Name: Aislamiento de leucocitos a partir de los tejidos murinos en la interfase materno-fetal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Aprenda a aislar leucocitos de la interfase materno-fetal en ratones mediante disociación mecánica y digestión enzimática. Este método preserva marcadores de superficie para citometría de flujo y análisis inmunológico.

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NGL fue apoyado por la Iniciativa Universitaria Perinatal Wayne State en maternas, perinatales y Salud Infantil. Agradecemos Maureen McGerty y Amy E. Furcron (Wayne State University) por su lectura crítica del manuscrito.

Antes de trabajar con las muestras mencionadas en este protocolo, la aprobación ética animal debe ser dada por el Comité de Ética Local de Investigación y las Juntas de Revisión Institucional. Cuando se trabaja con sangre animal, células o agentes peligrosos que se mencionan en este protocolo, las medidas de bioseguridad y seguridad de laboratorio adecuados se deben seguir. 1. Manejo del ratón y Tejidos Colección <ol><li> Preparar una estación de trabajo estéril y obtener herramientas estériles para la recogida de tejidos. Estas herramientas incluyen grandes y pequeñas tijeras quirúrgicas, pinzas y pinzas de punta fina. Incluir pequeñas placas de Petri marcadas con los nombres tejido apropiado, lleno de solución 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) (de 3 - 5 ml) equilibrada a RT de (20 - 22 ° C). También incluir una gran placa de Petri, no marcado, lleno de solución PBS 1x (10 - 15 ml). </li><li> La eutanasia a un ratón embarazadas (10,5 a 19,0 días post-coito (dpc) o antes de la entrega) utilizando dióxido de carbono (CO 2). Para asegurarse de que el ratón es sacrificado, utilice la técnica de dislocación cervical. Nota: Antes de 10,5 dpc, es difícil separar manualmente los tejidos deciduales de los tejidos uterinos. Si no se requiere el aislamiento de los leucocitos deciduales, leucocitos de los tejidos uterinos de ratones no embarazadas o los de ratones a &lt;10,5 dpc pueden también ser realizadas siguiendo este protocolo. </li><li> Con un par de tijeras quirúrgicas estériles, eliminar por completo la parte inferior del abdomen de la piel y el tejido muscular. Con unas pinzas, a un lado todos los demás órganos hasta que el útero y los ovarios son visibles. Con el útero todavía unido, utilice el fórceps para moverlo fuera de la cavidad peritoneal (Figura 1A). </li><li> Localice los ovarios distal a la unión oviducto y uterotubárica de cada cuerno uterino. Uso de las pequeñas tijeras quirúrgicas, hacer una incisión en la unión útero-tubárica y separar los cuernos uterinos de la mesenterio que contiene los vasos uterinos; después,especial en el cuello del útero para separar los cuernos uterinos de la cavidad peritoneal (Figura 1B). </li><li> Con pequeñas tijeras quirúrgicas, hacer una incisión entre el cuello del útero y el segmento inferior de los cuernos uterinos. Dejar adjunta una porción del cuello del útero durante este proceso (Figura 1C) para evitar la apertura de la trompa uterina. </li><li> Sumergir los cuernos uterinos (incluyendo el cuello del útero) en un gran plato de Petri llena con una solución de PBS 1x (10 - 15 ml) para hidratar los sitios de implantación. </li><li> Aunque todavía inmerso en solución de PBS 1x, recortar la grasa de los cuernos uterinos con las pequeñas tijeras quirúrgicas. Mantener los tejidos sumergidos en solución de PBS 1x a lo largo de la disección. </li><li> La celebración de los cuernos uterinos en su lugar con las pinzas, quite uno de los lugares de implantación del útero con un corte transversal a través de la región inter-implantación, utilizando las pequeñas tijeras quirúrgicas (Figura 1D). El sitio de implantación contiene el feto, rodeado por elmembrana corioalantoidea, y el útero, decidual, y los tejidos placentarios. </li><li> Usando las pinzas, mantenga el sitio en su lugar y hacer una pequeña incisión en la pared uterina adyacente a la placenta y los tejidos deciduales (Figura 1E). Recorte alrededor del perímetro de la placenta / decidua hasta que éstos se separan tanto de la pared uterina y la membrana corioalantoidea que incluye el feto (Figura 1F). </li><li> Retire la placenta y tejidos deciduales adjuntos y lugar en solución PBS 1x (3-5 ml; consulte el paso 1.12). </li><li> Coloque el feto rodeado por la membrana corioalantoidea unido a los tejidos uterinos en una placa de Petri llena con solución de PBS 1x (de 3 - 5 ml). La hidratación de estos tejidos facilitará la separación de la membrana corioalantoidea de la pared uterina (véase el paso 1,14). </li><li> Con un par de pinzas de punta fina, pelar suavemente el tejido decidual (capa blanco-gris) de la superficie de la placenta. Realice estepaso cuidadosamente para mantener la integridad de la placenta y los tejidos deciduales (Figura 1G). </li><li> Coloque la placenta y los tejidos deciduales en dos platos etiquetados por separado Petri llenas de solución de PBS 1x (3-5 ml cada una). </li><li> Retire con cuidado la pared uterina de la membrana corioalantoidea con unas pinzas de punta fina. Estos son los tejidos uterinos. </li><li> Coloque los tejidos uterinos en una placa de Petri llena de solución de PBS 1x (de 3 - 5 ml). </li><li> Repita los pasos 1.8 a través de 1,15 hasta que se hayan procesado todos los lugares de implantación. </li><li> Recoger varios uterino, decidual, y tejidos de la placenta para mejorar el rendimiento de las células durante la digestión enzimática. La cantidad de los tejidos depende del tamaño de la camada; sin embargo, el aislamiento de leucocitos requiere&gt; 2 piezas de tejido. Nota: Para obtener información más detallada sobre la disección de los lugares de implantación en diferentes días de gestación, ver las imágenes que se encuentran en el capítulo dos de la Guía de Investigatiel ratón del Embarazo 42. </li></ol> 2. uterino, decidual y placenta Tejido Disociación <ol><li> Etiquetar varios 2 ml estériles tubos cónicos con el nombre de tejido apropiado, y coloque un vial con 1.000 l de solución enzimática en hielo. </li><li> De la placa de Petri llena de solución de 1x PBS, transferir dos piezas (100 - 150 mg) de la uterino, decidual, o tejidos de la placenta a un tubo cónico de 2 ml etiquetados. </li><li> Añadir 500 l de solución enzimática en frío en cada tubo cónico de 2 ml. </li><li> Con tijeras estériles finas, comenzar a disociar el tejido sumergido en la solución enzimática hasta que se picada finamente. Con el tiempo, la suspensión se desarrollará un aspecto lechoso. Este paso no debe exceder más de 2 min para evitar el exceso de manipulación de la muestra. </li><li> Una vez que el tejido ha sido disociado, añadir un extra de 500 l de solución enzimática frío al tubo cónico de 2 ml. </li><li> Coloque el tubo cónico de 2 ml en hielo. </li><li> Repita los pasos 2.2 a 2.6 con cada tejido hasta que se hayan procesado todos los tejidos. </li><li> Transfiera todas las 2 ml tubos cónicos con tejido homogeneizado (tejido picado + solución enzimática) muestras del hielo en una incubadora a 37 ºC y realizar una agitación orbital suave (80 rpm). Incubar durante 30 - 35 min. Asegúrese de que la temperatura de la incubadora se estabiliza antes de iniciar el tiempo de incubación. </li><li> Después de la incubación, retirar los 2 ml tubos cónicos con tejidos disociados de la incubadora y colocarlos en hielo para evitar la digestión más. </li><li> Etiquetar estériles 50 ml tubos cónicos de acuerdo con el tipo de tejido. Retire las tapas y reemplazarlos con un filtro de células estéril (100 micras de tamaño de poro). </li><li> Verter los tejidos disociados de los 2 ml tubos cónicos a través del filtro de células utilizando ~ 20 ml de solución de PBS 1x. Los fragmentos de tejido permanecerán en el filtro de células y la suspensión de células pasarán a través de él. </li><li> Lave el ditejidos ssociated en el filtro de células de 2 - 3 veces con 20 ml de solución de 1x PBS utilizando una pipeta de transferencia. </li><li> Enjuague los vacíos 2 ml tubos cónicos con solución de PBS 1x (1 ml) y verter el contenido a través de los tamices de células. </li><li> Quite los filtros celulares de los 50 tubos cónicos ml y reemplazar las tapas. Centrifugar los tubos a 1250 xg durante 10 min a 4 ºC. </li><li> Con cuidado, aspirar el sobrenadante sin alterar el sedimento celular. El sedimento celular contiene los leucocitos aislados y células del estroma. </li><li> Vuelva a suspender el sedimento celular en 1 ml de medio de cultivo RPMI sin suero fetal bovino (FBS). Mezclar suavemente. No utilice vórtice. </li><li> Añadir 500 l de FBS limpias a un tubo de plástico de poliestireno de 5 ml y superponer lentamente la suspensión celular. </li><li> Centrifugar durante 10 min a 1.100 xg sin el freno a TA para sedimentar las células viables mientras que los desechos celulares se retiene en la interfase PBS / FBS. </li><li> Aspirar el sobrenadante sin tocar el sedimento celular. El cell pellet contiene principalmente células viables. </li><li> Opcionalmente: Para concentrar las células mononucleares, utilizar una solución de polisacárido saturada 20%, como se describe a continuación. <ol><li> Resuspender el sedimento celular en 1.000 l de medio de cultivo RPMI sin FBS. </li><li> Añadir 1 ml de solución de polisacárido saturada 20% a un tubo de plástico de poliestireno de 5 ml y superponer lentamente la suspensión celular en la parte superior de esta solución, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Mientras capas de la muestra, evitar la mezcla de la solución de polisacárido saturada 20% con la suspensión de células. </li><li> Centrifugar con un rotor basculante a 500 xg durante 30 minutos a temperatura ambiente y sin freno. Es muy importante para desactivar el freno para evitar la mezcla de las células y perder el gradiente. Las células mononucleares se encuentran en la interfaz entre la solución de polisacárido saturada 20% y la solución 1x PBS. </li><li> Aspirar y desechar el sobrenadante. El sedimento celular contiene células mononucleares en su mayoría. Note: Para realizar la tinción de viabilidad y tinción intracelular, consulte el paso 3. Para realizar inmunofenotipo, consulte el paso 4. Para llevar a cabo la tinción de viabilidad y sólo tinción extracelular, consulte el paso 5. Para realizar un cultivo de células de leucocitos aislados, consulte el paso 6. Para llevar a cabo clasificación de células magnético, consulte el paso 7. </li></ol></li></ol> 3. La tinción de viabilidad de células fijables <ol><li> Resuspender el sedimento celular en 1.100 l de solución de PBS 1x. Mezclar suavemente utilizando un micro-pipeta. </li><li> Transferir 100 l de la suspensión celular en un tubo de plástico 5 ml de poliestireno. Añadir 400 l de solución de PBS 1x para el tubo de poliestireno de 5 ml. Este tubo es un control para el tejido auto-fluorescencia. Almacenar a 4 ° C hasta el paso 3.5. </li><li> La transferencia de los 1000 l restantes de la suspensión celular a un nuevo tubo de plástico de poliestireno de 5 ml. Añadir 1 l de colorante viabilidad y homogeneizar suavemente. Incubar durante 30 minutos en la oscuridad a 4 ° C. </li><li> Después de la incubación, añada 1000 &amp; #181; l de solución de 1x PBS. Mezclar suavemente con la mano. </li><li> Centrifugar ambos tubos de plástico de poliestireno 5 ml (pasos 3.2 y 3.3) a 1250 xg durante 10 min a 4 ºC. Aspirar y desechar el sobrenadante. Nota: El sedimento celular (paso 3.3) se utilizará en el paso 4. El pellet de células (paso 3.2) servirá como un control para el tejido auto-fluorescencia. </li></ol> 4. Inmunofenotipificación <ol><li> Resuspender el sedimento celular en 50 l de anti-ratón CD16 / CD32 (diluido 1: 100 en tampón FACS [0,1% de BSA, azida de sodio 0,05%, solución 1x PBS, pH 7,4]). Mezclar la suspensión celular suavemente. No utilice el vórtice. </li><li> Incubar la suspensión de células en el tubo de poliestireno de 5 ml en la oscuridad a 4 ° C durante 10 min. </li><li> Después de la incubación, añadir 50 l de cada anticuerpo monoclonal anti-leucocitos reaccionar con marcadores de superficie celular extracelular o anticuerpo de control de isotipo (diluciones de anticuerpos deben ser validados). Por ejemplo, para analizar subpoblaciones de leucocitos, usar anti-moutilizar anticuerpos que reaccionan con los siguientes marcadores de superficie de células de leucocitos: CD45, Ly6G, F4 / 80, CD11c, CD49b, B220, CD3, CD4, y CD8 (Tabla 1). </li><li> Una vez que los anticuerpos contra marcadores extracelulares se han añadido al tubo de plástico de poliestireno 5 ml, mezclar suavemente. Incubar en la oscuridad durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Durante esta incubación, preparar y pre-calentar la solución tampón de fijación (diluido con agua desionizada, 1: 5) a 37 ºC, si es necesario. Mantenga el tampón a 37 ºC en la oscuridad hasta que su uso es necesario. </li><li> Después de 30 min de incubación, añadir 500 l de tampón FACS en el tubo de plástico de poliestireno de 5 ml y mezclar suavemente. Este paso es necesario para lavar las células y eliminar el exceso de anticuerpo no unido. </li><li> Centrifugar las muestras a 1250 xga 4 ° C durante 10 minutos. Aspirar y desechar el sobrenadante. Nota: Si no se requiere la tinción intracelular, consulte el paso 5. Si se requiere la tinción intracelular, realice permeabilización y intracelulartinción ular aquí y, a continuación, proceder a la fijación (paso 4.8). </li><li> Añadir 500 l de la solución tampón de fijación pre-calentado al sedimento celular y se incuba en la oscuridad durante 10 min a 37 ºC. </li><li> Dispensar 500 l de tampón FACS en el tubo de plástico de poliestireno de 5 ml. Mezclar suavemente. </li><li> Centrifugar las muestras a 1250 xga 4 ° C durante 10 minutos. Aspirar y desechar el sobrenadante. </li><li> Añadir 500 l de tampón de FACS a cada muestra. Estas muestras pueden ahora ser analizadas por citometría de flujo. Adquirir las muestras inmediatamente para obtener mejores resultados. </li></ol> 5. La tinción de viabilidad de células irreparable <ol><li> Después de inmunofenotipificación extracelular, resuspender el sedimento celular en 500 l de tampón FACS. </li><li> Añadir 1 l de 4 &#39;, dihidrocloruro de 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 200 g / ml) justo antes de la adquisición de la muestra. </li><li> Visualice las muestras dentro de 1 - 2 minutos después de la adición de DAPI utilizando un citómetro de flujo. </li></ol><ol><li> Preparar una estación de trabajo bajo una campana de humos estéril. Pre-calentar el medio de cultivo RPMI a 37 ° C usando un baño de agua. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 1.000 l de tampón FACS para el recuento celular. </li><li> Contar el número de células viables utilizando un contador celular automático o hemocitómetro y solución de azul de tripano al 0,4%, siguiendo las instrucciones del fabricante. Anote el número total de células vivas. </li><li> Centrifugar las células a 1250 xga 4 ° C durante 10 min para eliminar el tampón FACS. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 500 l de medio de cultivo RPMI-pre calentado suavemente pipeteando 2 a 3 veces. </li><li> Placa el número deseado de células en una placa de 24 pocillos estéril y se incuba a 37 ° C. El tiempo de incubación será determinado por la pregunta de investigación. </li></ol> 7. Clasificación celular magnética <ol><li> Configurar una estación de trabajo limpia con los siguientes materiales: Columnas MS, separador celular magnética, 15tubos cónicos ml, 30 micras filtros pre-separación, y un multi-soporte. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 500 l de tampón MACS (0,5% de BSA, 2 mM EDTA, solución 1x PBS, pH 7,2). </li><li> El uso de un contador de células automático o hemocitómetro y el 0,4% de solución de azul de tripano, contar y registrar el número total de células vivas. </li><li> Centrifugar las células a 1250 xga 4 ° C durante 10 minutos. Aspirar y desechar el sobrenadante. Añadir otros 500 l de tampón MACS. </li><li> Proceda a realizar la separación magnética siguiendo las recomendaciones del fabricante. </li><li> Determinar la pureza por citometría de flujo o microscopía. </li></ol>

Los autores describen ningún conflicto de intereses.

La recogida de datos consistentes que registra las características de abundancia y fenotípicas de los leucocitos infiltrantes en la interfase materno-fetal es esencial para la comprensión de la patogénesis de las complicaciones relacionadas con el embarazo. Varias técnicas se han descrito que facilitan el aislamiento de la infiltración de leucocitos de los tejidos murinos en la interfase materno-fetal durante el embarazo 31,38,39,43-46. Sin embargo, cada técnica es diferente, utiliza enzimas o combinaciones d...

La tolerancia inmune durante el embarazo es un período en que se producen cambios distintivos en el sistema inmunológico de la madre. Estos cambios permiten a la madre para tolerar el feto, un injerto alogénico semi-1. El feto expresa paternal complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) antígenos de 2, y las células fetales se han encontrado en la circulación materna 3; sin embargo, el feto no se rechaza 4,5. Este enigma no se entiende completamente. La hipótesis más reciente afirma que se crea la tolerancia materno-fetal durante el coito y su fecundación 6,7 y mantenido para sostener un embarazo a término 8-10. El desglose de esta tolerancia materno-fetal se considera un mecanismo de la enfermedad durante las primeras y últimas etapas del embarazo 10-16. La tolerancia materno-fetal consiste en la participación de los diversos sub-poblaciones de leucocitos, incluyendo las células T (células T reguladoras, las células Th1, células Th2 y células Th17), macrophages, neutrófilos, mastocitos, células NK, y células NKT, células dendríticas y células B, que el cambio en la densidad y localización durante todo el embarazo 15,17-19. Tolerancia materno-fetal se enriquece en la interfase materno-fetal 20 - el sitio anatómico donde el sistema inmune de la madre interactúa con los antígenos fetales 20,21. Se crea la interfaz materno-fetal durante la placentación cuando las células trofoblásticas extravillous fetales invaden la mucosa uterina 22-24. En el lado fetal de esta interfaz, las membranas que rodean al feto crean una superficie epitelial especializada dentro de la placenta, y las células sincitiotrofoblasto controlan el intercambio de nutrientes a través de su contacto directo con la sangre materna 22. En el lado materno de la interfaz, el decidua recluta una piscina heterogéneo de leucocitos en ratones que representan el 30% a 50% de todas las células deciduales. Además de su participación en maternAl tolerancia inmune, estas células son los principales contribuyentes a los distintos procesos durante el embarazo, por ejemplo., la protección del tracto reproductivo de las infecciones, la fecundación, la implantación del embrión 7,25, la angiogénesis decidual 26, remodelado vascular 24,27, la invasión del trofoblasto 28, de la placenta desarrollo 24,25, y, en última instancia, el trabajo y la entrega 15,17. Por lo tanto, el estudio de los leucocitos implicados en la tolerancia materno-fetal es esencial para dilucidar la patogénesis de las complicaciones relacionadas con el embarazo. Aunque el uso de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia ha generado datos para la visualización directa y localización de uterina, decidual, o leucocitos placentarios 29,30, citometría de flujo análisis ha revelado también subconjuntos específicos de leucocitos en cada uno de estos tejidos 31,32. Además, la citometría de flujo se ha utilizado para determinar la densidad y la proporción de maternal-fetal interfaz de leucocitos 33 y de expresión los niveles de proteínas extracelulares e intracelulares 8-10,34. Análisis de citometría de flujo de leucocitos en la interfase materno-fetal requiere una suspensión de una sola célula. Con el fin de aislar los leucocitos infiltrantes de la decidual, uterino, y tejidos de la placenta, se han utilizado dos métodos de disociación de tejidos: mecánica y enzimática. Ambos métodos permiten la separación de los leucocitos infiltrados de la matriz extracelular (ECM) de estos tejidos. Disociación enzimática de tejido es superior a la disociación de tejido mecánica, ya que permite un mayor rendimiento de los leucocitos con daño asociado a la fuerza de cizallamiento menos 35. En consecuencia, la disociación de tejido mecánico requiere la agrupación de tejidos 36, que pueden aumentar la variabilidad y la heterogeneidad de las muestras. Sin embargo, la disociación mecánica puede ser la opción cuando el antígeno de interés puede ser alterada por disociación enzimática o cuando la funcionalidad de la células de las necesidades de interés que se conserva (por ejemplo., la citotoxicidad de las células NK) 35. El uso de la proteolisis con enzimas específicas para degradar la ECM elimina los bajos rendimientos observados con disociación mecánica. Varios estudios han reportado el uso de tripsina 32, colagenasa 37, DNasa 31, Dispasa 38 y cócteles comerciales de diversas enzimas 32,39. Sin embargo, la naturaleza y concentración de diferentes enzimas y la duración de la digestión deben ser meticulosamente definidos y validados con el fin de asegurar el mantenimiento de la integridad de los epítopos antigénicos de la superficie celular necesarias para inmunofenotipo. Las diversas estructuras de la superficie son diferencialmente susceptibles a la destrucción por diferentes enzimas, con algunas enzimas, tales como tripsina, siendo notorio para pelar epítopos de superficie de leucocitos reconocidos por muchos anticuerpos monoclonales. Introducido en el presente documento es un método que utiliza un proteolytic y cóctel enzimático colagenolítica, llamado Accutase. Esta solución enzimática es lo suficientemente suave mientras que todavía eficiente en disociar tejidos murinos en la interfase materno-fetal, y no requiere la adición de otros reactivos o suero de disociación para terminar la reacción de disociación. Por otra parte, está listo para usar tal como se suministra y, aunque el tiempo de disociación debe ser validado, es más robusto que las enzimas mencionadas anteriormente 40,41. La utilización de una combinación de ambos tipos de desagregación del tejido mejora la calidad y la cantidad de células obtenidas; Por lo tanto, varios estudios han implementado el uso combinado de disociación mecánica y enzimática con resultados satisfactorios 31,32,37. El protocolo descrito en este documento se estableció y validó en nuestro laboratorio; que utiliza una combinación de una disociación mecánica suave seguido por una desagregación enzimática robusto. Este protocolo permite el estudio y el aislamiento adicional delos leucocitos infiltran en los tejidos murinos en la interfase materno-fetal (útero, decidua y placenta). El siguiente protocolo también mantiene la integridad de los marcadores de superficie celular y los rendimientos de células viables suficiente para aplicaciones posteriores como se demuestra por análisis de citometría de flujo. Finalmente, este protocolo mantiene la consistencia de la preparación de células para el análisis y la comparación de diferentes tejidos murinos que componen la interfaz materno-fetal.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Magentic Cell Separation</td></tr><tr><td>MS Columnas</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Separador de células</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>30 &mu; m filtros de preseparación</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Multistand</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos de 15 ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>MACS Buffer</td><td>Militenyi Biotec</td><td>Preparación de laboratorio</td> <td>(0,5% albúmina sérica bovina, 2mM EDTA y 1x PBS, pH 7,2)</td></tr><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Solución enzimática Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ratón CD16/CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>533142</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpos extracelulares anti-ratón</td><td>BD Bioscences/eBiosciences</td><td></td><td>Tabla 1</fuerte></td></tr><tr><td>Azida sódica</td><td>Fisher</td><td>S227-500</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>VIVO/MUERTO colorante de viabilidad</td><td>Life Technologies</td><td>L23105</td><td></td></tr><tr><td>Solución tampón</td><td>de fijación BD Biosciences</td><td>558049</td><td></td></tr><tr><td>FACS Tampón BD</td><td>Biosciences</td><td>Preparación de laboratorio</td><td>0,1% BSA, 0,05% azida sódica, 1x PBS, pH 7,4</td></tr><tr><td>Solución de azul de tripano 0,4</td><td>%BIO-RAD</td><td>145-0013</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Instrumentos adicionales</td></tr><tr><td>Incubadora con agitador</td><td>Thermo Scientific</td><td>MaxQ 4450</td><td></td></tr><tr><td>Citómetro de flujo</td><td>BD LSRFortessa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>Legend LXTR</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de vacío</td><td></td><td></td><td>construido en laboratorio</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Thermo Scientific</td><td>Incubadora 3307</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Precisión</td><td>51221035</td><td></td></tr><tr><td>Contador de células</td><td>BIO-RAD</td><td>TC20 Contador</td><td></td>de células automatizado</tr><tr><td>Microscopios ópticos y de fluorescencia</td><td>Zeiss y Olympus Zeiss</td><td>LSM780 y Olympus CKX41</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de leucocitos a partir de los tejidos murinos en la interfase materno-fetal

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

La tolerancia inmunológica en el embarazo requiere que el sistema inmunológico de la madre experimenta cambios distintivos para aceptar y nutrir al feto en desarrollo. Esta tolerancia se inicia durante el coito, establecido durante la fecundación y la implantación, y se mantiene durante todo el embarazo. Mediadores celulares y moleculares activos de la tolerancia materno-fetal se enriquecen en el sitio de contacto entre los tejidos fetales y maternas, conocidos como la interfaz materno-fetal, que incluye la placenta y el útero y los tejidos deciduales. Esta interfaz se compone de las células del estroma y leucocitos infiltrantes, y sus características fenotípicas de abundancia y cambia en el transcurso del embarazo. Leucocitos infiltrantes en la interfase materno-fetal incluyen neutrófilos, macrófagos, células dendríticas, mastocitos, células T, células B, células NK, las células NKT y que juntos crean el micro-entorno local que sustenta el embarazo. Un desequilibrio entre estas células o cualquier inappropalteración piados en sus fenotipos se considera un mecanismo de la enfermedad en el embarazo. Por lo tanto, el estudio de los leucocitos que se infiltran en la interfase materno-fetal es esencial con el fin de dilucidar los mecanismos inmunológicos que conducen a complicaciones relacionadas con el embarazo. Descrito en el presente documento es un protocolo que utiliza una combinación de disociación mecánica suave seguido por una desagregación enzimática robusto con una proteolítica y cóctel colagenolıtica enzimática para aislar los leucocitos infiltrantes de los tejidos murinos en la interfase materno-fetal. Este protocolo permite el aislamiento de un gran número de leucocitos viables (&gt; 70%) con propiedades antigénicas y funcionales suficientemente conservadas. Leucocitos aislados pueden ser analizados mediante varias técnicas, incluyendo la inmunofenotipificación, clasificación de células, formación de imágenes, inmunotransferencia, la expresión de ARNm, cultivo celular, y en ensayos funcionales in vitro tales como reacciones mixtas de leucocitos, la proliferación, o ensayos de citotoxicidad.

La disección de los tejidos murinos de la interfaz materno-fetal se muestra en la Figura 1; Este procedimiento incluye la apertura de la cavidad peritoneal (Figura 1A, B), cuernos uterinos (Figura 1C), incluyendo los sitios de implantación (Figura 1D), y la colección de los tejidos uterinos (Figura 1E), placenta (Figura 1F), y los tejidos deciduales (Figura 1G) a 16,5 dpc. La Figura 2 m...

En este trabajo se describe un protocolo para aislar y analizar los leucocitos infiltrantes de tejidos en la interfaz materno-fetal (útero, decidua y placenta) de ratones. Este protocolo mantiene la integridad de la mayoría de los marcadores de superficie celular y produce suficientes células viables para aplicaciones posteriores, incluido el análisis de citometría de flujo.

Aislamiento de leucocitos a partir de los tejidos murinos en la interfase materno-fetal

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar los leucocitos infiltrantes de la interfaz feto-materna murina. Esto se logra primero mediante la extracción del útero, la placenta y el Eua. Los tejidos se descomponen mediante disociación mecánica en una solución enzimática, seguida de una digestión enzimática posterior.La suspensión celular resultante se filtra y se lava, momento en el cual las células inmunitarias de interés se separan de los restos celulares, como las células no viables, mediante un gradiente de suero bovino fetal. Finalmente, los leucocitos aislados pueden utilizarse para inmunofenotipificación, cultivo celular o clasificación de células. Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando intentábamos establecer un protocolo para aislar leucocitos de la interfase materno-fetal, y nos dimos cuenta de que los métodos publicados no facilitaban el aislamiento de las células inmunitarias raras que son de nuestro interés.Una demostración. El procedimiento será realizado por Mile El Sánchez Rodríguez y Marcina Hernández, quienes son asociadas de investigación de mi laboratorio. Para colectar los tejidos de la interfaz materno-fetal, comience utilizando un par de tijeras quirúrgicas estériles para remover completamente la porción abdominal inferior de la piel y del tejido muscular. A continuación, utilice pinzas para separar todos los demás órganos hasta que sean visibles el útero y los ovarios. Luego, mueva el útero fuera de la cavidad peritoneal.Localice los ovarios distales al TCU y la unión uterotubárica de cada cuerno uterino. A continuación, realice una incisión en la unión uterotubárica para separar los cuernos del mesenterio que contiene los vasos uterinos. Seccione a nivel del cuello uterino para separar los cuernos uterinos de la cavidad peritoneal.Luego, utilice tijeras quirúrgicas para realizar una incisión entre el cuello uterino y el segmento inferior de los cuernos, dejando una porción del cuello uterino adherida para evitar abrir el cuerno uterino. Sumerja los cuernos y el cuello uterino en una placa de Petri grande llena con 10 a 15 mililitros de PBS para hidratar los sitios de implantación. Elimine cualquier grasa presente en los tejidos.Luego, mantenga los cuernos en su lugar con la pinza. Realice un corte transversal a través de una región interimplantacional para eliminar uno de los sitios de implantación del útero. Ahora sostenga el sitio en su lugar y haga una pequeña incisión en la pared uterina adyacente a los tejidos placentarios y residuales.Recorte alrededor del perímetro de la placenta y la decidua hasta que los tejidos se separen tanto de la pared uterina como de la membrana corioamniótica. Luego, transfiera la placenta y los tejidos deciduales adyacentes a una placa de Petri nueva que contenga de tres a cinco mililitros de PBS. Transfiera el feto a otra placa de Petri con PBS y utilice pinzas de punta fina para desprender suavemente el tejido decidual de color blanco grisáceo de la superficie placentaria.Teniendo cuidado de mantener la integridad de los tejidos placentarios y del ECI. Divida los tejidos placentario y del ECI en dos placas de Petri individualmente etiquetadas, llenas de PBS. Luego, use pinzas de punta fina para retirar suavemente la pared uterina del corion y la membrana amniótica y coloque estos tejidos uterinos en una nueva placa de Petri llena de PBS para disociar mecánicamente los tejidos.A continuación, transfiera dos discos uterinos y tejidos placentarios de 100 a 150 miligramos a tubos cónicos de dos mililitros etiquetados individualmente. Añada 500 microlitros de solución enzimática fría uno a cada tubo. Luego, use tijeras estériles para disociar mecánicamente cada uno de los tejidos durante no más de dos minutos hasta obtener las suspensiones.Desarrollarán una apariencia lechosa. Añadir 500 microlitros adicionales de solución enzimática fría, uno a cada tubo, y colocar los tubos en hielo. A continuación, incubar todos los tejidos a 37 grados Celsius con una agitación orbital suave a 80 RPM, colocando los tubos en hielo después de 30 a 35 minutos para detener la digestión.Ahora, filtre cada homogeneizado de tejido a través de un filtro de 100 micrones hacia tubos cónicos de 50 mililitros individualmente etiquetados, y lave cada tubo de dos mililitros y filtro dos o tres veces con 20 mililitros de PBS para recolectar todas las células. Una vez que todas las células hayan sido filtradas, centrifúguelas y aspire cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar los botones celulares. Reuspenda suavemente los leucocitos y células estromales aislados en un mililitro de medio de cultivo RPMI, sin usar vortex.Luego, para cada tejido, agregue 500 microlitros de suero bovino fetal en un tubo de poliestireno de cinco mililitros y superponga lentamente la suspensión celular sobre el suero. Finalmente, cuando todas las células hayan sido superpuestas, centrifugue las células sin desaceleración y aspire el sobrenadante sin tocar los pellet celulares. En estas imágenes, la morfología de los macrófagos positivos para F cuatro 80 aislados de tejidos deciduales y uterinos.A los 16,5 días posteriores al parto, se muestran células procedentes de ambos tejidos de la interfase materna y fetal. Presentan una viabilidad superior al 70 % tras el aislamiento mediante este método y contienen poblaciones de neutrófilos, macrófagos, células T, células NK y células dendríticas, con una alta proporción de macrófagos que coexpresan subpoblaciones de leucocitos CD11c aisladas de tejidos en la interfase maternofetal. También incluyen células B y células T positivas para CD4, células T positivas para CD8, y células T positivas para CD3, negativas para CD4 y negativas para CD8, que también se aíslan, como se observa en este gráfico de densidad.Vale, al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener los tejidos y el cóctel de enzimas en hielo, ajustar la temperatura correcta en el incubador y no manipular en exceso los tejidos durante la digestión tras seguir este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos como inmunofenotipificación, cultivo celular, clasificación celular y aislamiento de ADN-ARN. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar los leucocitos infiltrantes en la interfase materno-fetal, el útero y la placenta.

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Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Aislamiento de leucocitos a partir de los tejidos murinos en la interfase materno-fetal

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