Name: Screening productos alimenticios para la Clase 1 integrones y Gene Cassettes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Aprende a detectar integrones de clase 1 y cassettes de genes de resistencia en alimentos mediante cultivo bacteriano, PCR y secuenciación. Este protocolo permite identificar bacterias portadoras en mariscos y vegetales crudos.

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Gracias a Michaela Hall, Larissa Bispo y Gustavo Tavares para la asistencia técnica.

Los productos alimenticios que se consumen crudos o ligeramente cocidos son de mayor preocupación para la salud humana. Los ejemplos incluyen ensalada de verduras, frutas, mariscos y crustáceos. 1. Recogida de muestras <ol><li> Recoger las muestras en condiciones que reduzcan al mínimo la contaminación, y se almacena en sacos limpios, separados durante el transporte. Una vez recogidos, las muestras deben almacenarse a 4 ° C y procesadas dentro de 24 horas. </li></ol> 2. Preparación Enriquecido Cultura <ol><li> Frutas y vegetales: <ol><li> Poner unos 10 g de material en una bolsa de plástico resistente. Si el procesamiento de material más grande, se concentran en la piel de la fruta o verdura. Añadir 90 ml 0,1 M tampón fosfato de sodio, pH 7,0 y el proceso en un mezclador de paletas durante 30 seg. Alternativamente, el material se puede agitar manualmente si un mezclador de paleta no está disponible. </li><li> Recoger el líquido en dos 50 ml tubos Falcon. Tubos centrífuga a 4.000 xg durante 7 minutos a las bacterias de pellets. </li&gt; <li> Retirar con cuidado el sobrenadante y suspender las bacterias sedimentadas en 30 ml de caldo estéril Luria Bertani (LB). </li><li> Incubar en un agitador O / N, la celebración de un tubo a 25 ° C y el otro a 37 ° C. Los cultivos deben agitaron a 200 oscilaciones por minuto (OPM). Culturas Almacenar a 4 ° C hasta su utilización. </li></ol></li><li> Mariscos: <ol><li> Diseccionar el estómago (ostras) o del tracto digestivo (gambas) con unas pinzas y pinzas estériles y colocarlos en un tubo de 1,5 ml estéril que contiene 200 l de tampón de fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,0. Macerar la muestra para crear un homogeneizado. </li><li> Dispense 5 ml de caldo LB en dos tubos de 5 ml estériles, e inocular cada una con el homogeneizado de mariscos. </li><li> Incubar en un agitador O / N, la celebración de un tubo a 25 ° C y el otro 37 ° C. Los cultivos deben agitaron a 200 opm. Culturas Almacenar a 4 ° C hasta su utilización. </li></ol></li></ol> 3. Los cultivos de cribado para integrones MgCl2 de 2,5 mM. Si es necesario, Lorenz (2011) 24 ha descrito métodos de optimización y solución de problemas de la PCR en un número anterior de esta revista. <ol><li> Preparación de ADN Hervido: <ol><li> Prescindir de 100 l de cultivo enriquecido en un 0,5 ml tubo de PCR estériles. Calentar la muestra a 99 ° C durante 10 min, utilizando un baño de agua o bloque de calor. Encajar frialdad en hielo durante 2 min. </li><li> Microcentrífuga a 14.000 xg durante 5 min para sedimentar los restos celulares. Regresar a hielo. Las muestras de ADN pueden ser congeladas a -20 ° C hasta que sea necesario, pero deben ser descongeladas en hielo. </li></ol></li><li> La detección de la clase 1 integrones utilizando PCR: NOTA: Los cultivos mixtos de la / N incubación O son examinados para detectar la clase 1 integrones utilizando el protocolo HS463a / HS464 PCR (Tabla 1). <ol><li> Descongele todos los reactivos de PCR en hielo, lejos de cualquier sou potencialRCE de contaminación de ADN. Conforman 48 l PCR Mastermix por muestra, incluidos los controles negativos (Tabla 2). Dispensar 48 l de mezcla maestra de PCR a cada tubo, usando puntas de barrera. </li><li> Añadir 2 l de ADN descongelado para tubos de PCR individuales utilizando puntas de barrera. Ejecutar programa apropiado en el termociclador de PCR. </li><li> Para evaluar los resultados de la amplificación, a electroforesis 7 l de producto de PCR en un gel de agarosa al 2% se vertió y se ejecutan en tampón TBE (90 mM TRIS-borato, EDTA 2 mM). Incluir un marcador de peso molecular, tal como una escalera de 100 pb. </li><li> Publicar mancha el gel con una mancha de ADN, y visualizar utilizando un transiluminador UV. Compruebe que no ha habido ninguna amplificación en el control negativo. Un fuerte banda en torno a 470 pb para cualquier muestra particular indica que el cultivo mixto contiene bacterias que llevan un integrón de clase 1. Colonias puras ahora se aíslan de cualquier cultura mixta que regresó una PCR positiva. </li></ol></li></ol><ol><li> Las diluciones en serie y placas de cálculo: NOTA: Para aislar colonias individuales a partir de los cultivos mixtos PCR-positivos, el cultivo mixto se diluyó en serie 10 veces en tampón de fosfato de sodio, y luego plateado para recuperar colonias individuales. <ol><li> Añadir 1 ml de cultivo mixto a 9 ml de tampón de fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,0 y mezclar por inversión. Añadir 1 ml de la dilución a una más 9 ml de tampón de fosfato, y repetir hasta una dilución en serie de 10 -8 se alcanza. </li><li> Corre 100 l de los 10 -4 a 10 -8 diluciones en agar LB, por duplicado. Incubar las placas de O / N a la misma temperatura usada para el cultivo mixto inicial. Las placas pueden entonces ser almacenados a 4 ° C hasta que sea necesario, sin embargo es mejor para procesar las colonias individuales bastante rápidamente. </li></ol></li><li> Selección colonia individual y preparación de ADN hervida: <ol><li> Escoja colonias individuales de las placas de dilución de serie, sínando tantos tipos de colonias diferentes como sea posible, utilizando criterios como tamaño de la colonia, forma y color. Use palillos de dientes estériles para seleccionar colonias individuales de la placa de expansión. </li><li> Toque el palillo de dientes a la colonia, y luego transferir a un tubo de PCR que contiene 100 l de agua estéril. Si un gran número de colonias son de ser controlados, a continuación, las colonias se pueden preparar en una bandeja de microtitulación. Girar el palillo de dientes entre los dedos para desalojar algunas de las células en el agua. </li><li> Utilizando el mismo palillo de dientes, inocular una placa de LB con una raya de la colonia. Un gran número de colonias se pueden almacenar en placas marcadas si cada racha es de aproximadamente 1 cm de largo. Repita los pasos 1 a 3 hasta que haya seleccionado un número adecuado de aislamientos. </li><li> Incubar el LB placas O / N, a la misma temperatura que la utilizada para el cultivo enriquecido inicial. Las culturas pueden entonces ser almacenados a 4 ° C hasta su utilización. </li><li> Para la preparación de ADN a partir de las suspensiones bacterianas, siga los pasos como outlined en el apartado 3.1. Para la selección de los lisados ​​de cultivos puros, realice el HS463a / HS464 PCR como se indica en el apartado 3.2. Aislamientos que volver una PCR positiva será utilizada para la preparación de ADN genómico (artículo 5), y para otros análisis. </li></ol></li></ol> 5. Las colonias individuales de ADN genómico La extracción de integrón positivos Uso Bead Vencer a 25 <ol><li> Se inoculan 5 ml de caldo LB con una muestra del cultivo puro aislado en el apartado 4.2. Incubar O / N, agitando a la misma temperatura que se utilizó para el cultivo enriquecido inicial. </li><li> Células de pellets a 4.000 xg durante 7 minutos, a continuación, eliminar el sobrenadante. Resuspender las células sedimentadas en 1 ml de solución CLS-TC en un tubo de preparación rápida lisis Matrix E. El uso de una máquina de golpes de talón, procesar la muestra a 5,5 m / s durante 30 s. </li><li> Tubo de centrífuga a 14.000 xg durante 5 min y se recuperan 700 l de sobrenadante en un tubo de 1,5 ml estéril. </li><li> Añadir 700 l de matriz de unión diluido 1: 5 con 6 M guanidinium tiocianato y mezclar a temperatura ambiente durante 5 min. Centrifugar a 14.000 xg durante 1 min, el sobrenadante de descarte. </li><li> Añadir 800 l de etanol de lavado de sal (70% de etanol, acetato de sodio 0,1 M) y agitar hasta que el sedimento se resuspendió completamente. Lavar durante 5 min a RT, se centrifuga a 14.000 xg durante 1 min y desechar el sobrenadante. Asegúrese de que todos sobrenadante se ha eliminado, utilizando una micropipeta si es necesario, a continuación, dejar secar al aire durante 5 minutos. </li><li> Resuspender el pellet matriz en 200 l de TE (Tris-HCl 10, 1 mM EDTA, pH 7,6) pipeteando arriba y abajo. Incubar a temperatura ambiente durante 3 min. Centrifugar a 14.000 xg durante 3 min y la transferencia de 160 l de la ADN eluido en un tubo estéril. Ejecutar una alícuota de la extracción de ADN genómico en un / gel de agarosa al 2% w v para comprobar el rendimiento y la integridad de la extracción de ADN. El ADN genómico purificado se almacena a -20 ° C y descongelado en hielo cuando sea necesario para las pruebas de PCR. </li></ol> 6. PCR de diagnóstico y secuenciación de ADN NOTA: LaADN genómico preparado en la sección 5 se utiliza para todas las PCR de diagnóstico, y para confirmar el resultado positivo de la clase 1 integrones. <ol><li> Descongelar el ADN genómico en hielo, vórtice brevemente la muestra de ADN y el giro pulso en 14.000 xg durante 20 seg. Repita la PCR para el gen de la clase 1-integrón integrasa usando HS463a / HS464 (Tabla 1), lo que confirma que el aislado es positivo para la amplificación de 471 pb (Sección 3.2). </li><li> Identificación de cultivos positivos a nivel de especie se logra mediante el análisis de la pequeña subunidad del gen rRNA (16S ADNr). Amplificar el gen 16S usando los cebadores F27 / R1492 (Tabla 1). Compruebe los productos de PCR utilizando electroforesis. Todos los objetivos bacterianas deben generar un amplicón 16S de aproximadamente 1.450 pb. </li><li> Secuencia del gen amplicón ARNr 16S para determinar identidad de la especie, pero como no es probable que sean múltiples PCR positivos desde el paso 6.2, y muchos de estos positivos serán las mismas especies bacterianas, nosotros primero distinguir las diferentes especies using digestión de restricción del producto de PCR 16S. <ol><li> Digerir una alícuota de la PCR 16S con la enzima de restricción Hinf 1. Cualquier enzima que reconoce los sitios de escisión 4 pb harán, pero Hinf 1 genera buena diversidad de 16S objetivos, y es una enzima barata fiable. </li></ol></li><li> Configure una restricción 30 l digerir mezcla maestra (Tabla 2) en un tubo estéril y añadir 20 l de producto de PCR 16S un-una vez purificada. Incubar en un baño de agua 37 ° C O / N. Revise el resumen en un gel de agarosa al 2%. </li><li> Puntuación de los patrones de digestión producidos por Hinf 1. Los aislados con el mismo perfil de restricción 16S es probable que sean la misma especie. En vez de secuenciar cada producto PCR 16S, secuencia en la mayoría de los tres representantes de cada patrón de restricción Hinf 1. </li><li> Purificar los productos de PCR 16S utilizando un kit comercial. Un kit de exonucleasa de cadena sencilla se puede utilizar, pero basa columna o métodos de precipitación también funciona bien para eliminar uninccebadores orporated y los ADN de cadena sencilla. Secuencia de los amplicones 16S utilizando r910 imprimación (Tabla 1), la creación de las reacciones según lo especificado por la instalación de secuenciación. </li><li> Utilice la secuencia de ADN resultante para interrogar a la base de datos de ADN del NCBI con la función blastn ( <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi" target="_blank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> ). Más del 97% de identidad de nucleótidos se suele tomar como identidad de la especie. </li></ol> 7. Mapeo y caracterización de integrones y cassettes Arrays NOTA: Clase 1 integrones que emanan de los ecosistemas dominados por el hombre es probable que sean los integrones más comunes en todas sus muestras. Estos integrones todos tienen un solo origen reciente, por lo que tienen una secuencia de ADN altamente conservadas 5. <ol><li> Diferenciar entre una clase 1 integrones que emanan de fuentes humanas y los que se encuentran naturalmente en muestras ambientales mediante la realización de unPCR con el cebador establece intI1F165 / intI1R476 10 (Tabla 1). NOTA: Clase 1 integrones de bacterias comensales clínicos o generarán un producto ~ 300 pb, mientras que la clase del medio ambiente 1 integrones no generarán ningún producto. </li><li> Caracterizar los integrones clínicos mediante la amplificación de la matriz de cassette con el juego de primers HS458 / HS459. Esta PCR se amplificar la región entre intI1 y el segmento conservado el 3 &#39;en el extremo de la mayoría de casete arrays. Debido a que el número y la identidad de cassettes es variable, el tamaño del producto de PCR también variará. </li><li> Purificar amplicones y secuenciar el ADN utilizando cada uno de los cebadores de amplificación. Utilice secuencias para interrogar las bases de datos de ADN utilizando la función blastn ( <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi" target="_blank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> ). </li><li> Asegúrese de nombrar de casetes siga nomenclatura estandarizada 9, ya que muchas deposiciones de datos para casete génico integróns usan nombres inconsistentes o ambiguas. Preste especial atención a los nuevos casetes de genes, ya que estos pueden codificar nuevos fenotipos, incluyendo genes que confieren un aumento transmisibilidad, patogenicidad o virulencia 8,21. Todavía circulan preclínicos sobre las formas de la clase 1 integrón en ambientes naturales: NOTA. En particular, aquellos que están vinculados a activos Tn 402 transposones son de mayor interés 26. Las matrices de cassette de estos integrones no amplificarán con el juego de primers HS458 / HS459, pero pueden ser amplificado con la MRG284 / MRG285 imprimación conjunto (Tabla 1), la generación de amplicones de dependiente en el contenido de cassette de tamaño variable. Productos de PCR deben ser purificadas y ADN secuenciado como se indica en 7.2. </li></ol>

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Los autores no tienen nada relevante a revelar.

La identificación de los integrones y sus cassettes genéticos asociados es potencialmente un paso clave en la predicción de la aparición de nuevos agentes patógenos oportunistas, el seguimiento de las vías para los patógenos en la cadena alimentaria humana, y la identificación de una nueva resistencia y virulencia determinantes 8,21,26. El objetivo de este trabajo fue describir un enfoque simplificado para el cribado de muestras para la clase 1 integrones, caracterizando sus matrices de cassette y la identifi...

El descubrimiento de los antibióticos fue uno de los mayores logros científicos del siglo 20. Sin embargo, el uso y abuso de antibióticos ha llevado a la rápida evolución de las bacterias resistentes a los antibióticos, y estos ahora representan una seria amenaza para la salud pública en el siglo 21. El surgimiento de cepas bacterianas resistentes a la mayoría de las opciones de tratamiento plantea la posibilidad de que estamos entrando en una era en que los medicamentos antimicrobianos ya no son eficaces 1,2. La maquinaria genética que confiere resistencia a los antibióticos es un sistema antiguo, anterior a los seres humanos y las presiones de selección de antibióticos por millones de años 3. Elementos genéticos móviles, tales como plásmidos, transposones, islas genómicas, elementos y integrones conjugativos integradores pueden difundir los genes de resistencia a antibióticos (ARG), tanto dentro como entre las especies bacterianas 4. De éstos, los integrones han jugado un papel central en la propagación de ARG, a pesar de lahecho de que se basan en plásmidos y transposones para la movilización y la inserción en los genomas bacterianos 5. Los integrones capturan casetes de genes usando un integrón-integrasa, y luego expresan casetes utilizando un integrón codificado promotor 6,7 (Figura 1). Integrón gen casetes son pequeños elementos móviles que consisten en cuadros individuales abiertos de lectura (ORF), cuyos productos pueden conferir resistencia a los antibióticos o desinfectantes 8. 1 integrones de clase son los integrones más comúnmente recuperados de aislados clínicos 5, donde han adquirido colectivamente más de 130 diferentes casetes de genes de resistencia a antibióticos 9. La difusión de la clase 1 integrones en comensales y patógenos bacterias humanas asociadas genera corrientes de desechos humanos que contienen un gran número de estos elementos genéticos 10. Se estima que 10 19 bacterias que contienen integrones de clase 1 se liberan a través de los lodos de depuradora cada año in el Reino Unido 11. Por lo tanto, no es sorprendente que la clase 1 integrones que confieren resistencias a antibióticos están siendo detectados en la microbiota de las aves silvestres, peces y otra fauna nativa 12-14. Liberar integrones de nuevo en el medio ambiente plantea un importante problema de salud pública, ya que la adquisición de nuevos cassettes genéticos y reordenamientos complejos con otros elementos móviles persiste, especialmente en las plantas de tratamiento de aguas residuales y otros cuerpos de agua 15-18. El entorno natural, entonces se convierte en un campo de reclutamiento fértil para nuevos determinantes de resistencia y patógenos oportunistas 19,20. Bacterias que contiene integrón-Novel y nuevas ARGs pueden rodear de nuevo en la comunidad humana a través del agua y alimentos contaminados 21,22. Vigilancia de ARGs ambientales es una estrategia clave para la comprensión y el manejo de la resistencia a los antibióticos en el futuro 23. En particular, se debe prestar atención a los alimentos que se comen crudos oligeramente cocidos, ya que estos presentan la mayor amenaza para la transmisión de nuevos elementos móviles y agentes patógenos. En este protocolo, un enfoque simplificado para la detección, identificación y caracterización de integrones de clase 1 y de sus cassettes genéticos asociados en los productos alimenticios se indica (Figura 2). Usando una combinación de cultivo y reacción en cadena de polimerasa (PCR), integrones se pueden detectar rápidamente en comunidades bacterianas complejas y aislamientos individuales. Se dan métodos para la identificación de las especies de bacterias y la conformación y la identidad de los casetes de genes integrón-asociado. El método es adecuado para una amplia variedad de alimentos vegetales y animales, y los ejemplos de los flujos de trabajo típicos se indican para cada uno de estos tipos de alimentos.

<table><tbody><tr><td>GoTaq Mastermix Incoloro</td><td>Promega</td><td>M7132</td><td>Utilizado en todas las PCR</td></tr><tr><td>ARNasa (Ribonucleasa A del páncreas bovino)</td><td>Sigma</td><td>R6513-10MG</td><td>Utilizado en todas las PCR</td></tr><tr><td>Enzima de restricción HinFI</td><td>Promega</td><td>R6201</td><td>Se utiliza para digerir productos de PCR de ADNr 16S. La enzima viene con un tampón óptimo y una escalera BSA</td></tr><tr><td>de 100 bp</td><td>GE Healthcare</td><td>27400701</td><td>Se utiliza como estándar de tamaño en todos los geles de agarosa</td></tr><tr><td>Tinción de ADN GelRed</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>PRECAUCIÓN: Se debe usar protección personal al manipular este material</td></tr><tr><td>Tiocianato de guanidinio</td><td>Life Technologies</td><td>AM9422</td><td>PRECAUCIÓN: Se debe usar protección personal al manipular este material</td></tr><tr><td>CLS-TC Solución</td><td>MP Biomedicals</td><td>6540409</td><td>Solución de resuspensión utilizada al comienzo de la extracción de ADN genómico</td></tr><tr><td>Lysing Matrix E Tubos FastPrep</td><td>MP Biomedicals</td><td></td><td>116914500 Tubo necesario para la disrupción mecánica de las paredes celulares bacterianas. Este código se utiliza para paquetes de 500 tubos, hay cantidades más pequeñas disponibles.</td></tr><tr><td>Matriz de unión</td><td>MP Biomedicals</td><td>116540408</td><td>diluida 1:5 con tiocianato de guanidinio 6 M y utilizada en el método de extracción de ADN genómico.</td></tr><tr><td>Máquina de preparación rápida</td><td>MP Biomedicals</td><td>Número de opciones disponibles</td><td>MP Biomedicals tiene una serie de máquinas FastPrep disponibles para comprar. Para más información, visita <a href="http://www.mpbio.com" target="_blank">http://www.mpbio.com</a></td></tr></tbody></table>

screening productos alimenticios para la clase 1 integrones y gene cassettes

Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes

La resistencia a los antibióticos es una de las mayores amenazas para la salud enel siglo XXI. La adquisición de genes de resistencia a través de la transferencia lateral de genes es un factor importante en la propagación de diversos mecanismos de resistencia. Entre los elementos del ADN que facilitan la transferencia lateral, los integrones de clase 1 han sido en gran medida responsables de la propagación de los determinantes de la resistencia a los antibióticos entre los patógenos Gram negativos. En total, estos integrones han adquirido y diseminado más de 130 genes diferentes de resistencia a los antibióticos. Con el uso continuo de antibióticos, los integrones de clase 1 se han vuelto omnipresentes en comensales y patógenos de los seres humanos y sus animales domésticos. Como consecuencia, ahora se pueden encontrar en todos los flujos de desechos humanos, donde continúan adquiriendo nuevos genes y tienen el potencial de regresar a los humanos a través de la cadena alimentaria. Este protocolo detalla un enfoque simplificado para la detección de integrones de clase 1 y sus casetes de genes de resistencia asociados en productos alimenticios, mediante cultivo y PCR. Con este protocolo, los investigadores deberían ser capaces de: recolectar y preparar muestras para hacer cultivos enriquecidos y detectar integrones de clase 1; aislar colonias bacterianas individuales para identificar aislados positivos para integrones; identificar las especies bacterianas que contienen integrones de clase 1; y caracterizar estos integrones y sus casetes de genes asociados.

Proyección de cultivos mixtos y aislamientos bacterianos para intI1 Conjunto de cebadores HS463a / HS464 PCR se puede utilizar para detectar la presencia del gen de la integrasa integrón de clase 1, intI1 (Figura 1). Este conjunto de cebadores funciona bien para detectar intI1 en cultivos mixtos, y también se utiliza para detectar colonias de bacterias recogidas de placas separadas (Figura 2). Aislamientos positivos deberían generar una sola b...

Este protocolo describe la detección de integrones de clase 1 y sus casetes de genes asociados en productos alimenticios.

Screening productos alimenticios para la Clase 1 integrones y Gene Cassettes

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major ...

El objetivo general de este procedimiento es ofrecer un enfoque simplificado para detectar integrones de clase uno y sus casetes génicos asociados en productos alimenticios. Esto se logra primero mediante la obtención de un cultivo bacteriano enriquecido a partir del alimento seleccionado. El segundo paso consiste en analizar el cultivo para detectar la presencia de integrones de clase uno mediante PCR y aislamiento de colonias individuales a partir del cultivo mixto positivo para integrón.Después de tamizar las colonias individuales para detectar la presencia de integrones, prepare ADN genómico a partir de las colonias individuales para realizar PCR diagnósticas que permitan diferenciar las especies bacterianas y detectar la presencia de casetes génicos. El paso final consiste en purificar los productos de PCR y enviarlos para análisis de secuenciación de ADN. En última instancia, el análisis de secuencias de ADN se utiliza para caracterizar los casetes génicos dentro de un integron de clase uno e identificar las especies en las que se encuentran.La resistencia a los antibióticos es uno de los principales problemas que enfrenta el tratamiento médico en el siglo XXI. Una de las formas en que podemos controlar la resistencia a los antibióticos es detectar y rastrear los genes de resistencia a los antibióticos en el medio ambiente, desde los seres humanos hacia el ambiente y nuevamente de regreso. Este protocolo le mostrará cómo detectar la resistencia a los antibióticos.Genes en alimentos que podríamos consumir crudos o con procesamiento mínimo. El procedimiento será demostrado por Leet Waldron, un postdoctorado que trabaja en mi laboratorio. Los alimentos que se consumen crudos o ligeramente cocidos, como frutas, verduras y mariscos, son los que más preocupan para la salud humana.Solo se demostrará aquí la preparación de cultivos enriquecidos a partir de mariscos. Consulte el texto del protocolo para la preparación de cultivos a partir de frutas y verduras. Para preparar un cultivo enriquecido a partir de mariscos, utilice primero pinzas y tijeras estériles para diseccionar el tracto digestivo de las gambas.Coloque el material diseccionado en un tubo estéril de 1,5 mililitros que contenga 200 microlitros de un tampón de fosfato sódico. Macere la muestra utilizando un pistilo para obtener un homogenato y vortexéelo. Dispense brevemente cinco mililitros de caldo LB en dos tubos estériles de cinco mililitros e inocule cada uno con el homogenato de marisco.Agite ambos tubos durante la noche a 200 OPM, incubando un tubo a 25 grados Celsius y el otro a 37 grados Celsius al día siguiente. Almacene los cultivos a cuatro grados Celsius hasta que sea necesario recuperar colonias individuales de un cultivo mixto positivo por PCR. Primero, diluya seriamente el cultivo por un factor de diez en tampón de fosfato de sodio, añadiendo un mililitro del cultivo mixto a nueve mililitros de tampón de fosfato de sodio y mezclando mediante vortex.Añada un mililitro de la dilución a otros nueve mililitros de tampón de fosfato sódico y repita el proceso hasta alcanzar una dilución seriada de 10 a la menos ocho. Extienda 100 microlitros de la cultivo diluido de la dilución 10 a la menos cuatro hasta la 10 a la menos ocho sobre agar LB. Incube las placas durante la noche a la misma temperatura utilizada para el cultivo mixto inicial, en duplicado, al día siguiente.Se pueden seleccionar colonias individuales a partir de las placas de dilución seriada. Para la preparación de ADN, asegúrese de que todas las placas y tubos de muestra estén claramente etiquetados antes de comenzar. Toque una colonia individual con un palillo estéril y luego transfiérala a un tubo de PCR que contenga 100 microlitros de agua estéril.Gire el palillo entre los dedos para desprender algunas de las células en el agua; utilizando el mismo palillo, inocule una placa de LB con una estría de cada colonia seleccionada. Grandes cantidades de colonias pueden almacenarse en placas etiquetadas. Si cada estría mide aproximadamente un centímetro de largo, cierre inmediatamente la tapa para reducir la contaminación entre muestras.Seleccione tantos tipos diferentes de colonias como sea posible utilizando criterios como el tamaño, la forma y el color de las colonias. Incube las placas de LB durante la noche a la misma temperatura utilizada para el cultivo enriquecido inicial. Los cultivos pueden entonces almacenarse a cuatro grados Celsius hasta que sean necesarios para preparar ADN a partir de las suspensiones bacterianas.Caliente las muestras a 99 grados Celsius durante 10 minutos utilizando un microcentrífuga termocicladora a 14,000 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente para formar el pellet de restos celulares; luego regrese a hielo. Posteriormente, tamice el ADN mediante PCR con los cebadores HS 4 63 A y HS 4 64. Siguiendo los procedimientos descritos en el texto del protocolo, es importante evitar cualquier fuente potencial de ADN contaminante al realizar la PCR para evaluar los resultados de la amplificación mediante electroforesis.Siete microlitros de cada producto de PCR en un gel de agarosa al 2 % vertido y corrido en tampón TBE después de teñir el gel con el colorante de ADN. Visualice el ADN utilizando un transiluminador UV. Los aislados que portan una integrina de clase uno generarán una única banda intensa de 471 pares de bases. El ADN genómico preparado a partir de aislados que dan una PCR positiva se utiliza para estos análisis. Derrita el ADN genómico sobre hielo y vortexe brevemente; luego haga una centrifugación rápida a 14 000 × g durante 20 segundos.Las secuencias de los cebadores y las condiciones de PCR utilizadas para las PCR diagnósticas se muestran en la tabla uno del manuscrito. Primero, repita la PCR para el gen de la integrasa de clase uno para confirmar que el aislado sea positivo para el amplicón de 471 pares de bases. A continuación, identifique los cultivos positivos a nivel de especie amplificando el gen del ARN ribosómico de subunidad pequeña 16 S-R-D-N-A.Todos los blancos bacterianos deben generar un amplicón de 16 S de aproximadamente 1.450 pares de bases, ya que muchas de estas cultivos positivos serán iguales. Las especies bacterianas distinguen las diferentes especies mediante digestión con enzimas de restricción del producto de PCR 16 S. Se recomienda la enzima de restricción HIF uno, ya que genera una buena diversidad a partir de los blancos 16 S y es una enzima fiable y económica.Prepare una mezcla maestra de digestión de restricción de 30 microlitros en un tubo estéril y agregue 20 microlitros del producto de PCR 16S no purificado. Incube en un baño de agua a 37 grados Celsius durante la noche; al día siguiente, verifique la digestión en un gel de AROS al 2 %. Los productos seleccionados de PCR 16S se purifican entonces utilizando un kit comercial y se envían a un laboratorio de secuenciación para el análisis de ADN. Utilice la secuencia de ADN resultante para interrogar la base de datos N-C-B-I-D-N-A con la función Blast N; generalmente se considera identidad de especie una identidad de nucleótidos mayor al 97 %.Los aislamientos bacterianos de cultivos mixtos se analizan mediante PCR para detectar la presencia del gen de la integrasa de clase uno. Mediante el uso de los cebadores HS 4 63 A y HS 4 64, las colonias positivas generan una única banda intensa de 471 pares de bases. El ADN genómico procedente de aislamientos puros se utiliza para la caracterización de los arrays intercassette. La amplificación de los arrays de cassettes a partir de integrones TN 4 0 2 utilizando los cebadores HS 4 58 y HS 4 59 genera productos de tamaños variables, dependiendo de la identidad y del tamaño de los cassettes componentes del array.La identificación de estos cassetes requiere secuenciación de ADN. Los integrones de clase ambiental uno a menudo están integrados en los cromosomas bacterianos. Sus extremos pueden amplificarse mediante los cebadores MG284 y MG285, que tienen como dianas los sitios de recombinación proximal y más distal, respectivamente. Esta PCR también genera productos de tamaño variable dependiendo de la identidad y el tamaño de los cassetes componentes en el arreglo.Sin embargo, es poco probable que los cassetes en matrices ambientales codifiquen resistencia a antibióticos. Las especies bacterianas se identifican amplificando el ARN 16S y analizando los productos de PCR mediante digestión enzimática. Con HIF, una especie individual generará patrones distintivos, de modo que los aislamientos de la misma especie puedan identificarse y confirmarse fácilmente mediante secuenciación de ADN.Después de ver este video, ahora debería tener una buena idea de cómo aislar los ingramas de Clase uno y sus cassettes de resistencia a antibióticos a partir de alimentos cotidianos.

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Research

Investigación

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Un método rápido y eficiente para integrar ADN ajeno de interés en cepas aceptor pre-hechas, llamadas cepas pista de aterrizaje, se describe. El método permite específica del sitio de integración de un cassette de ADN en el locus de aterrizaje almohadilla de ingeniería de una cepa dada, a través de la conjugación y expresión de la integrasa ΦC31.

Sitio específico de Ingeniería cromosoma bacteriano: ΦC31 integrasa mediada Cassette Exchange (IMCE)

Las bacterias producen compuestos secretados que tienen el potencial de afectar a la fisiología de sus vecinos microbianos. Aquí se describe una pantalla de co-cultivo que permite la detección de este tipo de interespecies mediadas químicamente interacciones mediante la mezcla de los microbios del suelo con cepas reportero transcripcional fluorescentes de Bacillus subtilis en medios sólidos.

Usando Coculture detectar químicamente mediadas por interacciones interespecíficas

Este trabajo presenta un método de cribado de alto rendimiento utilizando un sistema universal de cribado genético de enzimas que teóricamente puede aplicarse a más de 200 enzimas. En este caso, el sistema de cribado único identifica tres enzimas diferentes (lipasa, celulasa y fosfatasa alcalina) simplemente cambiando el sustrato utilizado (acetato de p-nitrofenilo, p-nitrofenil-β-D-celobiósido y fosfato de fenilo).

Multienzimático de detección sistemática mediante un sistema de cribado genético de la enzima de alto rendimiento

Salmonella sppShigella spp., son patógenos comunes atribuidas a la diarrea. Aquí, describimos una plataforma de alto rendimiento para la detección de Salmonella spp. /Shigella spp., utilizando PCR en tiempo real combinado con cultura guiada.

Una plataforma de alto rendimiento para la detección de Salmonella spp. /Shigella spp.

Aquí presentamos un protocolo para el uso de preexistentes antibiótico resistencia-cassette borrado construcciones como base para la fabricación de mutantes de deleción en otras cepas de e. coli . Tales mutaciones de la canceladura pueden ser movilizados e inserta en el correspondiente locus de una cepa receptora mediante transducción de bacteriófago P1.

Producción de canceladuras del Gene en Escherichia coli por transducción de P1 con casetes de resistencia a los antibióticos

La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) es una prueba de amplificación de ácido nucleico isotérmico (iNAAT) que ha atraído un amplio interés en el campo de detección de patógenos. Aquí, presentamos un protocolo Salmonella LAMP validado multi-laboratorio como un método rápido, confiable y robusto para la detección de Salmonella en alimentos animales y la confirmación de la presunta Salmonella del aislamiento cultural.

Amplificación isotérmica mediada por bucle para la detección de salmonela en alimentos para animales y la confirmación de salmonela del aislamiento cultural

El protocolo describe cómo lograr modificaciones dirigidas al sitio en el genoma de los mosquitos de la malaria Anopheles utilizando el sistema φC31 . Las modificaciones descritas incluyen tanto la integración como el intercambio de casetes transgénicos en el genoma de las líneas de acoplamiento que llevan attP.

Integración mediada por φC31 dirigida por sitios e intercambio de casetes en anopheles vectores de malaria

Campylobacter es la principal causa de gastroenteritis bacteriana transmitida por los alimentos en todo el mundo. A pesar de que los establecimientos adoptan medidas para reducir la prevalencia en sus instalaciones, los productos contaminados llegan constantemente a los consumidores. La técnica desarrollada durante los últimos doce años aborda las limitaciones de los métodos existentes para aislar y detectar Campylobacter spp. de la carne cruda.

Detección y aislamiento de Campylobacter spp. a partir de carne cruda

Describimos un procedimiento sencillo para la complementación cromosómica de una sola copia de un gen de bomba de eflujo utilizando un sistema de expresión basado en mini-Tn7 en una cepa de Acinetobacter baumannii deficiente en eflujo modificada. Esta precisa herramienta genética permite controlar la expresión génica, lo cual es clave para la caracterización de las bombas de eflujo en patógenos multirresistentes.

Caracterización de sistemas de eflujo de múltiples fármacos en Acinetobacter baumannii utilizando una cepa bacteriana deficiente en eflujo y un sistema de expresión génica de copia única

Este estudio establece un conjunto de procedimientos operativos estándar (SOP, por sus siglas en inglés) para detectar y aislar de manera eficiente las bacterias intestinales capaces de escindir los glucósidos C.

Cribado y aislamiento de bacterias intestinales escindidoras de glucósidos C

Aprende a detectar integrones de clase 1 y cassettes de genes de resistencia en alimentos mediante cultivo bacteriano, PCR y secuenciación. Este protocolo permite identificar bacterias portadoras en mariscos y vegetales crudos.

Screening productos alimenticios para la Clase 1 integrones y Gene Cassettes

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