Visualización de miniSOG Tagged proteínas de reparación de ADN en combinación con Electron espectroscópico Imaging (ESI)

El objetivo general del siguiente experimento es mapear la distribución de las proteínas de reparación del ADN alrededor de roturas en doble cadena del ADN a escala nanométrica. Con el fin de estudiar la ultraestructura de la cromatina dañada que está siendo reparada mediante imágenes espectroscópicas electrónicas. Esto se logra generando constructos de expresión de ADN que codifican proteínas de fusión de proteínas de respuesta al daño del ADN utilizando una proteína fluorescente y la etiqueta mini SOG.

Como segundo paso, los constructos se introducen en las células mediante transfección, y luego las células se dañan mediante irradiación con láser o con rayos gamma. A continuación, las células irradiadas y fijadas pasan por los pasos de preparación para microscopía electrónica con el fin de hacer visible en el microscopio electrónico la distribución de la proteína de reparación marcada con mini SOG. La imagen espectroscópica electrónica resultante proporciona imágenes detalladas que permiten el análisis de la ultraestructura de la cromatina y la relación de proteínas específicas con los focos de reparación del ADN.

La principal ventaja de esta tecnología frente a otras tecnologías existentes como la marcación con inmunogold es que no depende de la disponibilidad de anticuerpos y que marca de forma bastante densa las estructuras de interés. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a que la fotooxidación es muy sensible al pH, a la intensidad de la luz y a la saturación de oxígeno. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de fotooxidación, saturación de oxígeno e iluminación son sensibles a cambios muy pequeños, por lo que es importante ilustrar cómo se realiza el método para poder reproducirlo.

El Dr. Hilmar Fadden, un posdoctorado en mi laboratorio, le demostrará el método para el cultivo. Células de osteosarcoma humano que expresan establemente las proteínas de reparación marcadas con mini SOG y M cherry, tal como se describe en el protocolo de texto adjunto. Después de dividir las células procedentes de una placa de 10 centímetros, cultive las células hasta alcanzar una confluencia del 80%.

A continuación, coloque las células bajo un microscopio de fluorescencia y utilice un lápiz estéril de diamante para delinear un área pequeña de aproximadamente un milímetro cuadrado que contenga células que expresan las proteínas ectópicas; una vez marcadas, sensibilice las células añadiendo herx a la solución para que la concentración final sea de 0,5 microgramos por mililitro, y luego colóquelas en el incubador a 37 grados Celsius durante 20 minutos. A continuación, irradie las células con microirradiación láser utilizando el láser de estado sólido de 405 nanómetros de un microscopio confocal con el fin de inducir daño en el ADN; tras el daño en el ADN, fije las células en la oscuridad usando un mililitro de paraformaldehído al 4 % en tampón de citato de sodio 0,1 molar a temperatura ambiente después de 30 minutos.

Lave las células dos veces con cuatro mililitros de tampón de Cate de sodio 0,1 molar a un pH de 7,4. A continuación, trate las células fijadas con dos mililitros de una solución que contiene 50 milimolar de glicina, cinco milimolar de amino triazol y 10 milimolar de cianuro de potasio a un pH de 7,4 durante 30 minutos. Reemplace el tampón con dos mililitros de tampón de fotooxidación a un pH de 7,4, que se preparó según se describe en el protocolo de texto adjunto.

Luego, incube la muestra a oscuras sobre hielo mientras se burbujea oxígeno en la solución para mantenerla saturada de oxígeno. A continuación, monte cuidadosamente la placa con las células fijadas sobre un microscopio de fluorescencia invertido equipado con un objetivo de inmersión en aceite de 40 x y muévala al área de interés que se delimitó previamente. Excite la etiqueta mini SOG con luz azul utilizando cubos de filtro para la proteína verde fluorescente.

Continúe con la iluminación incluso después de que la fluorescencia verde del mini SOG haya desaparecido por completo y hasta que el producto marrón de fotooxidación del diaaminobencidina polimerizado aparezca en el canal de luz transmitida. Luego, postfije las células con un mililitro de glutaraldehído al 2% en tampón de citato sódico 0,1 molar, pH 7,4, durante 30 minutos.

A continuación, fije las membranas celulares con tetróxido de osmio al 0,1-0,5 % en tampón de catecolato de sodio 0,1 molar durante 20 minutos a pH 7,4. Una vez fijadas, deshidrate las células mediante una serie de lavados con etanol. Luego, incube las células en una mezcla uno a uno de etanol al 100 % y resina acrílica en agitador durante cuatro horas.

A continuación, retire la mezcla y agregue resina acrílica al 100 % a las muestras durante cuatro horas adicionales. Para polimerizar la resina, corte la tapa de un tubo microcentrífugo de dos mililitros etiquetado con una cuchilla de afeitar y cubra el borde con acelerador de resina acrílica. Llene cuidadosamente el tubo aproximadamente hasta dos tercios de su capacidad con resina LR white utilizando una pipeta Pasteur.

Tenga cuidado de que la resina no entre en contacto con el acelerador en el borde. Retire la resina que ha infiltrado las celdas del platillo y coloque el platillo boca abajo sobre el tubo de microcentrífuga colocado en posición vertical, de modo que el ancho del tubo llene casi por completo la ventana de observación cubierta con vidrio del peso del platillo. Deje de uno a dos minutos para que el acelerador selle el tubo y la cubeta.

Luego invierta el tubo para que la resina en el tubo cubra ahora las células. Coloque el recipiente con el tubo en un horno a 60 grados Celsius y polimerice durante 12 horas. Cuando el bloque esté polimerizado, retire el recipiente con el tubo de microcentrífuga lleno de resina del horno y separe el tubo de microcentrífuga del recipiente.

Deseche el recipiente con fondo de vidrio y corte cuidadosamente el tubo de microcentrífuga con una cuchilla de afeitar para liberar el bloque. Con una cuchilla de afeitar, recorte el bloque de modo que solo permanezca la región de un milímetro cuadrado que contiene el área marcada previamente con el lápiz de diamante o de tungsteno. A continuación, monte el bloque en un ultramicrotomo y recórtelo con una cuchilla de desbaste hasta acercarse a las células.

Luego cambie a un cuchillo de diamante y corte secciones ultradelgadas de aproximadamente 50 nanómetros a través de las células. Recoga las secciones sobre rejillas de alta transmisión de 300 mallas. A continuación, coloque las rejillas en un revestidor de carbono y recubra las secciones con alrededor de 0,2 a 0,4 nanómetros de carbono para ayudar a estabilizarlas bajo el haz de electrones del microscopio electrónico de transmisión.

Cargue las rejillas en un microscopio electrónico de transmisión equipado con un filtro de energía. Inspeccione las células en las secciones utilizando el modo de transmisión normal con baja magnificación y compárelas con las imágenes de fluorescencia tomadas anteriormente. Una vez que se encuentre un núcleo con una trayectoria de daño en el ADN o focos de reparación del ADN, cambie al modo de filtrado de energía y registre la muestra con un mapa de espesor.

A continuación, registre las imágenes del mapa de fósforo tras el borde a una pérdida de energía electrónica de 175 con un ancho de rendija de 20 electronvoltios. También registre imágenes previas al borde a una pérdida de energía de 120 electronvoltios, asimismo con un ancho de rendija de 20 electronvoltios para el registro de los mapas de nitrógeno. Imágenes tras el borde a 447 electronvoltios con un ancho de rendija de 35 electronvoltios e imágenes previas al borde a 358 electronvoltios.

También con un ancho de rendija de 35 electrones voltios. Abra los mapas de relación elemental en un software de procesamiento de imágenes como este. Copie el mapa de nitrógeno en el canal rojo y el mapa de fósforo en el canal verde de una imagen RGB.

Luego superponga y alinee los mapas. Exporte la imagen compuesta como un archivo en formato de archivo de imagen etiquetado y, a continuación, abra la imagen en un software de procesamiento de imágenes que pueda utilizar capas. A continuación, ajuste el rango dinámico de cada canal reescalando los valores mínimo y máximo de la imagen a un conjunto de datos de ocho bits.

Luego reste el contenido de fósforo del mapa de nitrógeno dentro de la ventana de capas. Convierta la imagen a un color indexado y cree una tabla de búsqueda amarilla en el espacio de color CMYK para el mapa que muestra la distribución de ácidos nucleicos y una tabla de búsqueda cian para mostrar el mapa de proteínas no cromatínicas. A continuación, cree una imagen nueva e importe los mapas que muestran las distribuciones de fósforo y proteína no cromatínica como capas diferentes.

Utilice el modo de transparencia de pantalla para ver ambas capas superpuestas una sobre la otra. Aquí se muestran mapas de relación espectroscópica de electrones desde el interior de un núcleo celular, que indican las ubicaciones de fósforo y nitrógeno cuando los dos mapas de relación se superponen entre sí en el espacio de color RGB. Se obtiene una imagen como la mostrada aquí en esta imagen.

Las estructuras amarillas representan proteínas nucleares que reflejan la presencia de fósforo y nitrógeno. Aquí, la imagen espectroscópica de electrones se utiliza para observar los cambios en la estructura de los focos tras la irradiación gamma en células U2 OS. En la fila superior, las imágenes de células que expresan establemente proteínas de reparación marcadas con M cherry corresponden a células que no fueron irradiadas.

La segunda fila muestra células que fueron fijadas tres horas después de la radiación. La tercera fila muestra células fijadas seis horas después de la radiación. La imagen espectroscópica de electrones revela que la estructura de los focos parece reorganizarse con el tiempo, ya que la cantidad relativa de la proteína 53BP1 en el foco, indicada por el aumento de la señal de nitrógeno, parece incrementarse, mientras que la cromatina, indicada por la señal de fósforo, adopta una posición más periférica.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar células irradiadas que expresan proteínas mini so reparadoras para analizar la ultraestructura de la cromatina en focos de reparación de DA mediante imágenes espectroscópicas electrónicas. No olvide que trabajar con tampón de cianuro de potasio y óxido de osmio puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como trabajar en una campana extractora y usar guantes, durante la realización de este procedimiento.