Establecimiento de un punto de vista clínico relevante
5 de junio de 2015
Aquí se describe el establecimiento de un modelo de cirugía de catarata simulada ex vivo clínicamente relevante que se puede utilizar para investigar los mecanismos de la respuesta a la lesión de los tejidos epiteliales dentro de su microambiente nativo.
El objetivo general de este procedimiento es crear un modelo clínicamente relevante en el cual la reparación de heridas pueda seguirse en su microentorno natural. Esto se logra primero extrayendo el cristalino del ojo de un embrión de pollo. El segundo paso consiste en realizar una pequeña incisión en la parte anterior del cristalino.
Luego, eluir hidrolíticamente la masa de células fibras del cristalino. A continuación, se aplanan la cápsula del cristalino y el epitelio asociado realizando cortes adicionales en la cápsula anterior. El último paso consiste en fijar el cultivo lesionado al recipiente de cultivo tisular para poder seguir la cicatrización de la herida conforme ocurre.
En última instancia, se utiliza microscopía de lapso de tiempo, microscopía confocal y análisis bioquímico para mostrar los mecanismos de reparación de heridas en un modelo que recapitula de cerca el entorno in vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la cicatrización de heridas, como cómo las células se mueven coordinadamente para cerrar la herida. Aunque este método puede proporcionar información sobre el proceso de reparación de heridas.
También puede aplicarse a estudios de cicatrización de heridas ABER, particularmente fibrosis y formación de cicatrices. Comience colocando tres placas de Petri de 100 milímetros en una cabina de flujo laminar estéril. Llene dos de las placas de Petri hasta la mitad con tampón tris dextrosa a temperatura ambiente, dejando la tercera vacía.
Luego, retire un huevo fértil de pollo blanco leghorn de 15 días embrionarios del incubador a 37,7 grados Celsius y limpie el exterior del cascarón con etanol al 70% para esterilizarlo. A continuación, rompa cuidadosamente el huevo y coloque su contenido en la placa de Petri de 100 milímetros vacía. Utilizando pinzas estándar y tijeras finas, seccione la cabeza del embrión y coloque la cabeza en uno de los recipientes que contiene el tampón de dextrosa TST.
En el transcurso de 15 minutos, traslade el embrión de pollo al interior de la tapa de una placa de Petri. Utilice pinzas de alta precisión para pellizcar la parte posterior del ojo, creando una pequeña abertura en la parte trasera del mismo. Luego, sujete el humor vítreo con las pinzas y tire suavemente del vítreo mediante un movimiento de rodadura.
El vítreo con el cristalino adherido se desprenderá del ojo. Coloque el cristalino y el vítreo en la otra placa de Petri que contiene el tampón Tex extras. Deje los cristalinos en el tampón durante no más de 30 minutos antes de continuar con la disección.
A continuación, traslade el cristalino a una nueva tapa de placa de Petri bajo un microscopio estereoscópico utilizando pinzas de alta precisión, y cepille cuidadosamente cualquier célula del cuerpo ciliar que se haya desprendido junto con el cristalino, empleando el borde de las pinzas. Luego, separe el cristalino del humor vítreo pellizcando el cuerpo vítreo para desligarlo de su asociación con la cápsula posterior del cristalino. Una vez separado, transfiera el cristalino a una gota de 200 microlitros de tampón tris dextrosa en una placa de cultivo tisular de 35 milímetros, y oriente el cristalino con su cara anterior hacia arriba.
El polo anterior del cristalino se identifica fácilmente por la presencia de un anillo denso en el tejido que marca el límite entre la región interior y la región ecuatorial del epitelio del cristalino. Utilizando dos pinzas de alta precisión, realice una pequeña incisión de aproximadamente 850 micrones de longitud en el centro de la cápsula anterior del cristalino, sujetando el tejido con una pinza en cada mano y tirando suavemente en direcciones opuestas. A continuación, tome una jeringa de un mililitro con aguja de calibre 27,5 y llénela con 300 microlitros de tampón de dextrosa TST.
Introduzca la punta de la aguja en la incisión realizada en la cápsula anterior del cristalino y aproximadamente hasta la mitad del lente. Luego, presione suavemente la jeringa, inyectando el tampón de dextrosa TST en el cristalino. Masa de células fibrilares.
Inyecte entre 50 y 200 microlitros de tampón para soltar la masa de células fibrilares del epitelio circundante y de la cápsula del cristalino. Nunca inyecte más de 300 microlitros. Utilizando pinzas de alta precisión, retire la masa de células fibrilares suelta del cristalino a través del sitio de incisión anterior.
La eliminación de la masa de células fibrilares de su inserción en la cápsula posterior crea un área de herida altamente reproducible en la membrana basal, rodeada por el epitelio lesionado. Comenzando con la bolsa capsular, realice cinco cortes en la cara anterior del cristalino hasta llegar al ecuador. Aplane los cinco colgajos resultantes de la cápsula del cristalino, con el epitelio adherido, en el plato de cultivo con la cara capsular hacia abajo y la cara celular hacia arriba.
Presione suavemente con la pinza en cada punto de la estrella para asegurar la cápsula al recipiente. Esto creará una pequeña indentación en las cinco puntas más externas del x explan y dará como resultado una fijación sostenida al recipiente. Luego, retire el tampón de tris dextrosa del recipiente de 35 milímetros y reemplácelo con 1,5 mililitros de M1 99 precalentado.
Medio suplementado con 1% de L-glutamina y penicilina. Streptomycin cubrió el recipiente con su tapa y colocó en el incubador. Coloque el recipiente de cultivo bajo el microscopio estereoscópico y observe la delimitación entre la zona central de migración y la zona original de adhesión de las células epiteliales.
Luego, utilice dos pinzas de alta precisión para sujetar el borde de ambos lados de la línea de demarcación entre las dos zonas. Tire suavemente de la zona de fijación original a lo largo de la línea para separar fácilmente las dos zonas. Continúe separando las dos zonas alrededor de toda la cultura hasta que las dos regiones estén completamente separadas.
Analice las dos fracciones utilizando técnicas analíticas moleculares o bioquímicas estándar. Inmediatamente después de la eliminación de la masa de células fibrilares, una subpoblación de células mesenquimales enriquecidas en ment se activa y migra hacia el borde de la herida del epitelio. Estas células se desplazan rápidamente hacia la región libre de células de la cápsula de la membrana basal endógena, la zona central de migración, para iniciar la cicatrización.
La herida, la técnica descrita aquí prepara perfectamente este sistema modelo para observar este proceso con un microscopio o una cámara de video; la cicatrización de la herida avanza rápidamente, cubriendo un área significativa de la herida para el primer día en cultivo. Para el tercer día, el proceso de cicatrización de la herida generalmente se completa tras la separación de las zonas central de migración y de fijación original. En este estudio se analizaron las diferencias moleculares entre estas zonas distintas.
Los niveles de la quinasa de adhesión focal se midieron en las dos zonas y se encontró que la cantidad de quinasa de adhesión focal fosforilada estaba aumentada en la zona central específica de migración. Una vez dominada, esta técnica de cirugía simulada de catarata puede completarse en tres minutos si se realiza adecuadamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo crear un modelo de cirugía simulada de catarata que imite de cerca la reparación de heridas en un microentorno natural.
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Descripción general
Este artículo describe el establecimiento de un modelo ex vivo de cirugía simulada de cataratas con relevancia clínica. Este modelo está diseñado para investigar los mecanismos de la respuesta al daño de los tejidos epiteliales dentro de su microentorno nativo.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Neurociencia
- Oftalmología
- Ingeniería de tejidos
Antecedentes
- Comprender la reparación de heridas en tejidos epiteliales es fundamental para desarrollar tratamientos eficaces.
- Los modelos ex vivo pueden proporcionar información sobre los mecanismos de respuesta a lesiones.
- Los modelos de cirugía de cataratas ayudan a simular condiciones reales para la investigación.
- Los embriones de pollo sirven como un modelo adecuado para estudiar tejidos oculares.
Objetivo del estudio
- Crear un modelo que permita la observación de la cicatrización de heridas en un entorno controlado.
- Investigar la respuesta a la lesión de los tejidos epiteliales tras una cirugía.
- Mejorar la comprensión de los efectos de la cirugía de cataratas en la reparación de tejidos.
Métodos Utilizados
- Extracción del cristalino del ojo de un embrión de pollo.
- Realización de una pequeña incisión en la parte anterior del cristalino.
- Elución hidráulica de la masa de células fibrilares del cristalino.
- Aplanamiento de la cápsula del cristalino con el epitelio asociado mediante cortes adicionales.
- Sujeción del cultivo lesionado a una placa de cultivo de tejidos para su observación.
Resultados principales
- El modelo imita con éxito las condiciones de la cirugía de cataratas.
- Los procesos de cicatrización de heridas pueden monitorizarse en tiempo real.
- Se obtuvieron conocimientos sobre las respuestas del tejido epitelial a la lesión.
- El modelo puede utilizarse para estudios posteriores sobre los mecanismos de reparación tisular.
Conclusiones
- Este modelo ex vivo es una herramienta valiosa para estudiar las respuestas al daño tisular epitelial.
- Proporciona una plataforma para investigaciones futuras sobre la cicatrización de heridas en tejidos oculares.
- Comprender estos mecanismos podría conducir a técnicas quirúrgicas y resultados mejorados.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este modelo ex vivo aborda una brecha crítica en la investigación de la cicatrización de heridas epiteliales al permitir la observación en vivo de los procesos de reparación en un microentorno nativo que imita de cerca las condiciones in vivo. El sistema ofrece una plataforma clínicamente relevante para la desactivación mecanicista de dianas terapéuticas implicadas en las vías de reparación tisular, fibrosis y formación de cicatrices. Al permitir imágenes en tiempo real y manipulación molecular, mejora la confiabilidad predictiva en las primeras etapas del descubrimiento para indicaciones oftálmicas y de cicatrización de heridas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar los mecanismos de reparación de heridas epiteliales en un microentorno nativo de membrana basal.
- Valor operativo: Facilita el análisis mediante imágenes en vivo y análisis bioquímico de la migración de células reparadoras ricas en vimentina y de la señalización de adhesiones focales.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Valor científico: Genera modelos de herida reproducibles para la evaluación cuantitativa de la migración y proliferación epitelial.
- Valor operativo: La preparación estandarizada permite un tamaño de herida constante y la integridad de la monocapa epitelial para la reproducibilidad del ensayo.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Mantiene las señales microambientales endógenas críticas para respuestas fisiológicamente relevantes de cicatrización de heridas.
- Valor operativo: Facilita la comparación de perfiles moleculares entre zonas de migración y de adherencia para identificar biomarcadores traducibles.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El modelo se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del objetivo hasta la evaluación preclínica, particularmente para indicaciones de reparación de tejidos oculares y fibrosis.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre los mecanismos de migración epitelial y la activación de progenitores mesenquimales en la cicatrización de heridas.
- Selección: Permite sistemas listos para ensayos que evalúan los efectos de compuestos sobre la cinética de cierre epitelial y la fosforilación de adhesiones focales.
- Análisis: Proporciona lecturas cuantitativas, como los niveles de tirosina quinasa de adhesión focal fosforilada, para comparar condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Conecta los mecanismos de reparación epitelial con la continuidad preclínica mediante entornos de señalización nativos conservados.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para estudiar las respuestas a lesiones epiteliales en múltiples condiciones experimentales y puntos temporales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista en la reparación de heridas epiteliales.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad mediante la preparación quirúrgica y el mantenimiento del cultivo estandarizados.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al permitir la evaluación temprana del riesgo de fibrosis y formación de cicatrices en candidatos terapéuticos.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de compuestos que actúan sobre vías de reparación epitelial.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de microcirugía y manejo de tejidos embrionarios.
- Depende de instrumentos de precisión para la manipulación del cristalino y la eliminación de células fibrilares.
- Necesita condiciones de cultivo estandarizadas para mantener la viabilidad del epitelio y su capacidad de respuesta a lesiones.
- Implica consideraciones de adaptación al extender el modelo a otros tipos de tejidos epiteliales.
- Está limitado por la naturaleza ex vivo del sistema, que puede no captar completamente las influencias sistémicas presentes in vivo.
Preguntas frecuentes sobre biofarmacia
Chapters in this video
0:05
Title
1:20
Setup and Preparation of Lenses for Ex Vivo Wound Culture
3:31
Performing Mock Cataract Surgery
4:43
Preparing the Wounded Lens for Ex Vivo Culture
5:35
Separation of the Central Migration and Original Attachment Zone
6:17
Results: Injury Response of Cells in their Native Microenvironment
7:18
Conclusion
