Name: Un método para Remotamente silenciamiento actividad neural en roedores Durante fases discretas de aprendizaje (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Aprende a silenciar la actividad neuronal en regiones cerebrales específicas de roedores durante tareas de aprendizaje y memoria. Este método farmacogenético permite controlar circuitos neuronales con precisión para estudiar neurociencia conductual.

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Agradecemos a los autores de Robinson et al. 12 por sus contribuciones al manuscrito del que se deriva parcialmente este protocolo.

El uso de animales son aprobados por el Oberlin College Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión y están de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio 21. 1. Preparación para la Infusión Viral Nota: Este protocolo utiliza BSL-1 precauciones. Cuando se emplea BSL-2 precauciones, una bata de laboratorio desechable, guantes, cubiertas para zapatos, protecciones oculares y un respirador de partículas (tipo N95) son obligatorios. Todos los individuos de manipulación BSL-2 compuestos deben ser probados para encajar un respirador de partículas por una agencia de salud pública local. Consulte Lowery y Majewska (2010) 22 para obtener más detalles sobre la manipulación y el almacenamiento de los vectores virales. <ol><li> Tras el primer uso, alícuota y almacenar virus sin utilizar en 20 tubos de microcentrífuga mu l para evitar la congelación y descongelación repetida. </li><li> Preparar la superficie de trabajo mediante la eliminación de los objetos innecesarios y la esterilización de la superficie con etanol al 70%. Preparar un 1Solución de lejía al 0% para la descontaminación de los residuos de AAV. Coloque un vaso lleno de la solución de lejía y una estéril 10 l jeringa sobre la superficie de trabajo. Coloque el tubo de microcentrífuga con el AAV en un recipiente con hielo picado durante la puesta en marcha. </li><li> Coloque el tubo de microcentrífuga con el virus en un tornillo de banco estándar. Cargar una jeringa de 10 l con al menos 4 l de AAV. Tener cuidado de no doblar la punta de la jeringa contra la parte inferior del tubo de microcentrífuga durante la carga. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en los 4 l de solución de AAV en la jeringa. </li><li> Deseche el tubo de virus vacío en el vaso que contiene 10% de lejía. Almacene las partes no utilizadas del virus como lo especifica el proveedor. </li><li> Añadir adicional de 10% de lejía al contenedor de residuos, y permitir que los residuos que se siente durante 30 minutos antes de disponer los residuos líquidos descontaminado. </li><li> Deseche todo el equipo de protección y los residuos de plástico en un contenedor de riesgo biológico según las instrucciones de las directrices institucionales. Decontaminate cualquier equipo o superficies que estuvieron en contacto con el virus utilizando 10% de lejía. </li></ol> 2. Cirugía <ol><li> Prepare el área quirúrgica mediante la colocación de papel absorbente banco bajo el aparato estereotáxico y en un espacio adyacente designada como un área dedicada manipulación de virus. <ol><li> Coloque un contenedor de residuos de lejía al 10% en el área de manipulación de virus dedicado cerca del aparato quirúrgico. </li></ol></li><li> Provocar un nivel constante de anestesia y preparar la rata para la cirugía. <ol><li> Coloque la rata en una cámara de inducción que contiene una mezcla de gas isoflurano (intervalo de 1 a 3%) y oxígeno (100% a aproximadamente 1 L / min) hasta que haya una pérdida de la conciencia y la falta de movimiento intencionado bruto. Mantener la anestesia con isoflurano en todo el procedimiento quirúrgico. </li><li> Después se alcanza 6 anestesia profunda, afeitarse la rata de entre los ojos o ligeramente detrás de las orejas. </li><li> Coloque la rata de nuevo en la cámara de inducción para un1-3 min adicional. </li><li> Asegúrese de que el sistema de anestesia con isoflurano está conectado al cono de la nariz de la cirugía estereotáxica. Abra la llave de paso en la tubería de isoflurano para comenzar el flujo de isoflurano al stereotax. Mantener el isoflurano y oxígeno a los niveles especificados anteriormente. </li><li> Coloque la rata en un aparato estereotáxico asegurando la boca sobre la barra bocado y asegurar las barras de oído. </li><li> Aplicar lubricante ocular para los ojos y betadine al sitio quirúrgico antes de la incisión. </li></ol></li><li> Haga una incisión en la línea media 2,4 cm de la piel en la superficie dorsal del cráneo comenzando aproximadamente 2 mm caudales a los ojos. Retirar la piel para exponer el cráneo. Periódicamente inculcar 0,9% de solución salina estéril estéril en los márgenes de la zona quirúrgica para evitar que los tejidos de secado. </li><li> Tejido membranoso claro desde el cráneo hasta bregma y lambda son claramente visibles. </li><li> Asegúrese de que el cráneo es de nivel mediante la medición de las coordenadas dorsal-ventral enbregma y en lambda. Ajuste el dispositivo estereotáxica en consecuencia hasta coordenadas dorsal-ventral en bregma y lambda difieren en no más de 0,04 mm. </li><li> En este momento, reducir el gas isoflurano a entre 2 y 2,5%. </li><li> Devuelva el taladro para bregma, REZERO las coordenadas y luego mover el taladro para el medio-lateral deseada y anterior-posterior de coordenadas. </li><li> Perforar un agujero en la parte de coordenadas utilizando una broca de 0,9 mm, ya que produce un agujero de tamaño apropiado para una jeringa de infusión 28 G. </li><li> Establecer la bomba de infusión para entregar virus a una tasa de 0,2 l / min. Coloque la jeringa en el brazo de infusión del dispositivo estereotáxico y bajar la jeringa en la coordenada deseada. Entregar la cantidad deseada de virus (oscilar 0,1 a 0,8 l). Por ejemplo, entregar 0,8 l de AAV durante 4 min. Nota: realizar estudios piloto para determinar el volumen de infusión ideal y la propagación típico de virus en cada región de interés. <ol><li> Después de la entrega de virus es complete abandonan la jeringa en su lugar durante 10 min para evitar el reflujo en el tracto de la aguja. Lentamente levante la jeringa a una velocidad de alrededor de 5 mm / min. Repita hasta que todas las coordenadas se han infundido con AAV. </li></ol></li><li> Cierre la herida con grapas quirúrgicas y recubrir la herida con ungüento antibiótico tópico. </li><li> Siga las directrices institucionales para el manejo del dolor postoperatorio. </li><li> Coloque la rata en una jaula con ropa de cama, una tapa y señalización adecuada y volver a la rata a la instalación para animales. <ol><li> Si trabaja bajo BSL-2 precauciones, recoger ropa de cama para la cantidad de tiempo (por lo general 48 a 72 h) especificado por las directrices institucionales. Coloque la ropa de cama en un envase para peligros biológicos. </li><li> Deseche todos los materiales de AAV-contaminada como se especifica en las directrices para su eliminación segura. </li></ol></li></ol> 3. Aparato Behavioral Nota: El aparato precondicionamiento sensorial consiste en un condicionamiento operante cham estándarber (12 &quot;L x 9.5&quot; W x 11.5 &quot;H) con un suelo de rejilla de acero inoxidable, 2 paredes laterales de plexiglás y 2 paredes metálicas. <ol><li> Montar una luz de 2,8 W en una de las paredes de aluminio para servir como la luz de la casa y como estímulo visual cuando brilló a 2 Hz. Montar un altavoz en la cámara para ofrecer los estímulos auditivos (a 10 seg, 1500 Hz, 78 dB tono puro y un dB de ruido blanco 10 seg 78). <ol><li> Utilice una tolva de alimentos para entregar 45 bolitas de comida mg en la copa de los alimentos. Dentro de la taza de comida, fotocélulas de infrarrojos detectan el tiempo total empleado en la taza de alimentos antes, durante y después de las presentaciones de los estímulos y recompensas de comida. </li><li> Casa de las cámaras en los gabinetes de atenuar el sonido (22 &quot;W x 22&quot; H x 16 &quot;D) equipadas con ventiladores de escape (~ 68 dB). </li><li> Utilice un ordenador PC con el software Med Associates para controlar la cámara operante y adquirir los datos. Durante las sesiones acondicionado, recoger datos sobre el tiempo total dedicado a la cabeza en la taza de alimentos durante Presentación de la (s época 5) estímulo de luz y durante la presentación de la recompensa de comida (5 seg época). Durante la sesión de prueba, recoger datos sobre el tiempo total empleado en la taza de alimentos en respuesta a las presentaciones de los estímulos auditivos (10 seg época principio, cuando se terminan los estímulos auditivos). </li></ol></li></ol> 4. Descripción de la sensorial Precondicionamiento Paradigma <ol><li> Después de la recuperación de la cirugía, de manera gradual alimentos restringir las ratas a 85% de su peso corporal libre de alimentación. Consulte con el personal veterinario para un paradigma de la restricción de alimentos apropiados. Nota: El 3-fase paradigma precondicionamiento sensorial se ilustra en la Figura 2. </li><li> Precondicionamiento Sesiones (1 Fase; diarias sesiones de entrenamiento 64 min a cabo a través de 4 días consecutivos): <ol><li> Ratas presentes con 12 ensayos entremezclados que consisten en la entrega de estímulos auditivos y visuales. Incluya intervalos inter-ensayo que media 4,5 minutos (rango 4,0 a 5,0 min) después de cada unapresentación uditory. </li><li> El 6 de los ensayos, un tono de actualidad (estímulo preacondicionada) durante 10 s, seguido inmediatamente por una presentación de 5 segundos del estímulo luz intermitente. </li><li> En los otros 6 ensayos, presentar el ruido blanco (estímulo no apareado) solo por 10 seg. </li></ol></li><li> Sesiones acondicionado (Fase 2; Daily sesiones de entrenamiento de 64 minutos realizadas en los 5 días consecutivos): <ol><li> Ratas presentes con 8 ensayos que consisten en la entrega del estímulo visual (el estímulo luz intermitente) durante 5 segundos seguidos inmediatamente por la entrega de dos bolitas de comida 45 mg. Incluya intervalos inter-ensayo que la media 7 min (rango 6,0 a 8,0 min) después de cada ensayo. De vez en cuando las ratas requieren más de 5 sesiones de acondicionamiento para aprender la asociación comida ligera. </li></ol></li><li> Prueba de Sesión (Fase 3; una sola sesión de 78 minutos): <ol><li> Presentar las ratas con 12 ensayos entremezclados que consisten en la entrega de los estímulos auditivos solos. Incluya intervalos inter-ensayo que AVErabia 4,5 min (rango 4,0 a 5,0 min) después de cada presentación auditiva. </li><li> En 6 de los ensayos, presentar el estímulo de tono (el estímulo preacondicionado) solo por 10 seg. </li><li> En los otros 6 ensayos, presentar el ruido blanco (el estímulo desapareado) solo por 10 seg. </li></ol></li><li> Contrarrestar los estímulos al completar el estudio con un segundo conjunto de ratas que reciben el ruido blanco como el estímulo preacondicionado y el tono como el estímulo no apareado. </li></ol> 5. farmacológico y conductual Procedimiento <ol><li> Encienda la alimentación del aparato de comportamiento y cargar el código en PC Med para la sesión del comportamiento apropiado. El aparato de comportamiento de alambre y el programa de tal manera que los aficionados que se montan en los gabinetes de atenuación de sonido se encienden cuando la alimentación está encendida. </li><li> Para preparar una solución de 1 mg / ml de la clozapina N-óxido (CNO), pesan 5,0 mg de CNO en un tubo cónico de 15 ml y añadir 5 ml de agua estéril o 5 ml de 0,9% estéril saline. Vortex hasta que la solución es clara. <ol><li> Si CNO no se disuelve en la solución o si se desean soluciones más concentradas de CNO añadir un agente solubilizante, tal como DMSO 23. Específicamente, para preparar una solución 1 mg / ml de CNO con 0,5% de DMSO, pesan 5,0 mg de CNO y añadir 25 l de DMSO a un tubo cónico de 15 ml. Flick garantizar suavemente que los contenidos permanecen en la base del tubo. Cuando la solución se vuelve clara, añadir 5 ml de agua estéril o 5 ml de solución salina estéril al 0,9%. Otras instrucciones para la preparación de soluciones de CNO están disponibles en la página de recursos DREADD wiki 25. </li><li> Preparar una nueva solución CNO cada día que se administra. </li></ol></li><li> Inyectar el CNO por vía intraperitoneal a una dosis de 1 mg / kg aproximadamente 30 minutos antes de las pruebas de comportamiento. Por ejemplo, inyectar un 200 g rata con 0,2 ml de la solución de 1 mg / ml CNO. El curso de la dosis y tiempo de administración CNO fueron seleccionados sobre la base de los informes publicados previamente 2,12.<ol><li> Inyectar CNO 30 min antes de cada sesión de preacondicionamiento (Fase 1, total de 4 días de inyecciones) pero administrar el vehículo antes de todas las sesiones de comportamiento posteriores. </li></ol></li><li> Después de 30 min, colocar las ratas en las cámaras de las pruebas de comportamiento e iniciar el código de ordenador para la sesión de comportamiento apropiado. </li><li> Sobre la terminación de la tarea de comportamiento, retire inmediatamente las ratas de las cámaras y volver a las ratas a la colonia animal. </li></ol> 6. Análisis de la Conducta de datos Nota: La variable dependiente para todas las sesiones de comportamiento es la cantidad de tiempo que la cabeza de la rata es el interior de la taza del alimento tal como se detecta por la interrupción de las fotocélulas de infrarrojos en la taza del alimento. Los datos (en segundos) se recogen y registran por el software de ordenador. <ol><li> No realizar los análisis en los datos generados durante la fase de acondicionamiento previo. </li><li> Para las sesiones de acondicionamiento: analizar una de cada uno ratasbilidad de aprender la asociación comida ligera comparando el comportamiento de taza de alimentos durante la presentación del estímulo visual a través de las 5 sesiones de comportamiento. En concreto, se calcula el tiempo medio de permanencia en la taza de alimentos durante la época de luz 5 segundos para cada uno de 8 ensayos / sesión (es decir, un promedio de 8 ensayos que son cada 5 segundos de duración / rata). Comparar el control promedio y los valores experimentales para cada uno de 5 sesiones diarias (ver Figura 3A). <ol><li> Analizar la motivación de las ratas para obtener recompensa de comida comparando el comportamiento de taza de alimentos durante la entrega del premio de comida (5 seg época) a través de las 5 sesiones de comportamiento utilizando el mismo cálculo como se especifica para la época luz 5 seg arriba. Estos valores serán siempre superiores a las adquiridas durante la presentación del estímulo visual (véase la Figura 3B). </li></ol></li><li> Para la sesión de prueba: calcular una relación de discriminación que describe el comportamiento de la taza del alimento de las ratas en respuesta a pressentaciones de cada estímulo auditivo. <ol><li> En concreto, para cada rata, se divide el tiempo medio de permanencia en la taza después de cada comida de 6 presentaciones del estímulo preacondicionada sensorial (es decir, el tono) por la suma del tiempo medio de permanencia en la taza después de cada comida de 6 presentaciones del estímulo sensorial preacondicionada (es decir, el estímulo de tono) más el promedio del tiempo total empleado en la taza después de cada comida de 6 presentaciones del estímulo no emparejado (es decir, el estímulo de ruido blanco). Cada época es 10 seg de duración. Nota: Una puntuación de la discriminación de 0.5 o mayor demuestra que las ratas aprendieron las asociaciones inherentes al paradigma precondicionamiento sensorial. </li></ol></li></ol> 7. Verificación de AAV Colocación y Expresión <ol><li> Anestesiar y perfundir las ratas transcardially utilizando paraformaldehído al 4%. Debido al uso de marcadores fluorescentes, no exceda un momento posterior a la fijación de 2 horas a minmizar pérdida de antigenicidad y para preservar la señal fluorescente. </li><li> Deshidratar cerebros perfundidos mediante la transferencia de ellos en un frasco de cerebro que contiene 30 ml de una solución de sacarosa al 20% en solución salina tamponada con fosfato (1x) durante un mínimo de 2 días o hasta que el cerebro se hunde hasta el fondo de la jarra cerebro. </li><li> Use un micrótomo de deslizamiento congelación para hacer secciones del cerebro coronal (20-40 micras) a lo largo de toda la extensión rostrocaudal de la región de interés. </li><li> Llevar a cabo la inmunohistoquímica dirigido contra el receptor etiquetado o la proteína indicadora para determinar la ubicación y la expresión del receptor diseñador y / o reportero 12. Un protocolo de tinción inmunohistoquímica se proporciona en la página de recursos DREADD wiki 25. </li><li> Montar las secciones en portaobjetos y cubreobjetos-Superfrost además utilizando 100-200 l de un medio de montaje acuoso. </li><li> Realizar microscopía de fluorescencia en el tejido cerebral para verificar la colocación de AAV y expresión de proteínas 12,24.</li>
</ol>

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<li>Cassatarro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+pharmacogenetic+modulation+of+the+nucleus+accumbens+reduces+ethanol+consumption+in+a+limited+access+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharm%22%5BJournal%5D)">Reverse pharmacogenetic modulation of the nucleus accumbens reduces ethanol consumption in a limited access paradigm.</a> Neuropsychopharm. 39, 283-290 (2014).</li>
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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Este protocolo se describe cómo aplicar un enfoque de farmacogenética (DREADD) para investigar cómo una región específica del cerebro contribuye a una tarea de aprendizaje compleja de múltiples fases. Con la capacidad de silenciar temporalmente y de forma remota la actividad neuronal en regiones discretas del cerebro a través de las fases de aprendizaje, esta combinación de enfoques ofrece una plataforma para investigar una amplia gama de comportamientos, incluyendo las formas más matizadas o enmascarados de aprendizaje...

Un reto apasionante en el campo de la neurociencia conductual es determinar los sustratos neurales de comportamientos complejos. Un número de técnicas tales como lesiones permanentes, la inactivación cerebral temporal a través de cánulas e implantes optogenética se han empleado para identificar las contribuciones de regiones discretas del cerebro a subcomponentes de comportamientos complejos. Si bien estos enfoques informan a nuestra comprensión de la especificidad regional durante el aprendizaje, cada técnica no es sin limitaciones. Específicamente, las lesiones permanentes suelen realizarse antes de las pruebas de comportamiento, por lo tanto sus efectos están presentes durante toda la duración del paradigma. Estudios de canulación que implican la presentación de un inactivador neural a corto plazo (por ejemplo, la tetrodotoxina) puede producir un daño sustancial al tejido cerebral y pueden inducir estrés en sujetos justo antes de las pruebas de comportamiento. Además, la inactivación a través de la canulación se limita a la región de tejido que rodea lapunta de la cánula. Por último, mientras que la optogenética ofrece una gama de flexibilidad para el control temporal de la actividad en regiones específicas del cerebro, es un costo prohibitivo y técnicamente exigente. Estas limitaciones pueden ser superadas mediante un enfoque de farmacogenética (diseño-Receptores-exclusiva-Activado por Diseñador-Drogas, DREADDs) 1,2. Es importante destacar que, mientras que el concepto de la farmacogenética es sofisticada, la ejecución de la técnica es sencilla. Similar a los métodos quirúrgicos estereotáxicas tradicionales que implican la infusión de la toxina (por ejemplo, NMDA, ácido iboténico) en regiones discretas del cerebro, esta técnica implica la infusión de un virus adeno-asociado (AAV) que contiene un fragmento de ADN para un receptor de proteína G inhibitoria modificado acoplado (hM4Di; el receptor de diseñador) en la región de interés de los roedores de laboratorio estándares (véase la Figura 1). El vector viral también contiene un indicador fluorescente (mcitrine). Una vez incorporado ena las células, el receptor de diseñador (y proteína indicadora) se expresan al máximo ~ 3 semanas después de la infusión y se pueden activar selectivamente para 2-5 hr por la administración sistémica de la droga de diseño de otra manera biológicamente inerte, clozapina-N-óxido (CNO) 1 , 3. Debido a que el experimentador está dotado de control temporal preciso, todavía remoto a través de la actividad neural en regiones específicas del cerebro, la farmacogenética combina particularmente bien con los paradigmas de comportamiento que se llevan a cabo en múltiples fases. En este ejemplo, la contribución de la corteza retroesplenial (RSC) al estímulo-estímulo de aprendizaje se compara con su papel en el aprendizaje pavloviano, sin embargo esta combinación de enfoques se adapta bien a cualquier número de preguntas que tratan de identificar la forma específica las regiones del cerebro contribuyen a comportamiento complejo. Además, mientras que no se describe en el presente protocolo, los enfoques virales y transgénicos se pueden utilizar para lograr tipo de células específicas DREADD expresión 2. Como is inherente a paradigmas conductuales que implican tipos farmacológicos y / o de otro tipo de manipulaciones experimentales, una cuidadosa consideración de diseño experimental y el análisis cuantitativo posterior se requiere cuando se emplea el enfoque DREADD. Los experimentadores nuevos al enfoque DREADD se hace referencia a una revisión exhaustiva de la tecnología actual DREADD 2. Cada día, los organismos aprenden acerca de nuevos estímulos y eventos y sus relaciones entre sí. Incluso en un ambiente familiar, tales como el hogar, uno es rápida para detectar alteraciones en las relaciones entre los estímulos debido a que estos cambios pueden ser predictivos de eventos significativos. Tal estímulo-estímulo (es decir, relacional) aprendizaje implica la conjunción de múltiples estímulos y tradicionalmente se ha asociado con el hipocampo, que reside centralmente dentro del lóbulo temporal medial 4. Sin embargo, no existe el hipocampo ni actuar de manera aislada; regiones corticales, tanto dentro como fueralado del lóbulo temporal medial proporcionar información sensorial crítica para la formación del hipocampo 5-7. Los estudios tradicionales de lesiones permanentes proporcionan evidencia convincente para la participación de un número de regiones corticales (por ejemplo, las cortezas retrosplenial, postrhinal y entorrinal) en el aprendizaje dependiente del hipocampo, pero están limitados en su capacidad de discernir el papel de una región en particular durante las fases discretas de aprendizaje 8-10. El presente protocolo pone a prueba la hipótesis de que la RSC es necesaria para el aprendizaje estímulo-estímulo por silenciar a la RSC en una sola fase de un 3-fase paradigma precondicionamiento sensorial 11,12. Brevemente, las ratas reciben infusiones de un AAV que contiene el receptor diseñador y ~ 3 semanas más tarde se administró el fármaco de diseño (CNO) 30 min antes del inicio de las pruebas de comportamiento. En el presente protocolo, las ratas experimentales reciben CNO durante la primera fase de pruebas (cuando lear estímulo-estímuloción se produce) y reciben vehículo durante los próximos 2 fases de pruebas. Para controlar los efectos involuntarios de CNO en el comportamiento, infundir ratas con el receptor de diseñador (hM4Di) e inyectar con vehículo en lugar de CNO. Para tener en cuenta los efectos generales de infusión viral y la expresión del receptor, infundir un virus de control que no contiene el receptor de diseñador y administrar CNO. Un número de diferentes serotipos de AAV se utilizan para entregar material genético. Las directrices actuales de los NIH para la investigación con recombinante o moléculas sintéticas que mantiene AAV (todos los serotipos) y constructos de AAV recombinantes o sintéticos, en la que el transgén no codifica ya sea un producto génico potencialmente tumorigénicos o una molécula de toxina y se producen en la ausencia de una virus auxiliar, requiere BSL-1 Precauciones (Grupo Apéndice B-1. Riesgo 1 (RG1) Agentes) 13. Un número de comentarios relativos a la estructura de AAV, utilidad y seguridad están disponibles 14,15. Cabe destacar que, aunque, Debido a las preocupaciones relativas a posibles 16,17 y potenciales mecanismos carcinogénicos reproductivos 18-20 en roedores, algunas instituciones requieren el uso de BSL-2 precauciones cuando se trabaja con AAV. Verifique la BSL apropiado antes de su uso mediante la consulta con los comités de supervisión de las instituciones individuales en los que la investigación se llevó a cabo, los Centros para el Control de Enfermedades y las directrices del NIH para investigaciones con ADN recombinante Moléculas 13 cuando se usan vectores virales para la manipulación de genes en los Estados Unidos. De protección personal, de formación investigadora, vector de contención, descontaminación, eliminación de materiales descontaminados, y después de la inyección de animales necesidades de vivienda son especificados por estas directrices. Además, consulte y siga apropiada Institucional Cuidado de Animales y utilizar las directrices del comité o directrices del comité de supervisión institucionales equivalentes para asegurar la manipulación, administración y disposición de AAV.

<table><tbody><tr><td>Macho, Ratas Evans largas, 55-60 días de edad</td><td>Hilltop Lab Animals Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine</td><td>Virus Vector Core</td><td></td><td>Precaución: Este es un compuesto BSL-1</td></tr><tr><td>rAAV8/hSyn-GFP</td><td>Virus Vector Core</td><td></td><td>Precaución: Este es un compuesto BSL-1</td></tr><tr><td>Clozapina-N-óxido R</td><td>& D Systems</td><td>4936-10 Tapa de</td><td>jaula para ratas de drogas de diseño</td></tr><tr><td>(policarbonato)</td><td>Diseño alternativo&nbsp;</td><td>FT 8XL-PC</td><td>Se utiliza para cubrir jaulas de animales 48-72 horas después de la infusión</td></tr><tr><td>Papel de filtro (reemplazo)</td><td>Diseño alternativo</td><td>FP-R-1018XAD Papel de</td><td>filtro que va con las tapas de las jaulas Tornillo</td>de</tr><tr><td>banco de sobremesa</td><td>JETS</td><td>2201-265</td><td>Para sujetar tubos de microcentrífuga que contienen AAV en la campana</td></tr><tr><td>Bolsas de basura de riesgo biológico</td><td>Grapas</td><td>113444</td><td>Medline Revestimientos</td></tr> de <tr><td>riesgo biológico Bote de basura de riesgo biológico</td><td></td><td></td> Amazon.com <td>United Solutions Bote de basura rectangular con ruedas de 34 galones con gancho y mango de bloqueo</td></tr><tr><td>Isoflurano, 100 ml</td><td>Patterson Veterinary Supply Inc.</td><td>07-890-8540</td><td>Anestésico</td></tr><tr><td>Estereotáxico doble para animales pequeños con consola de lectura de pantalla digital</td><td>David Kopf</td><td>Modelo 942</td><td>Equipo quirúrgico</td></tr><tr><td>Barras para los oídos que no se rompen, juego de 2 (rata)</td><td>David Kopf</td><td>Modelo 955</td><td>Equipo quirúrgico</td></tr><tr><td>Máscara de anestesia (rata)</td><td>David Kopf</td><td>Modelo 906</td><td>Equipo quirúrgico</td></tr><tr><td>Taladro estereotáxico de alta velocidad incluye controlador de motor de mesa, pedal, pieza de mano, soporte de pieza de mano estereotáxica</td><td>David Kopf</td><td>Modelo 1474</td><td>Equipo quirúrgico</td></tr><tr><td>Rebabas Microdrill, 0,9 mm</td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>19007-09</td><td>Suministro quirúrgico</td></tr><tr><td>Bomba de jeringa automatizada con controlador micro4</td><td>David Kopf</td><td>Modelo UMP3-1</td><td>Equipo quirúrgico</td></tr><tr><td>Cuchilla cerámica desmontable Pro-animal kit de maquinilla</td><td>Ahdis</td><td>21420</td><td>Suministro quirúrgico</td></tr><tr><td>Limpiador de piel Betadine</td><td>Productos Perdue L.P</td><td>67618-149-04</td><td>Suministro quirúrgico</td></tr><tr><td>Pomada antibiótica triple</td><td>Suministro Medline</td><td>53329-087-01</td><td>Suministro quirúrgico</td></tr><tr><td>Pomada veterinaria Puralube</td><td>Solo Suministro Veterinario</td><td>17033-211-38</td><td>Suministro quirúrgico</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td> <td>Dino-liteAD7013MTL</td><td>Una alternativa al endoscopio de disección tradicional</td></tr><tr><td>Dino-lite soporte rígido de sobremesa</td><td>Microscopio</td><td>MS36B</td><td>Equipo quirúrgico</td></tr><tr><td>28 G 10 &mu; l jeringa</td><td>Hamilton</td><td>80308-701SN</td><td>Equipo quirúrgico</td></tr><tr><td>Cubículo atenuador de sonido de MDF extra alto</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-018MD</td><td>22' de ancho x 22" de alto x 16" de profundidad</td></tr><tr><td>Cámara de prueba modular extra alta</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-007</td><td>Equipo de comportamiento</td></tr><tr><td>Piso de rejilla de acero inoxidable</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-005</td><td>Equipo</td></tr> <tr><td>de comportamientoLuz</td> de la casa <td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-215M</td><td>Se utiliza como luz de la casa y luz de estímulo</td></tr><tr><td>Dispensador de pellets modular</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-203M-45</td><td>Equipo de comportamiento</td></tr><tr><td>Receptáculo de pellets, tipo taza</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-200R1M</td><td>Equipo de comportamiento</td></tr><tr><td>Detector de entrada de cabeza para ratas</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-254-CB</td><td>Equipo de comportamiento</td></tr><tr><td>Pellets de alimentos de precisión sin polvo, 45 mg</td><td>Bio-Serv</td><td>F0165</td><td>Suministro de comportamiento Altavoz</td></tr> de <tr><td>jaula para cámara</td> de <td>ratas Med Associates, Inc</td><td>ENV-224AM</td><td>Equipo de comportamiento</td></tr><tr><td>Generador de audio programable</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ANL-926</td><td>Equipo de comportamiento</td></tr><tr><td>Paquete inteligente ctrl de 8 entradas/16 salidas</td><td>Med Associates, Inc</td><td>DIG-716P2</td><td>Equipo de comportamiento</td></tr><tr><td>Gabinete de sobremesa grande y fuente de alimentación</td><td>Med Associates, Inc</td><td>SG-6510D</td><td>Equipo de comportamiento</td></tr><tr><td>Paquete de interfaz PCI</td><td>Med Associates, Inc</td><td>DIG-700P2-R2</td><td>Equipo de comportamiento</td></tr><tr><td>MED Intel Paquete de computadora central con monitor X Pro de 19"</td><td>Med Associates, Inc</td><td>COM-103V</td><td>Equipo de comportamiento</td></tr><tr><td>Paraformaldehído (grannular), 1 kg</td><td>Microsopía electrónica Ciencias</td><td>19210</td><td>Peligro: carcinógeno, pesa en la capucha</td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal de conejo (HA-Tag)</td><td>Tecnologías de señalización celular</td><td>3724S</td><td>Reactivo de histología</td></tr><tr><td>XP Anticuerpo monoclonal de conejo (GFP)</td><td>Tecnologías de señalización celular</td><td>2956S</td><td>Reactivo de histología</td></tr><tr><td>Anti-conejo IgG</td><td>Tecnologías de señalización celular</td><td>4412S</td><td>Suministros de histología</td></tr><tr><td>Portaobjetos Superfrost plus</td><td>VWR international</td><td>483111-703 Suministros de</td><td>histología</td></tr></tbody></table>

un método para remotamente silenciamiento actividad neural en roedores durante fases discretas de aprendizaje

A Method for Remotely Silencing Neural Activity in Rodents During Discrete Phases of Learning

Este protocolo describe cómo temporalmente y de forma remota silenciar la actividad neuronal en regiones discretas del cerebro mientras que los animales están involucrados en tareas de aprendizaje y memoria. El enfoque combina la farmacogenética (Diseñador-Receptores-exclusiva-Activado por Designer-Drogas) con un paradigma de comportamiento (precondicionamiento sensorial) que está diseñado para distinguir entre diferentes formas de aprendizaje. Específicamente, la entrega mediada por virus se utiliza para expresar un receptor de proteína G inhibitoria modificado genéticamente acoplado (el diseñador del receptor) en una región del cerebro discreta en el roedor. Tres semanas más tarde, cuando los niveles de expresión del receptor de diseñador son altos, un agente farmacológico (el diseñador de Drogas) se administra sistémicamente 30 min antes de una sesión de comportamiento específico. El fármaco tiene afinidad por el receptor diseñador y por lo tanto resulta en la inhibición de las neuronas que expresan el receptor diseñador, pero es de otra manera biológicamente inerte. La región del cerebro permanece silenciada durante 2-5 horas (Depending de la dosis y vía de administración). Al finalizar el paradigma de comportamiento, el tejido cerebral se evaluó para la colocación correcta y la expresión del receptor. Este enfoque es particularmente útil para determinar la contribución de las regiones cerebrales individuales a componentes específicos de comportamiento y puede ser utilizado a través de cualquier número de paradigmas de comportamiento.

Resultados de la Conducta Al finalizar el experimento, la eficacia de la inactivación temporal específica de la región debe evaluarse cuantitativamente y cualitativamente. El presente ejemplo consiste en un paradigma 3-fase conductual (precondicionamiento sensorial), en el que se administró CNO para atenuar la actividad neuronal en la RSC durante las sesiones de preacondicionamiento para probar la hipótesis de que la RSC es necesario para la formación de asociaciones entre estímulos neutral <su...

Este protocolo describe cómo silenciar temporal y remotamente la actividad neuronal en regiones discretas del cerebro mientras las ratas realizan tareas de aprendizaje y memoria. El enfoque combina la farmacogenética (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) con un paradigma conductual (precondicionamiento sensorial) que está diseñado para distinguir entre los diferentes componentes del aprendizaje.

Un método para Remotamente silenciamiento actividad neural en roedores Durante fases discretas de aprendizaje

This protocol describes how to temporarily and remotely silence neuronal activity in discrete brain regions while animals are engaged in learning and ...

El objetivo de este procedimiento es silenciar temporal y remotamente la actividad neuronal en regiones cerebrales discretas mientras los animales realizan tareas de aprendizaje y memoria. Esto se logra primero cargando un V a a que contiene un receptor diseñado y un reportero en una jeringa para infusión. El segundo paso consiste en infundir un V a a en la región de interés en el cerebro de la rata.A continuación, se prepara y se inyecta sistémicamente en la rata el fármaco diseñado biológicamente inerte, la clozapina y su óxido. El paso final consiste en realizar pruebas conductuales utilizando un paradigma de precondicionamiento sensorial. Finalmente, se utiliza microscopía de inmunofluorescencia en tejido cerebral de rata para verificar la colocación del receptor diseñado.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia del comportamiento, incluyendo, entre otras, la regulación de la motivación, la atención, así como el aprendizaje y la memoria. Asegúrese de seguir todas las precauciones institucionales para trabajar con virus adenoasociados durante todo el procedimiento; el virus utilizado en este video está clasificado como un compuesto de n

a-method-for-remotely-silencing-neural-activity-rodents-during

Research

Investigación

JoVE Journal

Behavior

Comportamiento

En este informe, presentamos un sistema totalmente automatizado y altamente versátil capaz de probar simultáneamente múltiples comportamientos cognitivos y el registro de las actividades neuronales de los roedores.

Un sistema totalmente automatizado y altamente versátil para las pruebas múltiples funciones cognitivas y el registro de las actividades neuronales en los roedores

Coloque un cachorro neonatal anestesiado en una almohadilla térmica.Desinfecte el cuero cabelludo con etanol.Llene una jeringa con una solución viral que contenga virus adenoasociados que porten el gen de un receptor inhibidor activado por fármaco y un tinte de seguimiento.Alinee la punta de la jeringa con la cabeza del cachorro e inyecte lentamente el virus en el cerebro para una distribución uniforme.Deja que el cachorro se recupere.Durante la incubación, las partículas virales ingresan a las...

Silenciamiento quimiogenético de la actividad neuronal en un ratón neonatal

Fuente: Lai, J., et al. Registro electrofisiológico simultáneo y microinyecciones de agentes inhibidores en el cerebro de roedores. J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra una técnica basada en microinyección para el registro e inhibición neuronal simultáneos en el colículo superior de rata. El procedimiento implica la focalización estereotáxica, la perforación del cráneo y la inserción de un inyectrode, que administra un neurotransmisor inhibidor mientras registra la actividad neuronal. La...

Inhibición de la actividad neuronal y su detección mediante electrofisiología en una rata

Se propone un protocolo totalmente automatizado para roedores condicionamiento operante. El protocolo se basa en el control temporal preciso de eventos conductuales para investigar el grado en que las influencias de este control de la actividad neural subyacente de integración sensoriomotora y control cognitivo experimentos.

Un sistema totalmente automatizado Protocolo acondicionado Roedor de Sensorimotor Integración y control de los experimentos cognitivos

El aprendizaje de nuevas asociaciones de estímulo-respuesta se acopla a una amplia gama de procesos neuronales que se reflejan en última instancia en el cambio de pico de salida de las neuronas individuales. Aquí se describe un protocolo de comportamiento que permite el registro continuo de la actividad de una sola neurona mientras que los animales adquieren, extinguen y readquirir una respuesta condicionada en una sola sesión experimental.

Grabación Potenciales de Acción Individual Neuronas &quot;de que se mueven libremente Palomas en sus Tres Etapas del Aprendizaje

Aquí, creamos una pipeta de vidrio con doble función: inhibición de estructuras cerebrales profundas mediante microinyecciones de fármacos y monitorización en tiempo real de sus efectos mediante registros electrofisiológicos simultáneos.

Grabación simultánea electrofisiológico y micro-inyecciones de agentes inhibitorios en el cerebro de roedores

Shuttle-cuadro aprendizaje de evitación está bien establecido en la neurociencia conductual. Este protocolo se describe cómo el aprendizaje en los roedores lanzadera cuadro se puede combinar con microestimulación sitio específico eléctrica cortical (ICMS) y crónica simultánea en grabaciones in vivo como una herramienta para estudiar varios aspectos del aprendizaje y la percepción.

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Extracelular de grabación de la actividad neuronal junto con la aplicación de sustancias Microiontophoretic neuroactivos en ratones Awake

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Construcción de Matrices Microdrive para grabaciones neuronales crónicas en Awake Ratones Behaving

Aprende a silenciar la actividad neuronal en regiones cerebrales específicas de roedores durante tareas de aprendizaje y memoria. Este método farmacogenético permite controlar circuitos neuronales con precisión para estudiar neurociencia conductual.

Un método para Remotamente silenciamiento actividad neural en roedores Durante fases discretas de aprendizaje

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