Name: Generación de oscilaciones γ CA1 locales por tetánica Estimulación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Aprende a preparar rebanadas cerebrales para registrar oscilaciones gamma en la región CA1 del hipocampo mediante estimulación tetánica. Este método permite evaluar efectos de fármacos sobre la excitabilidad neuronal y comprender mecanismos de enfermedades neurológicas como epilepsia y autismo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Con el apoyo de APA a RJH, 400121 de subvención del programa NHMRC a SP y 1005050 de becas de NMHRC a SP. CAR reconoce el apoyo de ARC (FT0990628) y el esquema de becas DOWD. El Instituto Florey de Neurociencia y Salud Mental cuenta con el apoyo de fondos de infraestructura del gobierno del estado de Victoria.

Todos los experimentos con ratones fueron aprobados por el comité de ética animal Florey Instituto. 1. Configuración para cortar rebanadas de cerebro <ol><li> Preparar una solución de corte compuesto por (mM) 125 La colina-Cl, 2,5 KCl, CaCl2 0,4, 6 MgCl2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3, 20 D-glucosa satura con gas carbógeno (95% O 2 -5 % de CO 2) y un líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa solución) de grabación consta de (mM) 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 10 D-glucosa, saturado con carbógeno. Coloque la solución de corte en el hielo para mantenerlo frío. </li><li> Congelar aproximadamente 400 ml de la solución de corte y mezclar junto con 100 ml de solución de corte no congelada para crear una suspensión de hielo. Burbuja con carbógeno (95% O 2 -5% de CO 2) a un flujo de aproximadamente 0,5 L / min a través de pequeños cAliber tubo o de vidrio sinterizado para producir un flujo constante pero suave de burbujas. </li><li> Preparar un vaso de precipitados de 250 ml con un inserto de malla de nylon elevada sobre la que se colocarán los cortes de cerebro. Rellenar con LCRa para cubrir la malla de aproximadamente 2 cm y burbuja con carbógeno, asegurando que las burbujas no interrumpen directamente el área del sector sostiene. También es importante que no haya burbujas de aire en la malla de nylon, por lo que si están presentes los eliminan. Esta será la cámara de retención y se mantiene a temperatura ambiente (20 - 25 ° C). </li><li> Layout los instrumentos de disección incluyendo un gran par de tijeras, un pequeño par de tijeras, pequeños y grandes espátulas micro y parejas grandes y pequeños de fórceps y relajarse en hielo. Coloque el bloque de corte de tejido vibratome sobre hielo en un cuadrado de papel de aluminio. Obtener 2 piezas de 6 cm de papel de filtro, una cuchilla de afeitar sola punta, y un vaso de precipitados de 25 ml llena con la suspensión de solución de corte también. </li><li> Llene un segundo recipiente con hielo, y poner un pedazo de tejido paper en el hielo y colocar una placa de cultivo de 12 cm en la parte superior. Llene la placa de cultivo con el corte de solución de suspensión de hielo y burbujas con carbógeno. Este es el contenedor en el que se realizará con la disección del cerebro. </li><li> Prepare el vibratome. Eliminar una hoja de afeitar de doble filo fresco (use una hoja fresca cada vez) de su envoltorio y rociar con etanol al 80% de agua desionizada a continuación. Cortar un 3 ml pipeta de transferencia de plástico en el punto donde comienza a disminuir. Esto se utiliza para transferir rodajas de cerebro. Doble un 27 G aguja en la base en aproximadamente 45 ° y se unen a una jeringa de 1 ml. Esto será utilizado para manipular rebanadas durante el corte. </li></ol> 2. Cortar las rebanadas del cerebro <ol><li> Anestesiar un ratón (P16 - P18) con un 2% de isoflurano o un método aprobado a nivel local. Después de la inducción, decapitar al animal con un gran par de tijeras y colocar la cabeza en la placa de cultivo de 12 cm que contiene burbujeado suspensión solución de corte. La suspensión debe sumergir totalmente la cabeza deenfriamiento rápido. </li><li> Mantenga la parte delantera de la cabeza con una mano el pelado de la piel y el tejido conectivo hacia adelante hacia la nariz. Utilizando las pequeñas tijeras cortar el tejido conectivo para revelar el cráneo subyacente. A continuación, retire los músculos que recubren cara dorsal del cráneo y el cuello. </li><li> Retire el cerebro del cráneo fijando primero la parte frontal del cráneo con las grandes pinzas y luego hacer dos cortes laterales a través del hueso de cada lado del agujero occipital utilizando las tijeras pequeñas (Figura 1, cortes etiquetados A1 y ​​A2). <ol><li> Haga otro corte entre los ojos (justo anterior del bregma) (Figura 1, corte la etiqueta B) luego cuidadosamente cortado a lo largo de la sutura sagital anterior y reflejar las secciones del cráneo corte para revelar el cerebro (Figura 1, corte C marcado). </li><li> Utilice la espátula para sacar el cerebro y el lugar en una placa de cultivo. Tenga en cuenta el crannervios ial en la cara inferior del cerebro que tendrá que ser cortadas, esto se puede hacer con la espátula micro tamaño más pequeño. Usando la espátula más grandes transfieren el cerebro para el vaso de precipitados de 25 ml lleno con la suspensión de solución de corte. </li></ol></li><li> Preparando el hemisferio cerebral para cortar. <ol><li> Coloque un pedazo de papel de filtro 6 cm en la parte inferior de una placa de cultivo fresco luego rellenar con lechada fresca solución de corte y de la burbuja. Utilice la espátula grande para colocar el cerebro, con el lado ventral hacia abajo, sobre el papel de filtro. Tome una hoja de afeitar nueva y limpia solo filo y cortar el cerebro para eliminar el cerebelo, a continuación, hacer un corte a lo largo de la línea media para separar el cerebro en dos hemisferios. </li></ol></li><li> Preparación del bloque de tejido vibratome. <ol><li> Tome el bloque de tejido vibratome fría, secar la superficie y colocar una gota de pegamento de cianoacrilato en el medio y extender uniformemente con el tamaño aproximado del cerebro. Utilice la pequeña espátula para manipular uno de lahemisferios cerebrales sobre la espátula grande micro por lo que el lado medial del cerebro está en el suelo. </li><li> Toque el borde de la espátula en la interfaz del cerebro en la segunda pieza de papel de filtro para eliminar la mayor cantidad de la solución posible. Deslice el cerebro de los más grandes espátula utilizando la espátula pequeña para guiarla en la cola. </li><li> Asegure el bloque de corte en la cámara vibratome y llenar la cámara con lechada de solución de corte y de la burbuja, lo que garantiza que el cerebro está completamente inmerso. Gire el bloque de corte por lo que la parte ventral del cerebro se enfrenta a la hoja. </li></ol></li><li> Cortando el cerebro. Nota: Cada vibratome es única así que siga las instrucciones del fabricante. <ol><li> Ajuste el grosor de corte de 450 m, y garantizar la cuchilla está vibrando mientras se mueve a través del cerebro a una velocidad de aproximadamente 0,3 mm / s. Cortar por completo a través del cerebro desde la parte ventral a la superficie cortical, esto producirá cerebro rebanadas sagital enteros que pueden Be utilizado para registros electrofisiológicos. Rebanadas serán producidos lateralmente a medialmente y típicamente 3 - 4 rebanadas se pueden cortar de cada hemisferio. </li><li> Si la base de los ascensores rebanada utilizar la inclinación 27 G aguja suave presión el corte hacia abajo. Como se corta cada rebanada, utilice la pipeta de transferencia para moverlo a la plataforma en la cámara de contención en el que son viables para un máximo de 8 horas. </li></ol></li></ol> 3. extracelulares Electrofisiología Grabaciones <ol><li> Montaje de la rebanada en la cámara de grabación. <ol><li> Usando la pipeta de transferencia, coloque una rebanada de cerebro en una cámara de grabación sumergida perfundido con LCRa que fluye a 1 - 2 ml / min y se calienta a 32 ° C. El LCRa utilizado para grabaciones difiere de la de la cámara de retención como la concentración de Mg 2+ se incrementa de 2 mM a 4 mM. </li><li> Asegure la rebanada con un &quot;arpa&quot; (acero inoxidable semi circular con cadenas de nylon estirados a través de 2 - 3 mm de separación). Lugarel arpa de modo que las cadenas corren paralelas CA1. Aumentar la velocidad de la perfusión a 8 - 10 ml / min a 32 ° C. </li></ol></li><li> Bajo un microscopio de disección lugar un electrodo de estimulación y un electrodo de registro (electrodo de vidrio lleno con la solución de grabación LCRa) en la superficie de la stratum radiatum de la CA1 (Figura 2A). Coloque el electrodo de estimulación primero y luego colocar el electrodo de registro. </li><li> Estimular el Schaffer colaterales con un 120 - 150 mu amplitud y 0,1 ms pulso de prueba de duración y observar el campo de post sináptica excitatoria potencial (fEPSP) forma de onda resultante para determinar la salud rebanada (Figura 2B). Los electrodos de estimulación y registro pueden necesitar ser movido en la rebanada de aproximadamente 50 - 100 micras de la superficie de la rebanada para obtener un fEPSP grabación con una pequeña volley fibra y gran amplitud. La garantía Schaffer evocó fEPSPs son estereotipadas y proporcionan un buen indicador de la salud de la rebanada. Healthy rebanadas típicamente muestran una volea fibra para fEPSP relación de amplitud inferior a 0,3. </li><li> Reposicionamiento de los electrodos. <ol><li> Usando un microscopio de disección, mover el electrodo de estimulación a la mitad de los estrato oriens y mover el electrodo de registro a la capa de células piramidales tan cerca del electrodo de registro como sea posible, como se muestra en la Figura 3A. Los electrodos de estimulación y registro pueden necesitar ser empujado en la rebanada de aproximadamente 50 - 100 micras de modo que la respuesta de amplitud fEPSP a la 120 - 150 mu pulso de prueba es de aproximadamente 1 mV. </li></ol></li><li> Generación de oscilaciones γ. <ol><li> Para generar oscilaciones γ estimulan el tejido con un tren de pulsos de 20 x 0,1 mseg entregados a 200 Hz. Este estímulo tetánica puede dar respuestas reproducibles cuando se entrega cada 5 minutos. </li></ol></li><li> Utilice los siguientes parámetros de grabación. <ol><li> Escala la ganancia de la señal de salida para que coincida con el voltaje de entrada delel convertidor de analógico a digital. Asegúrese de que la señal máxima esperada excursión utiliza un mínimo de 30% del rango de tensión de entrada. Tenga cuidado al ajustar las ganancias a alto como señales pueden recortar. El ancho de banda típica necesaria para grabaciones de campo es de 500 Hz con acoplamiento de CA a 0,1 Hz para eliminar la deriva de línea base. </li><li> Digitalizar al menos 4-5 veces más rápido que la frecuencia de corte del filtro de paso bajo para evitar el aliasing de señales. </li></ol></li><li> Análisis de los datos. <ol><li> Alto de paso de datos de filtro de 5 Hz para eliminar cualquier cambio de línea de base. Identificar los picos utilizando un umbral derivado, con una separación mínima caso de 10 ms, un tiempo de evento típico a pico y el intervalo de regresión de 7 ms, un umbral de ~ 100 mV / mseg, y un valle de separación del 100%. Calcular la latencia como el tiempo tomado para la primera espiga identificado que se produzca después del final del artefacto de estimulación. Este análisis permite la caracterización del número de picos, latencia, intervalo inter-evento, y la duración calcula comode la siguiente manera: </li><li> Calcular el número de espigas como se determina el número total de espigas por oscilación para cada barrido. </li><li> Calcular la latencia de oscilación. Para cada oscilación, restar el momento de la primera espiga identificado desde el extremo del artefacto de estimulación. </li><li> Calcule el intervalo entre eventos promedio (ISI). Determinar el período de tiempo entre múltiples picos detectados y media. </li><li> Calcular la duración de oscilación. Mida el tiempo entre el primer y último pico detectado dentro de cada oscilación. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theta+rhythm+of+navigation%3A+link+between+path+integration+and+landmark+navigation%2C+episodic+and+semantic+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Theta rhythm of navigation: link between path integration and landmark navigation, episodic and semantic memory.</a> Hippocampus. 15 (7), 827-840 (2005).</li>
<li>Vanderwolf, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+electrical+activity+and+voluntary+movement+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Electroencephalogr.+Clin.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Hippocampal electrical activity and voluntary movement in the rat.</a> Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 26 (4), 407-418 (1969).</li>
<li>Bartos, M., Vida, I., Jonas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+mechanisms+of+synchronized+gamma+oscillations+in+inhibitory+interneuron+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic mechanisms of synchronized gamma oscillations in inhibitory interneuron networks.</a> Nat. Rev. Neurosci. 8 (1), 45-56 (2007).</li>
<li>Buzsáki, G., Wang, X. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+gamma+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of gamma oscillations.</a> Annu. Rev. Neurosci. 35, 203-225 (2012).</li>
<li>Kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+contribution+to+scalp+EEG+gamma+rhythms+associated+with+epileptic+spasms%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Dev%22%5BJournal%5D)">Cortical contribution to scalp EEG gamma rhythms associated with epileptic spasms.</a> Brain Dev. 35 (8), 762-770 (2013).</li>
<li>Andreou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Resting-State+Gamma-Band+Connectivity+in+First-Episode+Schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophr+Bull%22%5BJournal%5D)">Increased Resting-State Gamma-Band Connectivity in First-Episode Schizophrenia.</a> Schizophr Bull. , (2014).</li>
<li>Alarcon, G., Binnie, C. D., Elwes, R. D., Polkey, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Power+spectrum+and+intracranial+EEG+patterns+at+seizure+onset+in+partial+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Electroencephalogr.+Clin.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Power spectrum and intracranial EEG patterns at seizure onset in partial epilepsy.</a> Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 94 (5), 326-337 (1995).</li>
<li>Fisher, R. S., Webber, W. R., Lesser, R. P., Arroyo, S., Uematsu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+EEG+activity+at+the+start+of+seizures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">High-frequency EEG activity at the start of seizures.</a> J. Clin. Neurophysiol. 9 (3), 441-448 (1992).</li>
<li>Kwan, P., Brodie, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+identification+of+refractory+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Early identification of refractory epilepsy.</a> N. Engl. J. Med. 342 (5), 314-319 (2000).</li>
<li>Traub, R. D., Kopell, N., Bibbig, A., Buhl, E. H., LeBeau, F. E., Whittington, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+between+interneuron+dendrites+can+enhance+synchrony+of+gamma+oscillations+in+distributed+networks%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gap junctions between interneuron dendrites can enhance synchrony of gamma oscillations in distributed networks.</a> J. Neurosci. 21 (23), 9478-9486 (2001).</li>
<li>Traub, R. D., Whittington, M. A., Buhl, E. H., Jefferys, J. G., Faulkner, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanism+of+the+gamma+--%3E+beta+frequency+shift+in+neuronal+oscillations+induced+in+rat+hippocampal+slices+by+tetanic+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">On the mechanism of the gamma --> beta frequency shift in neuronal oscillations induced in rat hippocampal slices by tetanic stimulation.</a> J. Neurosci. 19 (3), 1088-1105 (1999).</li>
<li>Whittington, M. A., Stanford, I. M., Colling, S. B., Jefferys, J. G., Traub, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+patterns+of+gamma+frequency+oscillations+tetanically+induced+in+the+rat+hippocampal+slice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal patterns of gamma frequency oscillations tetanically induced in the rat hippocampal slice.</a> J. Physiol. 502 (3), 591-607 (1997).</li>
<li>Avoli, M., Panuccio, G., Herrington, R., D’Antuono, M., de Guzman, P., Lévesque, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+different+interictal+spike+patterns+anticipate+ictal+activity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Two different interictal spike patterns anticipate ictal activity in vitro.</a> Neurobiol. Dis. 52, 168-176 (2013).</li>
<li>Boido, D., Jesuthasan, N., de Curtis, M., Uva, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+Dynamics+During+the+Progression+of+Seizure-Like+Events+in+the+Hippocampal-Parahippocampal+Regions%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Network Dynamics During the Progression of Seizure-Like Events in the Hippocampal-Parahippocampal Regions.</a> Cereb Cortex. 24 (1), 162-173 (2014).</li>
<li>Gloveli, T., Albrecht, D., Heinemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+low+Mg2%2B+induced+epileptiform+activity+in+rat+hippocampal+and+entorhinal+cortex+slices+during+adolescence%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Dev.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Properties of low Mg2+ induced epileptiform activity in rat hippocampal and entorhinal cortex slices during adolescence.</a> Brain Res. Dev. Brain Res. 87 (2), 145-152 (1995).</li>
<li>McLeod, F., Ganley, R., Williams, L., Selfridge, J., Bird, A., Cobb, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+seizure+threshold+and+altered+network+oscillatory+properties+in+a+mouse+model+of+Rett+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reduced seizure threshold and altered network oscillatory properties in a mouse model of Rett syndrome.</a> Neuroscience. 231, 195-205 (2013).</li>
<li>Bracci, E., Vreugdenhil, M., Hack, S. P., Jefferys, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+synchronizing+mechanisms+of+tetanically+induced+hippocampal+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">On the synchronizing mechanisms of tetanically induced hippocampal oscillations.</a> J. Neurosci. 19 (18), 8104-8113 (1999).</li>
<li>Main, M. J., Cryan, J. E., Dupere, J. R., Cox, B., Clare, J. J., Burbidge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+KCNQ2%2F3+potassium+channels+by+the+novel+anticonvulsant+retigabine%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Modulation of KCNQ2/3 potassium channels by the novel anticonvulsant retigabine.</a> Mol. Pharmacol. 58 (2), 253-262 (2000).</li>
<li>Wickenden, A. D., Yu, W., Zou, A., Jegla, T., Wagoner, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retigabine%2C+a+novel+anti-convulsant%2C+enhances+activation+of+KCNQ2%2FQ3+potassium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Retigabine, a novel anti-convulsant, enhances activation of KCNQ2/Q3 potassium channels.</a> Mol. Pharmacol. 58 (3), 591-600 (2000).</li>
<li>Otto, J. F., Kimball, M. M., Wilcox, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+anticonvulsant+retigabine+on+cultured+cortical+neurons%3A+changes+in+electroresponsive+properties+and+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Effects of the anticonvulsant retigabine on cultured cortical neurons: changes in electroresponsive properties and synaptic transmission.</a> Mol. Pharmacol. 61 (4), 921-927 (2002).</li>
<li>Pomper, J. K., Graulich, J., Kovacs, R., Hoffmann, U., Gabriel, S., Heinemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+oxygen+tension+leads+to+acute+cell+death+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Dev.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">High oxygen tension leads to acute cell death in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Brain Res. Dev. Brain Res. 126 (1), 109-116 (2001).</li>
<li>Hatch, R. J., Reid, C. A., Petrou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+in+vitro+CA1+network+activity+in+a+sodium+channel+%CE%B21%28C121W%29+subunit+model+of+genetic+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Enhanced in vitro CA1 network activity in a sodium channel β1(C121W) subunit model of genetic epilepsy.</a> Epilepsia. 55 (4), 601-608 (2014).</li>
<li>Lord, L. -D., Expert, P., Huckins, J. F., Turkheimer, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+energy+metabolism+and+the+brain%2F%27s+functional+network+architecture%3A+an+integrative+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Cerebral energy metabolism and the brain/'s functional network architecture: an integrative review.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 33 (9), 1347-1354 (2013).</li>
<li>Hájos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+network+activity+in+submerged+hippocampal+slices%3A+importance+of+oxygen+supply%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply.</a> Eur. J. Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).</li>
<li>Hájos, N., Mody, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+a+physiological+environment+for+visualized+in+vitro+brain+slice+recordings+by+increasing+oxygen+supply+and+modifying+aCSF+content%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content.</a> J. Neurosci. Methods. 183 (2), 107-113 (2009).</li>
<li>Boido, D., Jesuthasan, N., de Curtis, M., Uva, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+Dynamics+During+the+Progression+of+Seizure-Like+Events+in+the+Hippocampal-Parahippocampal+Regions%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Network Dynamics During the Progression of Seizure-Like Events in the Hippocampal-Parahippocampal Regions.</a> Cereb Cortex. 24 (1), 163-173 (2012).</li>
<li>Antuono, M., Köhling, R., Ricalzone, S., Gotman, J., Biagini, G., Avoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiepileptic+drugs+abolish+ictal+but+not+interictal+epileptiform+discharges+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Antiepileptic drugs abolish ictal but not interictal epileptiform discharges in vitro.</a> Epilepsia. 51 (3), 423-431 (2010).</li>
<li>Stenkamp, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+temporal+stability+of+cholinergic+hippocampal+gamma+oscillations+following+respiratory+alkalosis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Enhanced temporal stability of cholinergic hippocampal gamma oscillations following respiratory alkalosis in vitro.</a> J. Neurophysiol. 85 (5), 2063-2069 (2001).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Un método robusto para generar CA1 oscilaciones γ en rodajas de cerebro agudas se describe. Las oscilaciones generadas surgen de un circuito local de permitir una mejor oportunidad para el control y la comprensión de la base neurofisiológica de las oscilaciones de la red 12. Receptores AMPA, receptores GABA A, I h y tipo T Ca 2 + canales son todos necesarios para oscilaciones γ en este modelo. Mientras que las oscilaciones CA1 locales descritos aquí pueden ser generados robust...

Oscilaciones de la red cerebral se producen dentro de las bandas de frecuencia distintas que se correlacionan con los estados de comportamiento. En los roedores, las oscilaciones θ hipocampo - se observan (5 de 10 Hz) durante conductas exploratorias 1,2, mientras que las oscilaciones γ (20 - 80 Hz) asociado con diversos procesos cognitivos, incluyendo la percepción y la atención 3,4. Actividad de la red γ síncrono también está implicado en la patología de trastornos tales como la epilepsia y la esquizofrenia 5,6. Por ejemplo, se cree que las oscilaciones γ para corresponder a las áreas de cortical focos epilépticos 5,7,8 y podrían ser utilizados como marcadores de pharmacosensitivity o resistencia, dos áreas importantes de la investigación en la investigación de la epilepsia 9. La rebanada del hipocampo del cerebro es un modelo que ha sido ampliamente utilizado para investigar la actividad de red 10-12. Varios protocolos se han desarrollado para generar oscilaciones γ en rodajas de cerebro que normalmente involve modulación farmacológica como la baja Mg 2+, 4-aminopiridina (4AP), bicuculina y ácido kaínico 12-17. Deficiencias de oscilaciones farmacológicamente desencadenados son que ocurren al azar después de la aplicación de drogas y no se generan de forma fiable o estables en el tiempo. De disparo eléctrico oscilaciones γ superar muchos de estos problemas y también tienen la ventaja de estar temporalmente bloqueada para el evento estimulante que permite la grabación y el análisis episódica. Aquí se describe un protocolo para la generación de oscilaciones γ CA1 mediante la entrega de una estimulación tetánica a las estrato oriens en el corte de hipocampo.

<table><tbody><tr><td>Cloruro de 4-(N-etil-N-fenilamino)-1,2-dimetil-6-(metilamino) pirimidina (ZD7288)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z3777</td><td></td></tr><tr><td>Biuculline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14340</td><td></td></tr><tr><td>6-ciano-7-nitroquinoxa- línea-2,3-diona (CNQX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C127</td><td></td></tr><tr><td>Níquel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>266965</td><td></td></tr><tr><td>Carbamazepina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4024</td><td></td></tr><tr><td>(2R)-amino-5-fosfonopentano-ato (APV)</td><td>Tocris Bioscience</td><td>0105</td><td></td></tr><tr><td>Retigabine</td><td>ChemPacific</td><td>150812-12-7</td><td></td></tr><tr><td>Colina-Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1879-5KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 y toro; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 & toro; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-500G</td><td></td></tr><tr><td>Electrodo de vidrio</td><td>Aparato de Harvard&nbsp;</td><td>GC150F-10</td><td></td></tr><tr><td>Electrodo metálico estimulante bipolar concéntrico&nbsp;</td><td>Aislador</td> digital <td>FHC CBBPF75</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Obtención de instrumentos</td><td>modelo BJN8-9V1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador modelo 1800</td><td>Sistemas A-M</td><td>Amplificador modelo 1800</td><td></td></tr><tr><td>Digitalizador</td><td>Instrumentos</td><td>nacionales NI USB-6211</td><td></td></tr><tr><td>Vibrótomo</td><td>Leica</td><td>VT1200s</td><td></td></tr></tbody></table>

generación de oscilaciones γ ca1 locales por tetánica estimulación

Generation of Local CA1 &#947; Oscillations by Tetanic Stimulation

Oscilaciones de la red neuronal son características importantes de la actividad cerebral en la salud y la enfermedad y puede ser modulada por una serie de medicamentos que se utilizan clínicamente. Un protocolo se proporciona para generar un modelo para el estudio de oscilaciones γ CA1 (20 - 80 Hz). Estas oscilaciones γ son estables durante al menos 30 min y dependen de la actividad sináptica excitatoria y inhibitoria Además de la activación de las corrientes de marcapasos. Oscilaciones tetánicamente estimuladas tienen una serie de características reproducibles y fácilmente cuantificables incluyendo recuento de pico, duración de oscilación, la latencia y la frecuencia que informan sobre el estado de la red. Las ventajas de las oscilaciones estimuladas eléctricamente incluyen la estabilidad, la reproducibilidad y la adquisición episódica que permite la caracterización robusta de la función de red. Este modelo de oscilaciones γ CA1 se puede utilizar para estudiar mecanismos celulares y para investigar sistemáticamente cómo actividad de la red neuronal se altera en la enfermedad y por las drogas.Farmacología estado de enfermedad puede ser incorporado fácilmente por el uso de cortes de cerebro de modelos animales genéticamente modificados o intervencionistas para permitir la selección de fármacos que se dirigen específicamente mecanismos de la enfermedad.

Estimulación tetánica de los estrato oriens generado robustos y reproducibles oscilaciones γ (35,4 ± 2,2 Hz), véase la Figura 3B. Para demostrar que las oscilaciones se generaron dentro de la red local de CA1 las entradas de CA3 fueron separadas por el corte de la rebanada en la región CA2 usando un doblado 32 G aguja. Las propiedades de oscilación en las rodajas cortadas no difieren de las rodajas cortadas (p = 0,85; corte rebanadas 6,16 ± 1,1 puntos, n = 6; sin cortar rebanadas 5,89 ± 0,8 puntos, n = ...

Las oscilaciones son propiedades fundamentales de la red y son modulados por la enfermedad y las drogas. El estudio de las oscilaciones cerebrales rebanada permite la caracterización de las redes aisladas en condiciones controladas. Los protocolos se proporcionan para la preparación de cortes de cerebro agudos para evocar oscilaciones γ CA1.

Generación de oscilaciones γ CA1 locales por tetánica Estimulación

Neuronal network oscillations are important features of brain activity in health and disease and can be modulated by a range of clinically used drugs. A ...

El objetivo general de este procedimiento es preparar cortes cerebrales para registrar oscilaciones gamma extracelulares como modelo de excitabilidad neuronal. Esto se logra primero extrayendo el cerebro del cráneo. El segundo paso consiste en enfriar rápidamente el cerebro en una solución salina fría y cortarlo en fetas de 450 micrones.A continuación, transfiera una sección al cámara de registro y coloque el electrodo estimulante en el estrato y un electrodo de registro en el estrato piramidal. El paso final consiste en inducir oscilaciones gamma y evaluar el impacto de fármacos sobre la excitabilidad neuronal. En última instancia, la caracterización de las oscilaciones gamma del hipocampo se utiliza para mostrar los efectos de los fármacos sobre la función de la red neuronal o para comprender los mecanismos de la génesis de enfermedades en trastornos neurogenéticos.Este método puede utilizarse para obtener información sobre los mecanismos de enfermedades en las que se producen aumentos en la excitabilidad de la red neuronal, como la epilepsia, el autismo y el Alzheimer, y también puede emplearse para investigar el mecanismo de acción de fármacos. Para comenzar este procedimiento, prepare una cámara de sujeción insertando una malla de nailon elevada en un vaso de precipitados de 250 mililitros. A continuación, llene el vaso con un LCR hasta cubrir la malla aproximadamente dos centímetros y burbujee con carbógeno a temperatura ambiente.Asegúrese de que las burbujas no interrumpan directamente el área donde se coloca el corte. Luego, coloque los instrumentos de disección, incluyendo un par grande de tijeras, un par pequeño de tijeras, una espátula microscópica pequeña y otra grande, y un par pequeño y otro grande de pinzas, sobre hielo. Coloque el bloque de corte de tejidos Vibram enfriado sobre una lámina de aluminio colocada sobre hielo.Después de esa reparación, tome dos trozos de papel de filtro de seis centímetros, una hoja de bisturí de borde único y un vaso de precipitados de 25 mililitros lleno con una suspensión de solución de corte. A continuación, llene un segundo recipiente con hielo para la disección cerebral. Coloque un trozo de papel de tejido sobre el hielo y ponga un recipiente de cultivo de 12 centímetros encima.Posteriormente, llene la placa de cultivo con una mezcla de hielo y solución de corte y burbujee con carbógeno. En este procedimiento, corte la piel y el tejido conectivo de la cabeza hacia la nariz utilizando las tijeras pequeñas, y corte el tejido conectivo para exponer el cráneo subyacente. Luego, retire los músculos que recubren la cara dorsal del cráneo y del cuello.Para extraer el cerebro, sujete la parte frontal del cráneo con un par de pinzas grandes. Luego, realice dos cortes laterales a través del hueso en ambos lados del foramen magno. Después, haga otro corte entre los ojos, justo anterior al bregma.Corte cuidadosamente a lo largo de la sutura sagital y refleje las secciones del cráneo para revelar el cerebro. A continuación, use la espátula pequeña para extraer el cerebro, teniendo cuidado de seccionar los nervios craneales. Coloque el cerebro en una placa de cultivo.Luego, transfiera el cerebro a un vaso de precipitados de 25 mililitros lleno con una suspensión de solución de corte. Para preparar el hemisferio cerebral para el corte, coloque un trozo de papel filtro de seis centímetros en el fondo de una placa de cultivo. A continuación, llénela con suspensión fresca de solución de corte y burbujee con car.A continuación, coloque el cerebro con la cara ventral hacia abajo sobre el papel de filtro. Luego, retire el cerebelo con una cuchilla de filo único nueva y limpia. Realice un corte a lo largo de la línea media para separar los dos hemisferios.Para preparar el bloque de tejido Vibram, seque la superficie de la plataforma de corte de tejido Vibram refrigerada. Coloque una gota de pegamento Sano ACRL en el centro y extiéndala uniformemente hasta alcanzar aproximadamente el tamaño del cerebro. Utilice una espátula pequeña para transferir un hemisferio a una espátula microscópica grande y colóquelo de modo que el lado medial del cerebro quede hacia abajo.Absorba la solución del cerebro con un trozo de papel de filtro tanto como sea posible. Luego deslice el cerebro fuera de la espátula más grande y utilice la espátula más pequeña para guiarlo hacia el pegamento. A continuación, asegure la plataforma de corte a la cámara de vibrátomo.Construya la cámara con una suspensión de solución de corte para cubrir completamente el cerebro y burbujee la solución con carbógeno. Luego, gire la plataforma de corte de modo que la cara ventral del cerebro quede frente a la hoja. Corte el cerebro en secciones de 450 micrómetros de grosor, cortando desde la superficie ventral hasta la dorsal para obtener cortes sagitales completos del cerebro destinados a grabaciones electrofisiológicas.Si se levanta la base del corte, utilice una aguja curvada de calibre 27 para presionar suavemente el corte hacia abajo. Luego, use la pipeta para transferir el corte a la cámara de almacenamiento. Típicamente, se pueden cortar tres o cuatro secciones de hipocampo de Campbell de cada hemisferio para montar el corte en la cámara de registro.Coloque una sección de cerebro en una cámara de registro sumergida perfundida con un LCR que fluye a uno o dos mililitros por minuto y que está calentado a 32 grados celsius. El LCR utilizado para los registros difiere del utilizado en la cámara de mantenimiento en que la concentración de magnesio se incrementa de dos milimolares a cuatro milimolares. Sujete la sección colocando un peso semicircular de acero inoxidable sobre ella, con sus hebras paralelas al hipocampo CA1.A continuación, aumente la velocidad de perfusión a entre ocho y 10 mililitros por minuto a 32 grados Celsius. Utilizando un microscopio estereoscópico, coloque el electrodo estimulante en la mitad del estrato oriens. Luego, mueva el electrodo de registro hacia la capa paramétrica, lo más cerca posible del electrodo estimulante.Posteriormente, introduzca tanto el electrodo estimulador como el de registro entre 50 y 100 micrómetros dentro del corte. Con el fin de generar un PEPS de campo de un milivoltio en respuesta al pulso de prueba de 120 a 150 micro, estimule el tejido con una serie de 20 pulsos de 0,1 milisegundos cada uno, aplicados a 200 hercios. Este estímulo titánico puede producir respuestas reproducibles cuando se administra cada cinco minutos.Este esquema muestra las ubicaciones del electrodo estimulante en el estrato orients y del electrodo de registro en el estrato para del ca uno. Y aquí se muestra un ejemplo de las oscilaciones gamma inducidas por la estimulación titánica. Esta figura muestra el bloqueo farmacológico de los receptores AMPA con 20 micromolar CN QX, receptores gabaa con 20 micromolar por colina, corriente IH con 20 micromolar peridio, cloruro y canales de calcio tipo T.Con 100 micromolar de níquel, cada agente pudo reducir independientemente el número de picos generados. Esta preparación es ideal para determinar la acción a escala de red de los fármacos. La tina es un medicamento antiepiléptico utilizado clínicamente que abre canales de potasio y reduce la excitabilidad de la membrana por baño.La aplicación de tina produjo una reducción dependiente de la dosis en el número de picos durante la duración de la oscilación. Una vez dominada, la preparación de cortes cerebrales y la disección para grabaciones electrofisiológicas puede realizarse en aproximadamente 10 minutos siguiendo este procedimiento. La adición de otros métodos, como grabaciones mediante parche en todo el célula, puede incorporarse para comprender el papel de neuronas individuales dentro de una red en enfermedades, así como tras la aplicación de fármacos.

generation-of-local-ca1-oscillations-by-tetanic-stimulation

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

La preparación de cortes de cerebro de agudos de hipocampo aislado, así como los registros simultáneos electrofisiológicas de los astrocitos y las neuronas...

Dos registros electrofisiológicos de sinápticamente respuestas evocadas neuronal y astroglial en agudas rodajas de hipocampo

Este video demuestra el procedimiento de inducción de oscilaciones gamma CA1 locales en un corte de cerebro de ratón hipocampo CA1 utilizando simulaciones tetánicas. Este método es importante para comprender la actividad de la red neuronal.

Generación de oscilaciones gamma locales de Cornu Ammonis 1 (CA1) mediante estimulaciones tetánicas en un corte de cerebro del hipocampo

Este video muestra un método para registrar las respuestas sinápticas de CA3-CA1 en un corte de hipocampo de rata. Describe los pasos involucrados en la colocación de los electrodos estimulantes y de registro en el corte del hipocampo y la medición del potencial postsináptico excitador de campo (fEPSP) para evaluar la fuerza de la respuesta sináptica.

Registro de las respuestas sinápticas de CA3-CA1 en un corte de hipocampo de rata

Este video demuestra el método para usar la optogenética para modular la dinámica de la red del hipocampo mediante la activación de interneuronas sensibles a la luz modificadas genéticamente en un corte de cerebro de ratón, mejorando la sincronización de la oscilación theta y estudiando el comportamiento de los circuitos neuronales.

Control optogenético de la dinámica de la red del hipocampo

El núcleo pedunculopontino (PPN) se encuentra en el tronco del encéfalo y sus neuronas están máximamente activa durante la vigilia y el movimiento ocular rápido (REM) del sueño cerebrales estados. Este trabajo describe el enfoque experimental para registrar en la banda gamma oscilación de la membrana por debajo del umbral vitro en neuronas PPN.

Grabación de la banda gamma oscilaciones en pedunculopontino Núcleo neuronas

Aquí, presentamos un protocolo para la grabación de la red neuronal rítmica teta y oscilaciones gamma de una preparación de hipocampo aislado todo. Describimos los pasos experimentales desde la extracción del hipocampo hasta los detalles de las grabaciones de parches de campo, unitarios y de células enteras, así como la estimulación optogenética del ritmo teta.

Tuning en la banda Theta Hippocampal<em&gt; In Vitro</em&gt;: Metodologías para la grabación del circuito septohippocampal de roedores aislados

Describimos el uso de optogenetics y grabaciones electrofisiológicas para la manipulación selectiva de oscilaciones de hippocampal de la theta (5-10 Hz) en ratones de comportarse. La eficacia del arrastre de ritmo se controla usando el potencial de campo local. Una combinación de opto - e inhibición farmacogenética aborda la lectura eferente del hipocampo sincronización.

Optogenetic de arrastre de las oscilaciones Theta Hippocampal en comportarse ratones

Este protocolo describe la grabación de potenciales de campo local con caña múltiples sondas de silicona lineal. La conversión de las señales mediante análisis de densidad de fuente actual permite la reconstrucción de la actividad eléctrica local en el hipocampo del ratón. Con esta técnica, se pueden estudiar las oscilaciones del cerebro espacialmente restringida libremente mover ratones.

Grabación espacial restringido a oscilaciones en el hipocampo de ratones de comportarse

Modelos de convulsión aguda son importantes para el estudio de los mecanismos subyacentes a los eventos epileptiformes. Además, la capacidad para generar eventos epileptiformes en demanda proporciona un método altamente eficiente para estudiar la secuencia exacta de los eventos subyacentes a su iniciación. Aquí, describimos los modelos de crisis cortical aguda 4-aminopiridina en tejido humano y ratón.

Generación y demanda inicio de la actividad Ictal aguda en roedores y tejido humano

Aquí presentamos un protocolo de Ca2 + proyección de imagen en neuronas y células gliales, que permite la disección de Ca2 + señales con resolución subcelular. Este proceso es aplicable a todo tipo de celular que permiten la expresión de indicadores de Ca2 + genéticamente codificados.

Disección de Local Ca2 + señales en las células cultivadas por membrana dirigidos Ca2 + indicadores

Utilizamos electrodos de grabación y estimulación en rodajas longitudinales del cerebro del hipocampo y electrodos de registro y estimulación posicionados longitudinalmente en el hipocampo dorsal in vivo para evocar potenciales postsinápticos extracelulares y demostrar plasticidad sináptica a largo plazo a lo largo del interlamellar longitudinal CA1.

Investigación de la plasticidad sináptica a largo plazo en Interlamellar Hippocampus CA1 por grabación de campo electrofisiológica

Aprende a preparar rebanadas cerebrales para registrar oscilaciones gamma en la región CA1 del hipocampo mediante estimulación tetánica. Este método permite evaluar efectos de fármacos sobre la excitabilidad neuronal y comprender mecanismos de enfermedades neurológicas como epilepsia y autismo.

Generación de oscilaciones γ CA1 locales por tetánica Estimulación

Explorar más videos