Name: Simultáneo Ex vivo Pruebas funcionales de dos retinas por In vivo Sistema Electrorretinograma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Aprende a realizar electroretinogramas ex vivo en retinas aisladas de ratón para estudiar la función celular retiniana. Este método permite disecar vías de señalización de bastones y conos mediante farmacología.

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Este trabajo fue apoyado por el NIH subvenciones EY019312 y EY021126 (VJK), EY002687 al Departamento de Oftalmología y Ciencias Visuales de la Universidad de Washington, y por la investigación para prevenir la ceguera.

Todos los protocolos experimentales fueron de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por la Comisión de Estudios de Animales institucional de la Universidad de Washington. 1. Configuración de la perfusión y de muestras <ol><li> Preparar la solución para perfusión retina fresco en el día del experimento. Utilice agua destilada y desionizada. Utilice una de las tres soluciones siguientes. <ol><li> Prepare Bicarbonato que contiene &quot;solución (1 L): 1 botella de Ames Ames medios de comunicación y 1,9 g de NaHCO 3, </li><li> Preparar la solución de Locke (en mM): 112,5 NaCl, 3,6 KCl, 2,4 MgCl 2, 1,2 CaCl 2, 10,0 HEPES, 20,0 NaHCO 3, 3,0 Na succinato, 0,5 Na glutamato, 0,02 EDTA, y 10,0 glucosa, 0,1% de vitaminas MEM y amino ácidos </li><li> Solución de Ringer tamponada con HEPES Preparar (en mM): NaCl 133,3, KCl 3,3, 2,0 MgCl2, 1,0 CaCl 2, 10,0 glucosa, 0,01 EDTA, 12,0 HEPES, pHajustado a 7,5 con ~ 5,8 ml de NaOH 1 M, añadir 0,72 g / L de medio de cultivo Leibovitz L-15. Utilice 20 - 50 M DL-AP4 y 50 - 100 mM BaCl 2 para aislar la respuesta de los fotorreceptores con cualquier medio de perfusión. </li></ol></li><li> Preparar la solución para los electrodos 28 (en mM): NaCl 140,0, KCl 3,6, 2,4 MgCl2, 1,2 CaCl 2, 3, HEPES 0,01 EDTA y ajustar el pH a 7.4 a 7.5 con NaOH. Solución de electrodo se puede almacenar a temperatura ambiente durante varios meses. </li><li> Preparar y poner a prueba el soporte de la muestra. <ol><li> Pegue el papel de filtro negro / gris en la parte superior de las cúpulas de la parte inferior del soporte de la muestra (ver Figura 1 A). Spread de dos componentes 5 min pegamento epoxi cuidadosamente alrededor de los bordes de las tapas planas de las cúpulas. Si es necesario, hacerlo bajo microscopio de disección. </li><li> Espere hasta que el pegamento es casi seco (unos 4 minutos) y pulse el papel de filtro en las cúpulas utilizando un elemento plano. Papel de filtro pegamento al menos un día antes del experimento. Lospapel de filtro se puede utilizar varias veces, pero debe ser reemplazado después de un mes de grabaciones. Utilice etanol al 70% para limpiar cuidadosamente las cúpulas de cualquier residuo de pegamento antes de instalar el papel de sustitución. </li><li> Llenar los canales de electrodos con una solución de electrodo tratando de evitar las burbujas de aire y el tornillo electrodos de pellets cerrados con un adaptador roscado en los canales de los electrodos (ver figuras 1A y B). Conecte las piezas superior e inferior del soporte de la muestra con cuatro tornillos y llenar las líneas de perfusión con solución de electrodo. </li><li> Medir la resistencia y la tensión entre los conductores de cada par de electrodos con un multímetro (Figura 1B). La resistencia debe ser inferior a 100 Ωk y la tensión por debajo de 10 mV si los canales son sin burbujas y los electrodos están en buenas condiciones. </li></ol></li><li> Verter 400 a 700 ml de medio de perfusión en la botella de vidrio. Separar otros 300 ml a utilizar en la disección de las retinas y sla rompió en una nevera. Ajuste el tubo de perfusión en el bloque intercambiador de calor y coloque el bloque precalentado en la placa de calefacción (ver Figura 1D). </li><li> Incluya la botella con una tapa que tiene conexiones a CO 2 / O 2 gas (si se utiliza de Ames o Locke) y para la tubería de perfusión (ver Figura 1D). Precaliente la botella con los medios de comunicación a 37 o C y colocarlo en la placa de calentamiento o en la parte superior de la unidad de estimulación de la luz en el baño de agua a 37-39 ° C 17. <ol><li> Primer de las líneas de perfusión llenándolos de medios de perfusión para iniciar el flujo por gravedad. <ol><li> En el sistema de LKC, colocar la botella en la parte superior de la unidad estimuladora 17 para proporcionar un flujo gravitacional significativo que se ajusta entonces por los reguladores de caudal sin ser afectado por el nivel de reducción de la solución de perfusión en la botella durante el experimento. </li><li> En el sistema Ocuscience, coloque el perfusion botella dentro de la jaula de Faraday con el fin de minimizar el ruido y colocar líneas de salida largo de perfusión desde el portamuestras (véase el paso 2.8) muy por debajo del nivel del soporte de la muestra (y la botella de perfusión) para aumentar la unidad gravitatoria de la solución. Proteja estas líneas de salida y conectar el blindaje a tierra del amplificador para evitar el acoplamiento del ruido electromagnético a la señal de ERG. </li></ol></li></ol></li><li> Ajuste la perfusión de 3-5 ml / min mediante el uso de reguladores de caudal. Conecte 5% de CO 2/95% O 2 gas de un cilindro con regulador adecuado y ajustar el caudal para garantizar burbujeo constante de los medios de comunicación en la botella a través de un difusor de aire. </li></ol> Preparación 2. Muestra <ol><li> Ensamble instrumentos de disección limpias y afiladas incluyendo micro tijeras con filo recto, uno o dos de 45 o pinzas, cuchillas de afeitar y una pieza rectangular de papel de filtro. </li><li> Vierta aproximadamente 200 ml de perfu fríaSion solución en una gran placa de Petri de modo que toda la parte inferior del soporte de muestra (incluyendo las cúpulas) se puede sumergir en la solución. Este paso es importante cuando el montaje de las retinas de las cúpulas (véase el paso 2.6). Aunque algunas soluciones están diseñadas para ser saturado con carbógeno (5% de CO2 / 95% de O 2), esto no es esencial para los fines de disección y no se hizo en los experimentos descritos aquí. </li><li> Para un experimento típico, mantener a los animales en 12/12 horas ciclo de oscuridad / luz y la oscuridad-adaptarlos por 6 - 12 horas antes de las grabaciones. La eutanasia a los animales por inhalación de CO 2 seguido por dislocación cervical bajo tenue luz roja y hacer todos los siguientes procedimientos previstos en luz roja o infrarrojos dim (utilizar por ejemplo, el filtro rojo delante de la fuente de luz del microscopio). <ol><li> Tire de los ojos mediante el uso de pinzas y los puso en los medios de comunicación. Coloque un ojo a la vez en un pequeño pedazo de papel (por ejemplo, un poco de papel de filtro regular) y hacer comoiluminado aproximadamente en el nivel de ora serrata mientras sostiene el ojo con unas pinzas (esto se hace fuera de la solución aquí). </li></ol></li><li> Corte a lo largo de la ora serrata (o más cerca del ecuador del ojo) con micro tijeras y retire la córnea y el cristalino. Coloque el ocular en los medios de frío en la gran placa de Petri y repita el mismo procedimiento con el otro ojo. </li><li> Cortar una pequeña incisión de la parte superior de la copa para el ojo hacia el nervio óptico manteniendo las tijeras entre la retina y la esclerótica con el fin de mantener la retina tan intacto como sea posible. Grip la esclerótica de ambos lados de la incisión mediante el uso de dos pinzas y tire de las pinzas de distancia el uno del otro para separar la retina. <ol><li> Cortar el nervio óptico y tratar de aislar a la retina con una mínima cantidad de contacto físico con la superficie distal. RPE será principalmente separar automáticamente de la retina durante el proceso de disección. Es más importante para evitar la perturbación mecánica de la retina que para realizar ladisección rápidamente, generalmente retinas se puede incubar al menos 30 min en la solución sin efectos significativos sobre las propiedades de respuesta. </li></ol></li><li> Montar las retinas de las cúpulas del portamuestras (Figura 1C). Sumergir la parte inferior del portamuestras en la placa de Petri con las retinas disecadas. Deslizar la retina, lado fotorreceptor (la superficie convexa de la retina aislada) hacia arriba, por encima de la cúpula y levantar el soporte de la muestra de modo que la retina se fija en el papel de filtro. Repita el procedimiento para el otro retina. </li><li> Secar la placa de soporte con cuidado para evitar la diafonía eléctrica entre las retinas así como el ruido y la señal de derivación. Portamuestras tiene juntas tóricas alrededor de la parte inferior cúpulas para evitar derrame de solución entre la parte inferior y superior del soporte, así como para ayudar a la separación galvánica de los fotorreceptores y células ganglionares lados de las retinas individuales. Coloque la parte superior del soporte con los cuatro tornillos (véase la Figura 1B) y llenar los canales de perfusión con solución de perfusión utilizando una jeringa y una aguja. </li><li> Transferir el portamuestras junto al bloque intercambiador de calor y conectar las líneas de entrada y salida de perfusión en el soporte de la muestra (Figura 1D). Conectar los electrodos al amplificador ERG (electrodos superiores conectan al suelo / menos pasador en el amplificador) y adjuntar la unidad estimulador / control en el soporte de la muestra mediante el uso de un adaptador o deslice la almohadilla eléctrica en la unidad estimulador dependiendo de la in vivo se utiliza el sistema ERG. </li></ol> 3. Grabaciones <ol><li> Configure los ajustes del amplificador y de estímulo mediante el uso de software del sistema en vivo. Ajuste la frecuencia de adquisición a un valor entre 1 y 10 kHz y de paso bajo filtrando a 300 Hz. No utilizar el filtrado de paso alto. Utilice 60 Hz (o 50 Hz en Europa) muesca filtro si es necesario. </li><li> La línea de base de registro y sin estimulación de la luz y el ingenioh tenue estimulación (por ejemplo., luz verde de -35 dB o 0,3 mCd sm -2) para probar la buena conexión eléctrica entre los electrodos y muestra de retina. Espere 10 a 20 min antes de iniciar la recogida de datos de manera que la temperatura y la función de la retina llegan a un estado estable. <ol><li> Elija los parámetros de estímulo de acuerdo con cualquier experimento específico y comenzar la recolección de datos. Por ejemplo, utilice la luz verde de -40 hasta 0 dB o de 0,1 hasta 1000 mCd sm -2 para una familia respuesta escotópica. Utilice cerca de 2 a 3 log-unidades más brillantes destellos en grabaciones fotópicas donde las barras tienen que ser suprimida por la luz de fondo (3-30 Cdm -2) o un flash de la sonda (aproximadamente 1,3 Cd sm -2 = 1 dB, ver Figura 3). </li><li> Sin embargo, recuerde que los valores de intensidad de luz exactas podrían ser algo dependiente de la calibración del sistema y de las condiciones experimentales. Como regla general, las intensidades de escala hacia abajo por 5 a 10 veces en comparación con in vivo </em&gt; grabaciones cuando se utiliza luz verde 17. Una cubierta de negro con aberturas por encima de las retinas (incluidos en el sistema de adaptador comercial) se puede utilizar para reducir la dispersión de luz en el soporte de la muestra y facilitar la estimulación homogénea e igualitaria de ambas retinas por la esfera Ganzfeld del comercial en vivo sistemas. NOTA: Para grabaciones de retina adaptada a la oscuridad, las intensidades de destellos de prueba utilizados en un experimento típico blanqueador sólo una fracción insignificante del pigmento de modo que la falta de regeneración RPE-impulsado no es un problema. Además, se ha demostrado previamente que la regeneración pigmento cono todavía puede tener lugar en la retina aislado a través del ciclo celular Müller visual 20. </li></ol></li><li> Como experimentos duran típicamente de 30 min hasta varias horas, controlar la deriva de la línea de base, nivel de ruido y la estabilidad de respuesta durante el experimento como cambios en estos podrían indicar problemas técnicos. NOTA: El aumento o disminución de ruidoamplitudes de respuesta d pueden indicar burbujas de aire en los canales de perfusión o electrodos, demasiado baja o alta temperatura, solución de fugas / derrames o desplazamiento de la retina. </li></ol> 4. Limpieza <ol><li> Separe el soporte de la muestra de las líneas de perfusión, abrirla y vaciar las retinas del papel de filtro. Retire los electrodos y enjuague con agua destilada (no utilizar etanol). Limpiar el soporte de la muestra (incluyendo los canales de perfusión) con etanol y / o agua destilada. Tubo de perfusión Flush cuidadosamente etanol con&gt; 70%. </li><li> Enjuague la botella de perfusión con agua destilada (no usar detergentes). El etanol puede ser también utilizado para limpiar la botella. </li></ol>

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</ol>

Universidad de Washington en St. Louis tiene un acuerdo de licencia con Xenotec, Inc. y puede recibir una regalía por la venta del adaptador ex vivo.

<html> Estamos aquí demostrar los pasos críticos para la obtención de alta calidad ex grabaciones ERG vivo simultáneamente desde dos retinas de ratones aislados mediante el uso de componentes en vivo del sistema ERG, junto con un adaptador ex vivo ERG. En este estudio se perfundidos ambas retinas del animal con la misma solución (ya sea Ames &#39;, Locke o de Ringer), pero también es posible para perfundir cada retina con una solución diferente, por ejemplo, para fines de prue...

Electrorretinograma (ERG) es una técnica bien establecida que puede utilizarse para registrar la actividad eléctrica de la retina provocado por la luz. La señal de ERG se genera principalmente por cambios de voltaje causadas por las corrientes radiales (a lo largo del eje de los fotorreceptores y células bipolares) que fluye en el espacio extracelular resistiva de la retina. La primera señal de ERG fue grabado en 1865 por Holmgren desde la superficie de un ojo de pez 1. Einthoven y Jolly 1908 2 dividen la respuesta ERG a la aparición de la luz en tres ondas diferentes, llamado a-, b-, y c-ondas, que ahora se conoce para reflejar principalmente la actividad de los fotorreceptores, células bipolares EN, y el epitelio de pigmento células, respectivamente 3-8. ERG se puede grabar desde los ojos de animales o humanos (in vivo) anestesiados, desde aislada preparación ojo 9, a través de la retina intacta aislada (ex vivo) 3,10-15 oa través de las capas de la retina específicas con microelectrodos (localERG) 4,16. De estos, in vivo ERG es actualmente el método más utilizado para evaluar la función de la retina. Es una técnica no invasiva que se puede utilizar con fines de diagnóstico o para seguir la progresión de enfermedades de la retina en animales o pacientes. Sin embargo, en vivo grabaciones ERG producen una señal compleja con varios componentes superpuestos, a menudo contaminados por el ruido extraoculares fisiológico (por ejemplo, la respiración y la actividad cardíaca). ERG local se puede utilizar para grabar la señal a través de capas específicas de la retina, pero es el más invasivo y tiene la relación más baja de señal a ruido (SNR) en comparación con las otras configuraciones de grabación de ERG. ERG local también es técnicamente exigente y requiere equipos costosos (por ejemplo, microscopio y micromanipuladores). Transretinal ERG de la intacto, aislado retina (ex vivo ERG) ofrece un compromiso entre in vivo y métodos locales ERG permitiendo estable y higgrabaciones h SNR de retinas intactas de animales o seres humanos 17. Recientemente, este método ha sido utilizado con éxito para estudiar varilla y fotorreceptor cono función en retinas de mamíferos, primates y humanos 18-20. Además, debido a la ausencia de epitelio pigmentario de la retina ex vivo, se retira el componente de la onda c positivo de la señal de ERG y un componente prominente PIII lento negativo se revela en las grabaciones ex vivo. El componente lento PIII se ha demostrado que proceden de la actividad de las células gliales de Müller en la retina 21-23. Por lo tanto, ex vivo ERG método también podría ser usado para estudiar las células de Müller en la retina intacta. Varios estudios también han demostrado que los ex vivo grabaciones ERG se podrían utilizar para medir la concentración de agentes farmacológicos alrededor de la retina 24 y probar la seguridad y eficacia de los fármacos 25-27. Comercial múltiple en sistemas in vivo están disponibles yutilizado en muchos laboratorios que no necesariamente tienen amplia experiencia electrofisiología. En contraste, los dispositivos ex vivo no han estado disponibles hasta hace poco 17 y como resultado sólo muy pocos laboratorios están tomando actualmente ventaja de esta técnica de gran alcance. Sería beneficioso para hacer grabaciones ex vivo ERG a disposición de más laboratorios con el fin de avanzar en nuestro conocimiento sobre la fisiología de la retina y la patología, y desarrollar nuevas terapias para enfermedades que causan ceguera. Se demuestra aquí una sencilla y asequible dispositivo ex vivo ERG 17 y mostrar cómo se puede utilizar en combinación con varios sistemas vivo ERG disponibles en el mercado para grabar en la señalización de varilla y el cono mediada (a- y b-ondas) y la función de las células de Müller (lento PIII) desde intactas las retinas de ratones de tipo salvaje.

<table><tbody><tr><td>In vivo sistema ERG</td><td>OcuScience</td><td>HMsERG</td><td><a href="http://www.ocuscience.us/id77.html">www.ocuscience.us/id77.html</a</td></tr><tr><td>>In vivo sistema ERG</td><td>LKC Technologies</td><td>UTAS-E 3000</td><td><a href="http://www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html">www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html</a></td></tr><tr><td>Ex vivo adaptador</td><td>OcuScience</td><td>Ex VIVO ERG adaptador</td><td><a href="http://www.ocuscience.us/id107.html">www.ocuscience.us/id107.html</a></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>North Central Instruments</td><td>Leica M80</td><td><a href="http://www.ncimicro.com/store/ListProduct.asp?bSub=T&amp; idCategory=27">Puede usar cualquier emisor </a</td></tr><tr><td>>IR</td><td>de marca Opto Diode Corp.</td><td>OD-50L</td><td><a href="http://www.optodiode.com/">www.optodiode.com</a></td></tr><tr><td>Prowler Visores de visión nocturna</td><td>B.E. Meyers Electro Optics</td><td>D4300-I</td><td>Producto de grado militar.</td></tr><tr><td>Filtro rojo</td><td>Rosco Laboratories</td><td>Roscolux #27 Medium Red</td><td>Se puede utilizar en lugar del sistema IR</td></tr><tr><td>Luz de cabeza roja</td><td>OcuScience</td><td>ERGX011</td><td><a href="http://www.ocuscience.us/catalog/i29.html">www.ocuscience.us/catalog/i29.html</a></td></tr><tr><td>Microscissors</td><td>WPI, Inc.</td><td>500086</td><td><a href="http://www.wpiinc.com/">www.wpiinc.com/</a></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #5</td><td>WPI, Inc.</td><td>14101</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de afeitar</td><td>Electrónica Microscopy Sciences</td><td>72000</td><td><a href="http://www.emsdiasum.com/">www.emsdiasum.com</a></td></tr><tr><td>Scale</td><td>Metler Toledo</td><td>AB54-S/FACT</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/">Puede utilizar cualquier marca</a></td></tr><tr><td>Medidor de pH y electrodo</td><td>Beckman Coulter</td><td>pHI 350</td><td>Puede utilizar cualquier marca</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">Puede utilizar cualquier marca</a></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60129</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">Puede utilizar cualquier marca</a></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63020</td><td>1.0 M</td></tr><tr><td>solución CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21114</td><td>1.0 M solución</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431788</td><td>Puede usar cualquier marca</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Puede usar cualquier marca</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td>Puede usar cualquier marca</td></tr><tr><td>Ames medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1420</td><td>Puede usar cualquier marca</td></tr><tr><td>BaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0750</td><td>Puede usar cualquier marca</td></tr><tr><td>DL-AP4</td><td>Tocris Bioscience</td><td>101</td><td>Puede usar cualquier marca</td></tr><tr><td>Sal disódica de ácido succínico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>224731</td><td>Puede usar cualquier marca</td></tr><tr><td>Ácido L-glutámico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2834</td><td>Puede usar cualquier marca</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>Puede usar cualquier marca</td></tr><tr><td>Leibovitz medio de cultivo L-15</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4386</td><td>Puede utilizar cualquier marca</td></tr><tr><td>MEM vitaminas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6895</td><td></td></tr><tr><td>MEM aminoácidos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5550</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Airgas</td><td>UN3156</td><td>5% CO2</td></tr></tbody></table>

simultáneo<em&gt; ex vivo</em&gt; pruebas funcionales de dos retinas por<em&gt; in vivo</em&gt; sistema electrorretinograma

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Una señal de electrorretinograma (ERG) in vivo se compone de varios componentes superpuestos que se originan en diferentes tipos de células de la retina, así como de ruido de fuentes extrarretinianas. Ex vivo El ERG proporciona un método eficaz para diseccionar la función de las células de la retina directamente a partir de una retina aislada intacta de animales o de los ojos de un donante. Además, el ERG ex vivo puede utilizarse para probar la eficacia y la seguridad de posibles agentes terapéuticos en el tejido de la retina procedente de animales o humanos. Aquí mostramos cómo se pueden utilizar los sistemas ERG in vivo disponibles en el mercado para realizar registros ERG ex vivo a partir de retinas de ratón aisladas. Combinamos las unidades de estimulación lumínica, electrónica y de calefacción de un sistema in vivo estándar con soporte de muestras diseñado a medida, sistema de perfusión controlado por gravedad y blindaje contra ruido electromagnético para registrar señales ERG ex vivo de bajo ruido simultáneamente desde dos retinas con el software de adquisición incluido en el software comercial in vivo Sistemas. Además, demostramos cómo utilizar este método en combinación con tratamientos farmacológicos que eliminan componentes específicos de ERG con el fin de diseccionar la función de ciertos tipos de células de la retina.

Se registraron las respuestas de flash de tipo salvaje adaptada a la oscuridad (WT) C57BL / 6 retinas de ratones siguiendo los protocolos experimentales descritos anteriormente e ilustrados en la Figura 1 mediante el uso de diferentes soluciones de perfusión estándar (Figura 2). Las formas de onda y la cinética de respuesta, así como la sensibilidad de los fotorreceptores de varilla parecían similares en Ames y los medios de Locke (Figura 2A y B). Por o...

Ex vivo ERG se puede utilizar para registrar la actividad eléctrica de las células de la retina directamente a partir de retinas intactas aisladas de animales o humanos. Demostramos aquí cómo los sistemas ERG in vivo comunes se pueden adaptar para registros ERG ex vivo con el fin de diseccionar la actividad eléctrica de las células de la retina.

Simultáneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Pruebas funcionales de dos retinas por<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Electrorretinograma

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la función de las células de una retina de ratón aislada utilizando un sistema comercial de electroretinograma (ERG) in vivo junto con un adaptador ex vivo. Esto se logra primero mediante la disección de las retinas de ambos ojos de un ratón. El segundo paso consiste en montar las retinas con el lado de los fotorreceptores hacia arriba en un portamuestras.A continuación, el portaespécimen se coloca sobre una placa calefactora en el sistema de ERG in vivo y se conecta a la perfusión controlada por gravedad. El paso final consiste en conectar los electrodos del portaespécimen a un amplificador y estimular las retinas con luz para obtener respuestas de ERG. En definitiva, el ERG ex vivo se utiliza para mostrar cómo las vías de señalización mediadas por bastones y conos pueden separarse mediante farmacología y protocolos especializados de estimulación luminosa.La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos existentes, como los ERG in vivo o los registros de células individuales, es que proporciona una mayor relación señal-ruido, grabaciones más prolongadas y estables, así como la posibilidad de realizar manipulaciones farmacológicas fáciles y cuantitativas. Además, este método puede utilizarse para evaluar la eficacia y seguridad de fármacos diseñados para tratar enfermedades de la retina en retinas de primates y donantes humanos. Al menos un día antes, modifique la parte inferior del portaobjetos pegando un papel de filtro negro grisáceo en la parte superior de las cúpulas. Utilice un epoxi de dos componentes de cinco minutos a lo largo de los bordes de las cúpulas y, si es necesario, emplee un microscopio de disección. Una vez que el pegamento se haya secado, presione el papel de filtro contra la cúpula para que quede plano.Servirá durante aproximadamente un mes de grabación. Luego, retire el papel y limpie la cúpula con etanol al 70 %. Ahora, para preparar el electrodo primero, llene los canales del electrodo con la solución para electrodo.Trate de evitar la introducción de burbujas de aire. Luego, enrosque los electrodos en forma de pellet en los canales de los electrodos. Conecte las piezas superior e inferior del portamuestras con cuatro tornillos y llene las líneas de perfusión con la solución de electrodo.A continuación, mida la resistencia y el voltaje entre los extremos de los pares de electrodos. La resistencia debe ser inferior a 100 kiloohmios y el voltaje inferior a 10 milivoltios. Si los canales están libres de burbujas y los electrodos se encuentran en buen estado, vierta ahora entre 400 y 700 mililitros de medio de perfusión en un frasco de vidrio para la perfusión de la muestra.Además, vierta 300 mililitros para la disección y guárdelos en el refrigerador. Luego, pase el tubo de perfusión a través del bloque intercambiador de calor y coloque el bloque precalentado sobre la placa calefactora. Ahora, cierre la botella con una tapa que tenga una entrada de gas y una entrada para el tubo de perfusión.La entrada de gas debe conectarse a una piedra difusora de aire. Coloque la botella precalentada en el lugar donde el medio de perfusión se mantendrá a 37 grados Celsius. Luego, cebre las líneas de perfusión llenándolas con medio de perfusión para iniciar el flujo por gravedad en un sistema ocus science.Coloque la botella dentro de la jaula de Faraday para minimizar el ruido y utilice largas líneas de salida de perfusión desde el portaobjetos del espécimen. Coloque estas líneas de salida bien por debajo del nivel del portaobjetos del espécimen y de la botella de perfusión, proteja estas líneas y conecte el blindaje a la tierra del amplificador a través de la jaula de Faraday. Para evitar el acoplamiento del ruido electromagnético a la señal de ERG, fije la sonda de temperatura a la platina calefactora.Ahora, utilizando reguladores, ajuste el flujo de la solución a tres o cinco mililitros por minuto. Por último, si es necesario, introduzca aire y gas en la solución y ajuste el regulador para obtener un flujo constante de burbujas provenientes del difusor de aire. Comience vertiendo aproximadamente 200 mililitros de solución de perfusión fría en una placa de Petri grande, de modo que la parte inferior completa del soporte de la muestra pueda sumergirse por completo.Sacrificar un animal criado bajo un ciclo de luz oscuridad de 12, 12 horas y adaptado a la oscuridad durante seis a doce horas antes de las grabaciones. Todos los procedimientos siguientes deben realizarse bajo luz roja tenue o luz infrarroja. Después de aislar cada ojo, colocarlos en el medio ocular.Luego, transfiera un ojo a un pequeño trozo de papel de filtro sobre el papel. Sujételo con pinzas y corte una hendidura a la misma altura aproximada de la ora serrata desde la hendidura. Corte a lo largo de la ora serrata o un poco más cerca del ecuador para retirar la córnea y el cristalino.Luego, retire los extremos de la córnea y del cristalino y transfiera la copa ocular de nuevo al medio frío. Repita este mismo procedimiento con el otro ojo. Ahora, trabajando con una copa ocular, realice una pequeña incisión desde la parte superior hacia el nervio óptico.Mantenga las tijeras entre la retina y la esclerótica para que la retina permanezca lo más intacta posible. A continuación, sujete la esclerótica en ambos lados de la incisión utilizando dos pinzas y separe el tejido para desprender la retina. Para aislar la retina, corte el nervio óptico y retire la retina con el mínimo contacto posible sobre su superficie distal.Ahora, monte las retinas aisladas sobre las cúpulas del portaobjetos. Primero, sumerja la parte inferior del portaobjetos en la placa de Petri que contiene las retinas diseccionadas. Siguiente diapositiva.El fotorreceptor de la retina o el lado convexo hacia arriba sobre la cúpula. Luego levante suavemente el portaobjetos para que la retina se adhiera al papel de filtro. A continuación, repita el procedimiento para la otra retina.Ahora seque cuidadosamente la placa portadora para evitar ruido por diafonía y derivación de la señal. Después de secar el soporte, atornille la parte superior y llene los canales de perfusión con solución de perfusión desde una jeringa utilizando una aguja. Coloque el portamuestras junto al bloque de intercambio de calor.Luego conecte las líneas de perfusión de entrada y salida. Complete la configuración conectando los electrodos al amplificador de ERG y fijando la unidad de control del estimulador al portaobjetos. Usando un adaptador Para obtener respuestas grandes y reutilizables, es importante realizar una disección y montaje cuidadosos de las retinas, así como mantener una perfusión estable y libre de burbujas sobre las retinas antes de recopilar los datos.Espere de 10 a 20 minutos para que la temperatura y la función de la retina se estabilicen. Se registraron respuestas a destellos desde retinas de tipo salvaje C57 Black Six adaptadas a la oscuridad utilizando diferentes soluciones estándar de perfusión. Las formas de onda y la cinética de las respuestas aparecieron similares en el medio Ames y en el medio Locke. La sensibilidad de los fotorreceptores de bastones también fue similar.Por otro lado, en soluciones amortiguadas de Ringer sin bicarbonato ni respuesta a carbógeno, las amplitudes fueron significativamente menores. La estabilidad de la onda B también se vio a menudo comprometida en el Ringer de heap. La adición de 40 micromoles de A PB eliminó eficazmente la onda B positiva.Esto reveló una onda negativa lenta y de gran amplitud que se ha atribuido a la actividad de las células de Müller; la adición de 100 micromolares de bario abolió este componente, revelando así la respuesta de los fotorreceptores en la señal de ERG ex vivo. Este método puede combinarse con otras herramientas como la farmacología y la genética para responder preguntas sobre los mecanismos moleculares de la señalización retiniana y las enfermedades que causan ceguera en retinas de mamíferos, incluidas las humanas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

El desarrollo del electrorretinograma multifocal (mfERG) es un avance importante en el diagnóstico y la caracterización de la retinopatía. Electrorretinograma multifocal es una media aritmética de una aproximación de una onda b. Los programas de software pueden obtener ERG de más de un centenar de zonas de la retina en unos pocos minutos por ojo. Escotomas y la disfunción de retina se pueden asignar y cuantificados.

Electrorretinograma multifocal

Se describe un método relativamente simple de transretinal electrorretinograma (ERG) para la obtención de grabaciones photoresponses conos y bastones de la retina del ratón intacto. Este enfoque se aprovecha del bloque de la transmisión sináptica de fotorreceptores para aislar sus respuestas de luz y grabar usando electrodos colocados sobre el terreno a través de la aislada plana montada en la retina.

Transretinal Grabaciones ERG de retina del ratón: Rod y el Cono Photoresponses

Este artículo describe la grabación de las células individuales de marcado con fluorescencia poblaciones neuronales en la retina del ratón intacto. Mediante el uso de excitación de dos fotones infrarrojos células transgenetically etiquetado fueron objeto de grabación de patch-clamp para estudiar la luz de sus respuestas, las propiedades de campo receptivo, y la morfología.

Caracterización electrofisiológica de las buenas prácticas agrarias que expresan las poblaciones de células en la retina intacta

Este video muestra cómo registrar el electrorretinograma (ERG) y el potencial evocado visual (VEP) en una rata consciente. La rata, con electrodos implantados quirúrgicamente, se adapta primero a la oscuridad. Después de aplicar las gotas dilatadoras, el animal se coloca en un sujetador y se coloca en un recipiente Ganzfeld. A continuación, se registran las señales ERG y VEP.

Registro del electrorretinograma y del potencial evocado visual en una rata

El electrorretinograma (ERG) es un potencial eléctrico generado por la retina en respuesta a la luz. En este trabajo se describe cómo utilizar el ERG para evaluar la función de la retina, en ratas adaptadas a la oscuridad, y cómo se puede utilizar para evaluar una intervención neuroprotectora, en el presente caso el precondicionamiento isquémico a distancia.

Utilizando el Electrorretinograma para evaluar la función en el Roedor Retina y los efectos protectores de distancia Limb Preacondicionamiento Isquémico

Este protocolo describe la medición simultánea del electrorretinograma y los potenciales evocados visuales en ratas anestesiadas.

Grabación simultánea de Electrorretinografía y los potenciales evocados visuales en ratas anestesiadas

Aquí, presentamos un método para registrar las respuestas eléctricas evocadas por la luz del epitelio pigmentario de la retina (RPE) en ratones utilizando una técnica conocida como DC-ERGs descrita por primera vez por Marmorstein, Peachey y sus colegas a principios de la década de 2000.

Electroretinograma de acoplamiento directo (DC-ERG) para registrar las respuestas eléctricas evocadas por la luz del epitelio del pigmento retinivo del ratón

Adherirse a los estándares internacionales y mantener la adaptación oscura de la retina son fundamentales para adquirir respuestas válidas de electrorretinogramas de campo completo en el diagnóstico y manejo de enfermedades hereditarias de la retina. Se proporciona un protocolo práctico con un cuarto oscuro portátil para obtener electroretinograma de campo completo para bebés y niños bajo sedación o anestesia general en el entorno del quirófano.

Grabación de electrorretinogramas para bebés y niños bajo anestesia para lograr una adaptación óptima de la oscuridad y estándares internacionales

La imagen in vivo es una herramienta poderosa para el estudio de la biología en la salud y la enfermedad. Este protocolo describe imágenes transpupilares de la retina del ratón con un microscopio estándar de dos fotones. También demuestra diferentes métodos de imagen in vivo para etiquetar fluorescentemente múltiples cohortes celulares de la retina.

Imágenes transpupilares de dos fotones in vivo de la retina del ratón

La modificación de la matriz de electrodos múltiples existente o del equipo de abrazadera de parche hace que el electrorretinograma ex vivo sea más accesible. Los métodos mejorados para registrar y mantener las respuestas de luz ex vivo facilitan el estudio de la función de los fotorreceptores y las células bipolares ON en la retina sana, modelos animales de enfermedades oculares y retinas de donantes humanos.

Optimización de la configuración y las condiciones del electrorretinograma ex vivo para estudiar la función de la retina en ojos pequeños y grandes

Este protocolo presenta y describe los pasos para el aislamiento, disección, cultivo y tinción de explantes de retina obtenidos de un ratón adulto. Este método es beneficioso como modelo ex vivo para estudiar diferentes enfermedades neurovasculares de la retina como la retinopatía diabética.

Explante retiniano de la retina de ratón adulto como modelo ex vivo para el estudio de enfermedades neurovasculares retinianas

Aprende a realizar electroretinogramas ex vivo en retinas aisladas de ratón para estudiar la función celular retiniana. Este método permite disecar vías de señalización de bastones y conos mediante farmacología.

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