Un método para Remotamente silenciamiento actividad neural en roedores Durante fases discretas de aprendizaje

El objetivo de este procedimiento es silenciar temporal y remotamente la actividad neuronal en regiones discretas del cerebro mientras los animales se dedican a tareas de aprendizaje y memoria. Esto se logra cargando primero la a a v que contiene un receptor de diseño y un reportero en una jeringa para infusión. El segundo paso es infundir una a V en la región de interés en el cerebro de la rata.

A continuación, se prepara el fármaco de diseño biológicamente inerte clozapina y óxido y se inyecta sistémicamente en la rata. El paso final es realizar pruebas de comportamiento utilizando un paradigma de precondicionamiento sensorial. En última instancia, la microscopía de inmunofluorescencia en el tejido cerebral de la rata se utiliza para verificar la ubicación del receptor de diseño.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia del comportamiento, que incluyen, entre otras, la regulación de la motivación, la atención, el aprendizaje y la memoria. Garantizar que se sigan todas las precauciones institucionales para trabajar con virus adenoasociados en todo momento. El virus utilizado en este video está clasificado como un compuesto de nivel uno de bioseguridad. Prepara una solución de lejía al 10%. La descontaminación es un lugar de residuos, una bega que contiene una solución de lejía y una jeringa estéril de 10 microlitros.

En el espacio de trabajo, coloque el tubo de microcentrífuga que contiene una alícuota de a a V en una carga de tornillo de banco estándar, una jeringa de 10 microlitros con al menos cuatro microlitros de a A v. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en los cuatro microlitros de una solución de a a v. En la jeringa, deseche el tubo de virus vacío en el vaso de precipitados que contiene un 10% de lejía.

Agregue un 10% adicional de lejía al contenedor de desechos y deje reposar los desechos durante 30 minutos antes de desechar los desechos líquidos descontaminados según lo especificado por las pautas institucionales. Prepare el área quirúrgica colocando papel absorbente debajo del aparato estereotáxico y en un espacio adyacente designado como área dedicada al manejo de virus. Después de inducir la anestesia fue de 3% de isof, flúor y oxígeno a razón de un litro por minuto.

Afeitó el pelaje desde entre los ojos hasta ligeramente detrás de las orejas. Después del afeitado, coloque a la rata de nuevo en la cámara de inducción durante tres minutos con la rata asegurada en un aparato estereotáxico. Cubra los ojos con ungüento oftálmico y prepare el sitio de la incisión limpiando con Betadine.

Después de hacer una incisión de 2,4 centímetros en la línea media de la piel, recubriendo el cráneo, comenzando aproximadamente dos milímetros con la cuerda hasta los ojos, retraiga la piel para exponer el cráneo y luego limpie el tejido membranoso del cráneo hasta que bgma y lambda sean claramente visibles. Después de asegurarse de que el cráneo esté plano, coloque el taladro en bgma, ponga a cero las coordenadas y luego mueva el taladro a las coordenadas medial, lateral y anterior posterior deseadas. Taladre un agujero con una broca de 0,9, 0,7 o 0,5 milímetros.

Configure la bomba de infusión para que administre el virus a una velocidad de 0,2 microlitros por minuto. Introduzca la jeringa en el brazo de infusión del dispositivo estereotáxico y baje la jeringa hasta la coordenada deseada. Utilice la bomba para administrar la cantidad deseada de virus después de que se complete la entrega de virus.

Deje la jeringa en su lugar durante 10 minutos para evitar el reflujo en la aguja rastreada, levante lentamente la jeringa a una velocidad de unos cinco milímetros por minuto. A continuación, pase a la siguiente coordenada y repita el procedimiento hasta que todas las coordenadas se hayan infundido con una a v. Después de cerrar la herida y proporcionar analgesia postoperatoria de acuerdo con el protocolo aprobado, coloque a la rata en una jaula limpia con ropa de cama, tapa y señalización adecuada.

Cuando la rata esté completamente recuperada de la anestesia, devuélvala a la sala de alojamiento. Espere tres o más semanas antes de comenzar las pruebas conductuales para asegurar la expresión adecuada del receptor de diseño. Esta figura muestra las tres fases del paradigma de precondicionamiento sensorial, la fase de precondicionamiento, la fase de condicionamiento y la fase de prueba.

El fármaco de diseño, clozapina y óxido o CNO, se utiliza para silenciar la actividad neuronal. Al activar el receptor de diseño, el CNO se puede inyectar antes de cualquier fase de la prueba. Aquí, el CNO se inyecta 30 minutos antes de cada una de las sesiones de preacondicionamiento. Después de preparar una solución fresca de clozapina y óxido de un miligramo por mililitro, de acuerdo con las instrucciones de la parte escrita del protocolo, inyecte el CNO intraperitoneal a una dosis de un miligramo por kilogramo 30 minutos antes de la prueba de comportamiento.

Inicie el código informático para la sesión de comportamiento adecuada. Una vez transcurridos 30 minutos, se colocan las ratas en las cámaras de ensayo y se comienza la primera de las 4 sesiones de preacondicionamiento de 64 minutos presentando a las ratas 12 ensayos entremezclados que consisten en la administración de estímulos auditivos y visuales. En seis de los ensayos, presentar un tono del estímulo precondicional durante 10 segundos, seguido inmediatamente por una presentación de cinco segundos del estímulo de luz intermitente en los otros seis ensayos.

Presenta el ruido blanco, el estímulo no emitido, solo durante 10 segundos. Una vez finalizada la fase de preacondicionamiento, comienza las sesiones de acondicionamiento, que se llevarán a cabo a lo largo de cinco días consecutivos. Presente a las ratas ocho ensayos que consisten en la administración del estímulo visual, la luz intermitente durante cinco segundos seguida inmediatamente por la entrega de 2 gránulos de alimento de 45 miligramos.

Este tiempo incluye intervalos entre ensayos que duran siete minutos cuando se completan las sesiones de acondicionamiento. Realice la única sesión de prueba de 78 minutos presentando a las ratas 12 pruebas entremezcladas que consisten en la administración de los estímulos auditivos solos. En seis de los juicios.

Presenta el estímulo tonal, el estímulo precondición solo durante 10 segundos. En los otros seis ensayos, presente el ruido blanco, el estímulo desapareado solo durante 10 segundos. Una vez completada la tarea de comportamiento, retire inmediatamente las ratas de las cámaras y devuélvalas a la colonia de animales.

Analice los datos de la fase de acondicionamiento y prueba de acuerdo con las instrucciones detalladas en la parte escrita del protocolo. Después de realizar la inmunohistoquímica dirigida contra el reportero marcado o la proteína reportera, examine las secciones de tinción mediante microscopía para determinar la ubicación y la expresión del receptor de diseño y/o reportero como se esperaba. Las ratas de control y experimentales aprendieron de manera similar la asociación pavloviana entre el estímulo de luz intermitente y el alimento. Durante las sesiones de acondicionamiento.

En las sesiones, ambos grupos también estaban motivados para obtener la recompensa alimentaria durante la sesión de acondicionamiento. En contraste, durante la sesión de prueba crítica, las ratas experimentales no lograron discriminar entre los estímulos auditivos precondicionados y los no emitidos, mientras que las ratas de control muestran un mayor comportamiento de la taza de comida en respuesta a las presentaciones del estímulo precondicionado. Por lo tanto, las ratas de control, pero no las experimentales, mostraron el efecto de precondicionamiento sensorial.

Esta imagen muestra la verificación histológica de la localización de la infusión de a v en la región de interés en el cerebro del roedor después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploraran las contribuciones de regiones específicas del cerebro y/o tipos de células al comportamiento complejo in vivo.