Simultáneo Ex vivo Pruebas funcionales de dos retinas por In vivo Sistema Electrorretinograma

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la función de las células de una retina de ratón aislada utilizando un sistema comercial in vivo, electrorretinograma o ERG junto con un adaptador ex vivo. Esto se logra diseccionando primero las retinas de ambos ojos de un ratón. El segundo paso es montar la retina con el lado del fotorreceptor hacia arriba en un portamuestras.

A continuación, el portamuestras se coloca en una placa calefactora en el sistema ERG in vivo y se conecta a la perfusión controlada por gravedad. El paso final es conectar los electrodos del portamuestras a un amplificador y estimular las retinas con luz para obtener respuestas ERG. En última instancia, el ERG ex vivo se utiliza para mostrar cómo se pueden diseccionar las vías de señalización mediadas por bastones y conos utilizando farmacología y protocolos especializados de estimulación lumínica.

La principal ventaja de esta técnica sobre otros métodos existentes, como los in vivo, los ERG o los registros de una sola célula, es que proporciona una mayor relación señal/ruido, registros más largos y estables, así como la posibilidad de manipulaciones farmacológicas fáciles y cuantitativas. Además, este método se puede utilizar para evaluar la eficacia y la seguridad de los medicamentos diseñados para tratar enfermedades de la retina en retinas de primates y donantes humanos. Al menos con un día de anticipación, modifique la parte inferior del portamuestras pegando un poco de papel de filtro gris negro en la parte superior de las cúpulas. Use epoxi de cinco minutos de dos componentes a lo largo de los bordes de las cúpulas y, si es necesario, use un microscopio de disección Después de que el pegamento se seque, presione el papel de filtro hasta que quede plano contra la cúpula.

Será bueno para aproximadamente un mes de grabación. A continuación, retire el papel y limpie la cúpula con etanol al 70%. Ahora, para preparar el electrodo primero, llene los canales de electrodos con solución de electrodos.

Trate de evitar introducir burbujas de aire. A continuación, atornille los electrodos de pellets en los canales de los electrodos. Conecte las piezas superior e inferior del portamuestras con cuatro tornillos y llene las líneas de perfusión con solución de electrodos.

A continuación, mida la resistencia y el voltaje entre los cables de los pares de electrodos. La resistencia debe estar por debajo de 100 kilo ohmios y el voltaje por debajo de 10 milivoltios. Si los canales están libres de burbujas y los electrodos están en buenas condiciones, ahora vierta de 400 a 700 mililitros de medio de perfusión en una botella de vidrio para la perfusión de la muestra.

Además, vierta 300 mililitros para la disección y guárdelo en un refrigerador. A continuación, coloque el tubo de perfusión a través del bloque del intercambiador de calor y coloque el bloque precalentado en la placa calefactora. Ahora encierre la botella con una tapa que tiene una entrada de gas y una entrada de tubo de perfusión.

La entrada de gas debe estar unida a una piedra difusora. Coloque el frasco precalentado donde se mantendrá el medio de perfusión a 37 grados centígrados. A continuación, cebe las líneas de perfusión llenándolas con medios de perfusión para iniciar el flujo impulsado por la gravedad en un sistema de ciencia ocus.

Coloque el frasco dentro de la jaula de Faraday para minimizar el ruido y utilice largas líneas de salida de perfusión del portamuestras. Colocados muy por debajo del nivel del portamuestras y la botella de perfusión, protegen estas líneas de salida y conectan el blindaje a la tierra del amplificador a través de la jaula de Faraday. Para evitar el acoplamiento del ruido electromagnético a la señal ERG, conecte la sonda de temperatura a la etapa de calentamiento.

Ahora, usando reguladores, ajuste el flujo de solución de tres a cinco mililitros por minuto. Por último, si es necesario, introduzca el coche y el gas en la solución y ajuste el regulador para que haya un flujo constante de burbujas de la piedra difusora. Comience vertiendo unos 200 mililitros de solución de perfusión fría en una placa de Petri grande para que toda la parte inferior del portamuestras pueda sumergirse por completo.

Sacrificar a un animal criado bajo un ciclo de luz oscura de 12 o 12 horas y luego adaptado a la oscuridad durante seis a 12 horas antes de las grabaciones. Todos los siguientes procedimientos deben realizarse bajo luz roja o infrarroja tenue. Después de aislar cada ojo, colóquelos en el medio para ojos.

A continuación, transfiera un ojo a un pequeño trozo de papel de filtro sobre el papel. Sujétalo con unas pinzas y haz una hendidura aproximadamente al mismo nivel que el aura serrata de la hendidura. Corta a lo largo del aura serrata o en algún lugar más cercano al ecuador para extraer la córnea y el cristalino.

A continuación, retire la córnea y los extremos del cristalino y vuelva a colocar el ocular en el medio frío. Repite este mismo procedimiento con el otro ojo. Ahora, trabajando con una copa ocular, haga una pequeña incisión desde la parte superior hacia el nervio óptico.

Mantenga las tijeras entre la retina y la esclerótica para que la retina permanezca lo más intacta posible. A continuación, sujete la esclerótica a ambos lados de la incisión con dos pinzas y separe el tejido para separar la retina. Para aislar la retina, corte el nervio óptico y extraiga la retina con una cantidad mínima de contacto con su superficie distal.

Ahora, monte las retinas aisladas en las cúpulas del portamuestras. Primero, sumerja la parte inferior del portamuestras en la placa de Petri con las retinas disecadas. Siguiente diapositiva.

El fotorreceptor de la retina o el lado convexo hacia arriba sobre la cúpula. A continuación, levante suavemente el portamuestras para que la retina se adhiera al papel de filtro. A continuación, repita el procedimiento para la otra retina.

Ahora seque la placa del soporte con cuidado para evitar el ruido de diafonía y la derivación de la señal. Después de secar el soporte, enrosque la parte superior y llene los canales de perfusión con la solución de perfusión de una jeringa con una aguja. Coloque el portamuestras junto al bloque de intercambio de calor.

A continuación, conecte las líneas de perfusión de entrada y salida. Complete la configuración conectando los electrodos al amplificador ERG y conectando la unidad de control del estimulador al soporte de muestras. Uso de un adaptador Para obtener respuestas grandes y reutilizables, es importante realizar una disección y montaje cuidadosos de las retinas, así como mantener una perfusión estable y sin burbujas por encima de las retinas antes de recopilar datos.

Espere de 10 a 20 minutos para que la temperatura y la función de las retinas se estabilicen, las respuestas al flash se registraron a partir de retinas oscuras adaptadas de tipo C 57 negro seis utilizando diferentes soluciones de profusión estándar. Las formas de onda y la cinética de respuesta aparecieron similares en los medios ames y en los medios de bloqueo. La sensibilidad de los fotorreceptores de bastones también fue similar.

Por otro lado, en montones de solución de timbre tamponada sin respuesta de bicarbonato o carbógeno, las amplitudes fueron significativamente menores. La estabilidad de BWA también se vio comprometida a menudo en el timbre del montón. La adición de 40 micromolares de A PB eliminó eficazmente la onda B positiva.

Esto reveló una onda negativa grande y lenta que se ha atribuido a la actividad de las células de Mueller, agregando 100 micromolares de bario abolidos. Este componente revela la respuesta fotorreceptora de la señal ERG ex vivo. Este método se puede combinar con otras herramientas como la farmacología y la genética para responder preguntas sobre los mecanismos moleculares de la señalización de la retina y las enfermedades cegadoras en mamíferos, incluidas las retinas humanas.