technologies</td><td>C34552</td><td>Para la imagen</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-LAMP1</td><td>Sigma</td><td>94403-1ML</td><td>Para tinción por inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma</td><td>L1418</td><td>Para la imagen</td></tr><tr><td>Lector de microplacas de fluorescencia Infinite 200 Pro</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio automatizado de epifluorescencia Cellomics</td><td>Termo Científico</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generación y multi-fenotípicos cribado de alto contenido de<em&gt; coxiella burnetii</em&gt; transposón mutantes

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

La invasión y la colonización de las células huésped por patógenos bacterianos dependen de la actividad de un gran número de proteínas procariotas, definido como factores de virulencia, que puede subvertir y manipular las funciones de acogida clave. El estudio de las interacciones huésped / patógeno tanto, es extremadamente importante comprender las infecciones bacterianas y desarrollar estrategias alternativas para hacer frente a las enfermedades infecciosas. Este enfoque, sin embargo, requiere el desarrollo de nuevos ensayos de alto rendimiento para el, la identificación automatizada imparcial y caracterización de determinantes de virulencia bacteriana. A continuación, describimos un método para la generación de una biblioteca mutante GFP-etiquetados por mutagénesis de transposones y el desarrollo de cribado de alto contenido de enfoques para la identificación simultánea de múltiples fenotipos transposón-asociado. Nuestro modelo de trabajo es la bacteriano patógeno intracelular Coxiella burnetii, el agente etiológico de la fiebre Q zoonosis, que se asocia con severe brotes con la consiguiente carga sanitaria y económica. La naturaleza intracelular obligado de este patógeno ha, hasta hace poco, obstaculizado gravemente la identificación de los factores bacterianos implicados en las interacciones de patógenos de acogida, por lo que de Coxiella el modelo ideal para la implementación de enfoques de alto rendimiento / alto-contenido.

Tras el aislamiento de mutantes de transposón, sola colonia cebador de PCR es un método robusto y de alto rendimiento para identificar el sitio de inserción del transposón para cada mutante. Este enfoque se deriva de un protocolo típico PCR anidada pero aquí un único cebador hibrida específicamente y / o no específicamente a la plantilla de ADN dependiendo de la rigurosidad de la temperatura de recocido (Figura 1A). Los productos típicos de PCR consisten en múltiples fragmentos de ADN, la mayoría de los cuales son específicos (Figura 1B). El uso de un cebador de secuenciación diferente que hibrida aguas arriba derecha de la ITR transposón, y aguas abajo de la secuencia reconocida por el cebador de amplificación proporciona especificidad para la etapa de secuenciación (Figura 1C). Software automatizado para el análisis de secuencias alinea las secuencias obtenidas en el genoma Coxiella proporcionar el sitio exacto del transposón inserciones (Figura 1C). Todas las inserciones de transposones pueden ser entonces annotated sobre el genoma Coxiella (Figura 1D). Cada mutante Coxiella se aísla y se amplifica axénicamente en ACCM-2 medio antes de su almacenamiento o de detección. La Figura 2 ilustra un ejemplo de 38 mutantes de transposón en 16 puntos / icm genes Coxiella (Figura 2A). Para evaluar la viabilidad de los mutantes de Coxiella, curvas de crecimiento axénicos se obtienen mediante el muestreo de cultivos bacterianos durante 7 días después de la inoculación y aplicando el ensayo de concentración bacteriana se describe en 1.5 (Figurie 2B). Mutantes amplificados se incuban a continuación con las células epiteliales, por triplicado en placas de 96 pocillos durante 7 días. Todos los mutantes generados Coxiella siendo GFP-etiquetados, las curvas de crecimiento intracelular se obtienen mediante la medición de la intensidad de fluorescencia de GFP de cada pozo, cada 24 horas, y el trazado de los valores medidos como una función del tiempo (Figura 2C). Intrcurvas de crecimiento acelulares proporcionan un análisis cuantitativo de los fenotipos asociados con cada inserción del transposón en el genoma Coxiella. Para agregar información cualitativa sobre los mismos mutantes transposón, se optó por la adquisición de imágenes y análisis automatizado. Siete días después de la infección, las placas son fijos, procesado por inmunofluorescencia como se describe en 4 y se analizaron usando un microscopio de epifluorescencia automatizado como se describe en 5. automatizada de software de análisis de imágenes como CellProfiler (Broad Institute, <a href="http://www.cellprofiler.com/" target="_blank">www.cellprofiler.com</a> ) procesa los canales adquiridos independientemente y segmentos identificados objetos para el análisis comparativo (Figura 3). Esto permite la identificación y caracterización morfológica de núcleos de células huésped, los contornos de células, lisosomas y Coxiella colonias (Figura 3 paneles superiores). La correlación de colonias Coxiella con las células y permite que los lisosomas identificatiy el análisis morfológico específico de Coxiella vacuolas -Con (que son LAMP1 positivo, Figura 3 panel inferior izquierdo). La correlación de colonias Coxiella con contornos célula huésped permite la identificación y el análisis morfológico específico de las células infectadas (Figura 3 panel central inferior). Por último, los 4 canales se combinan para fines de control de calidad y la ilustración (Figura 3 panel de abajo a la derecha). Los datos obtenidos de análisis de imagen automatizado se pueden trazar uno contra el otro para obtener &quot;gráficos de dispersión multi-fenotípicos&quot;. Como ejemplo, en la Figura 4A, el área media (en m 2) de las colonias de Coxiella se representa gráficamente frente al número de colonias por célula (Figura 4A), con el fin de identificar mutaciones que afectan a la replicación intracelular de Coxiella (fenotipo de replicación) y / o la capacidad de las bacterias para invadir las células huésped (internafenotipo lización). Se utilizó el análisis estadístico para definir las regiones en el gráfico de dispersión resultante correspondiente a (-4 &lt;Z-score ≤ -2) y grave (Z-score ≤ -4) fenotipos leves. Se observaron mutantes en 3 grupos principales: mutaciones que dieron como resultado un crecimiento intracelular defectuosa de Coxiella fueron agrupados en la parte más a la izquierda de la parcela (Figura 4A, rosa y puntos rojos); mutaciones que afectaban internalización Coxiella en las células se agruparon en la parte inferior de la parcela (Figura 4A, azul claro y oscuro puntos) y, finalmente, puntos verdes en el extremo derecho de la región de la trama corresponden a mutaciones que resultan en fenotipos no significativas ( Z-score&gt; -2). Es importante destacar que los mutantes que no logran replicar, pero todavía son capaces de invadir las células huésped, se detectan después de 7 días de la infección como bacterias individuales o pequeñas colonias, junto a la sede de los núcleos celulares (Figura 4C, segundo panel). Por lo tanto, el tamaño de Coxiella &quot;coloempre- &quot;se verá afectado de manera significativa, pero el número de células infectadas no variará en comparación con las células infectadas WT Coxiella. Por el contrario, las mutaciones que afectan a la capacidad de Coxiella para invadir las células huésped resultan en una disminución en el número de colonias / célula. Cuando este número es significativamente inferior a 1, indica que, en promedio, hay una disminución en el número total de células infectadas. Alternativamente, el área media (en m 2) de las colonias de Coxiella puede registrarse en el número de células huésped sobrevivían a la infección (Figura 4B), para identificar mutaciones que confieren citotoxicidad para Coxiella (fenotipo citotóxico). Como el anterior, se utilizó el análisis estadístico para definir las regiones en el gráfico de dispersión resultante correspondiente a (-4 &lt;Z-score ≤ -2) y grave (Z-score ≤ -4) fenotipos leves. La mayoría examinados mutaciones no afectó significativamente la supervivencia celular, independientemente de la replicación bacteriana dentro de anfitrióncélulas (Figura 3B puntos verdes). 37 mutaciones supervivencia de la célula huésped ligeramente afectada (Figura 3B, puntos rojos de luz), y 7 mutaciones fueron particularmente perjudiciales para el anfitrión de la supervivencia celular (Figura 3B, puntos de color rojo oscuro). Tenga en cuenta que los parámetros adicionales obtenidos por el procedimiento de análisis de imágenes automatizado se pueden utilizar para derivar otros apartados, de acuerdo a las necesidades experimentales. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" width="700" /> Figura 1:. Secuenciación y anotación de los mutantes de transposón Coxiella (A) sola colonia cebador de PCR se utiliza para amplificar fragmentos de ADN que contienen el sitio de inserción del transposón. Un cebador de amplificación (Amp) se utiliza tanto como un cebador específico y no específico dependiendo de la rigurosidad de la temperatura de recocido. (B) Resultado Típico de colonia única cebador de PCR. Cada Reactien produce una serie de fragmentos de tamaño variable, algunos de los cuales contienen el sitio de inserción del transposón; algunos otros son amplificadas al azar como subproductos del ciclo de PCR de baja rigurosidad. (C) El uso de un cebador de secuenciación (SEC) que se hibrida con la secuencia de transposón permite la secuenciación de los fragmentos de interés. Software (D) Análisis de secuencias permite la anotación automática de transposón inserciones en el genoma bacteriano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" width="700" /> Figura 2:. Axénicas y crecimiento intracelular de mutantes transposón Coxiella (A) En la pantalla del piloto, hemos aislado, secuenciado y apantallado 38 mutantes transposón en 16 g núcleoenes del sistema de secreción dot / icm Coxiella (indican en rojo). (B) A fin de evaluar la viabilidad de cada mutante de transposón, el crecimiento de cada aislamiento en medio de cultivo axénicos se monitoriza durante 8 días utilizando un marcado con fluorescencia agente de intercalación de ADN. (C) Cada mutante se utiliza entonces para infectar a las células epiteliales. A medida que el transposón posee un cassette GFP, el crecimiento de bacterias intracelulares se controla más de 7 días de la infección siguiendo las variaciones de la fluorescencia de GFP asociada con la replicación Coxiella, utilizando un lector de microplacas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" width="700" /> Figura 3: automatizado de análisis de imágenes de infecciones Coxiella Un auto.microscopio de epifluorescencia acoplado se utiliza para la imagen 21 posiciones por pocillo por triplicado de placas de 96 pocillos. Los segmentos de software de análisis de imágenes de objetos en cada uno de los canales adquiridos para la cuantificación y el análisis. En todos los casos, se excluyen los objetos que tocan la frontera de las imágenes. (A) El canal de Hoechst se utiliza para identificar los núcleos de la célula huésped (en el círculo en verde). (B) Estos son utilizados como semillas para identificar los contornos de la célula huésped en el canal de Cy3 (la posición de los núcleos es un círculo en azul, los contornos celulares están en verde). (C) El canal de Cy5 se utiliza para identificar compartimentos LÁMPARA1-positivo (un círculo en verde); Sólo los objetos incluidos en los contornos celulares previamente identificados (en rojo) se conservan para el análisis de imágenes. (D) El canal de GFP se utiliza para identificar colonias Coxiella (en el círculo en verde). (E) correlacionar colonias Coxiella con compartimentos LÁMPARA1-positivo permite la identificación de Coxiella </em&gt; vacuolas -Con (CCV); Sólo los objetos incluidos en los contornos celulares previamente identificados (en verde) se conservan para el análisis de imágenes. (F) correlacionar colonias Coxiella con contornos celulares permite la identificación de células infectadas (pseudocoloreada). (G) Imágenes adquiridas en los 4 canales de fluorescencia (que corresponde a las colonias Coxiella (verde), núcleos de las células huésped (azul), membrana plasmática de la célula huésped (gris), compartimentos LÁMPARA1-positivo (rojo)) se fusionan y se utiliza para la ilustración y la calidad control. Escala de Barras 10 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" width="700" /> Figura 4: la identificación a gran escala de los factores que intervienen en Coxiella huésped / patógeno interactúaniones. (A) La zona media (en m 2) de las colonias de Coxiella se traza contra el número relativo de colonias por células, para identificar de replicación y de internalización fenotipos de interés. Los puntos verdes representan fenotipos que se desvían de WT Coxiella por un Z-score&gt; -2 (no significativo). Rosa y puntos azules claros representan replicación y de internalización fenotipos respectivamente, con una puntuación Z entre -2 y -4 (fenotipos leves). Puntos azules oscuros Roja y representan fenotipos con un Z-score ≤ -4 (fenotipos fuertes). (B) El área media (en m 2) de las colonias de Coxiella se representó frente al número total de células (infectadas y no infectadas) que sobrevivieron 7 días de la infección para estimar el efecto citotóxico resultante de las inserciones de transposones. Los puntos verdes representan fenotipos que se desvían de WT Coxiella por un Z-score&gt; -2 (no significativo). Los puntos rosados ​​representan ph citotóxicaenotypes con una puntuación Z entre -2 y -4 (fenotipos leves). Los puntos rojos representan fenotipos citotóxicos con un Z-score ≤ -4 (fenotipos fuertes). Las flechas indican mutantes ilustrados por la letra minúscula correspondiente en C. (C) Imágenes representativas de la replicación, la internalización y fenotipos citotóxicos. En todos los casos, los núcleos de células huésped están en rojo, Coxiella colonias son de color verde. Escala de Barras 50 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Coxiella burnetii es una bacteria intracelular gramnegativos obligado responsable de la fiebre Q enfermedad zoonótica. Aquí se describen los métodos para la generación de mutantes de transposón fluorescente Coxiella así como la identificación automatizada y el análisis de la internalización, la replicación y citotóxicos fenotipos resultantes.

Generación y multi-fenotípicos cribado de alto contenido de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; transposón mutantes

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

El objetivo general de este procedimiento es identificar a gran escala los factores COE implicados en las etapas clave del ciclo infeccioso, incluyendo la entrada en las células huésped, la generación de un nicho replicativo bacteriano y la persistencia. Esto se logra primero generando una biblioteca de dobles mutantes GF PT mediante mutagénesis por transposición.A continuación, las células huésped se infectan con cada mutante aislado. Luego, la replicación intracelular de cada mutante se sigue en tiempo real mediante un lector de microplacas para identificar las mutaciones que son más perjudiciales para la infección por coxiella. Finalmente, las células infectadas con coxiella se analizan mediante microscopía automatizada.En última instancia, el análisis automatizado de imágenes permite la caracterización morfológica de cada fenotipo obtenido, asociando así cada gen mutado con una función putativa en el ciclo infeccioso de Coxiella. Este método puede ayudar a abordar cuestiones clave en el campo de las interacciones entre hospedador y patógeno, como la identificación a gran escala de los genes esenciales de un patógeno determinado necesarios para interactuar con la célula completa y secuestrar sus maquinarias moleculares en beneficio propio. La demostración visual de este método es fundamental, ya que el aislamiento y la siembra de colonias de COE son difíciles de realizar.De hecho, el COE forma colonias muy pequeñas que deben extraerse cuidadosamente del ACCM blando dos aro. Cómo este método puede proporcionar información sobre la infección por coccus. También puede aplicarse a otras bacterias patógenas intracelulares, como salmonella, burel, mycobacterium, entre otras.Después de transformar Coxiella competente con plásmidos de transposón y transposasa según el protocolo descrito, para aislar mutantes individuales, prepare los aros inferiores mezclando 10 mililitros de aros fundidos al 0,5 % con 10 mililitros de ACCM 2X en una cabina de seguridad microbiológica (CSM) y agregue inmediatamente los antibióticos adecuados, vierta la mezcla en una placa de Petri y deje enfriar destapada durante 30 minutos, seguido de un secado al aire de 20 minutos. Para preparar los aros superiores, mezcle 1,25 mililitros de ACCM 2X con 0,75 mililitros de agua en un tubo de poliestireno de 15 mililitros. Añada los antibióticos apropiados e incube a 37 grados Celsius.Luego, agregue de uno a 100 microlitros de cultivo bacteriano y mezcle mediante vortex durante cinco segundos. A continuación, agregue 0,5 mililitros de la mezcla de aros fundida e inmediatamente viértalos sobre la capa inferior de aros. Deje enfriar la placa durante 20 minutos.Coloque la tapa encima e incube a cuatro grados Celsius durante 20 minutos para ayudar a solidificar. Luego retire la tapa y seque la placa al aire durante 20 minutos antes de transferirla a un incubador húmedo a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono y 2,5% de oxígeno durante seis a siete días. Una vez que las colonias sean detectables, recópilas cortando el extremo de una punta de pipeta de un mililitro y utilícela para aislar trozos que contengan colonias individuales.Luego transfiera las muestras a los pocillos de una placa de 24 pocillos que contenga 1,5 mililitros de accm dos. Después de preparar una curva patrón según el protocolo descrito en el texto, cuantifique cada suspensión bacteriana dispensando cinco microlitros de Triton X-100 al 10 % por pocillo. En una microplaca de 96 pocillos con paredes y fondo negros, agregue 50 microlitros de las suspensiones bacterianas a cada pocillo e incube en un agitador orbital durante 10 minutos.A temperatura ambiente, utilice un tampón XTE para diluir el reactivo de cuantificación de ADN de doble cadena uno a 200, y agregue 55 microlitros del reactivo diluido a cada muestra. En la placa microplaca de 96 pocillos, agite bien con un agitador de placas antes de incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante dos a cinco minutos, y mida la fluorescencia de las muestras utilizando un lector de microplacas con fluorescencia y filtros para longitudes de onda estándar de fluoresceína. Para obtener la gráfica de concentración de ADN bacteriano, divida las lecturas de fluorescencia en la curva patrón previamente preparada, divida la concentración de ADN por la masa del genoma de Coxiella para obtener la concentración bacteriana.Exprese los resultados en equivalentes genómicos por mililitro tras realizar una PCR de colonias con un solo cebador y la secuenciación de ADN según el protocolo descrito en el texto. Utilizando software de análisis de secuencias, cargue el genoma completo anotado de Coxiella Burnett I 4 93 NM uno con la función de alineación al genoma de referencia, cargue y alinee los resultados de secuenciación mediante blast N y determine el sitio de transposición. Después de preparar una suspensión de células Vero de 10 a la quinta células por mililitro en medio RPMI, según el protocolo descrito en el texto, distribuya 100 microlitros de la suspensión en cada pocillo de una placa negra de 96 pocillos con fondo plano y transparente, centrifugue la placa a 400 × g durante cinco minutos y luego incube a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono durante la noche.Al día siguiente, retire las placas de 96 pocillos a temperatura ambiente que contienen los mutantes de Coxiella y diluya 150 microlitros de las suspensiones bacterianas en 300 microlitros de RPMI sin rojo de fenol ni SFB en una placa de 96 pocillos con pocillos profundos. A continuación, retire el medio de las células Vero y agregue 100 microlitros por pocillo de los mutantes de Coxiella diluidos. Utilice el pocillo A1 como control negativo y los pocillos A2 y A3 como controles positivos. Usando un portaplacas para centrífuga hermético al aerosol, centrifugue la placa a 400 × g y temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego, después de incubar la placa a 37 °C en una atmósfera humificada con 5% de dióxido de carbono durante dos horas, reemplace el medio que contiene las bacterias con 100 microlitros por pocillo de medio RPMI completo fresco. Lea la fluorescencia con un lector de microplacas con filtros para fluoresceína.Mida la fluorescencia de GFP cada día durante siete días. En el día siete posterior a la infección, retire el medio de la placa y sustitúyalo por 50 microlitros por pocillo de medio completo fresco que contenga una dilución de uno a 1000 de un colorante fluorescente permeable a células. Incube las células durante 30 a 60 minutos; tras la incubación, sustituya el medio por 50 microlitros por pocillo de 4 % PFA en PBS e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego, retire el tampón que contiene PFA antes de usar PBS para lavar los pocillos tres veces. Tras eliminar el último lavado, agregue 50 microlitros de solución bloqueadora a cada pocillo e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos.Luego, reemplace la solución de bloqueo con 40 microlitros por pocillo, una solución de bloqueo fresca y una dilución 1:500 del anticuerpo anti-lamp1. Después de incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos, retire la solución y utilice un lavador de placas para lavar los pocillos cinco veces, aplicando 100 microlitros por pocillo de PBS. A continuación, agregue 40 microlitros por pocillo de solución de bloqueo que contenga el anticuerpo secundario fluorescente adecuado y Hoechst 33258 a cinco microgramos por mililitro.Incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. Lave las muestras cinco veces y deje el último lavado con PBS en los pocillos para evitar que se sequen. Para realizar la adquisición de imágenes, utilice un microscopio automático de fluorescencia epiescopia equipado con un objetivo de 20 x y canales de 3 4 88 5 55 y seis 15 nanómetros.Adquiera 21 campos independientes por pocillo para obtener imágenes de un mínimo de 5.000 células por muestra. Aplique el enfoque automático utilizando el canal de los núcleos de las células huésped como referencia. Finalmente, utilice análisis automatizado de imágenes para extrapolar una serie de características relevantes a partir de las imágenes adquiridas.Esta figura ilustra 38 transposones en mutantes de 16 puntos en el genoma de Coxiella en curvas de crecimiento que evalúan la viabilidad de los mutantes, las cuales se muestran aquí. Las curvas de crecimiento intracelular para mutantes de Coxiella incubados con células epiteliales proporcionan un análisis cuantitativo de los fenotipos asociados con inserciones de transposón en el genoma de Coxiella. En esta figura, se realizó una adquisición automatizada de imágenes para identificar y caracterizar núcleos celulares huésped, contornos celulares, lisosomas y colonias de Coxiella.La correlación de colonias de Coxiella con células y lisosomas permite el análisis morfológico de vacuolas que contienen Coxiella. La correlación de colonias de Coxiella con los contornos de las células huésped permite el análisis morfológico de células infectadas. Finalmente, se fusionan los cuatro canales.El área promedio de las colonias de Coxiella se grafica frente al número de colonias por célula con el fin de identificar mutaciones que afecten la replicación intracelular de Coxiella y/o la capacidad de las bacterias para invadir células hospedadoras. Se observaron mutantes en tres grupos: mutaciones que afectaron el crecimiento intracelular de Coxiella, la internalización de Coxiella en células y fenotipos no significativos. Aquí, el área promedio de las colonias de Coxiella se grafica frente al número de células hospedadoras que sobreviven la infección, con el fin de identificar mutaciones que confieran citotoxicidad a Coxiella tras su desarrollo.Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de las infecciones bacterianas exploraran las interacciones entre el hospedador y el patógeno a gran escala, e identificaron los objetivos del hospedador y bacterianos para el desarrollo de nuevas terapias contra enfermedades infecciosas.

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Este video muestra un método para evaluar el crecimiento intracelular de mutantes de Coxiella marcados con GFP dentro de células epiteliales cultivadas. El fenotipo mutante se visualiza mediante inmunotinción y microscopía de epifluorescencia, lo que permite estudiar el efecto de la mutación sobre el crecimiento intracelular.

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Aprende a generar mutantes de transposón fluorescentes de Coxiella burnetii y analizar sus fenotipos de internalización, replicación y citotoxicidad mediante microscopía automatizada. Este método permite identificar genes esenciales en el ciclo infeccioso de este patógeno intracelular.

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