Name: Visualización de miniSOG Tagged proteínas de reparación de ADN en combinación con Electron espectroscópico Imaging (ESI) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: Aprende a visualizar proteínas de reparación de ADN marcadas con miniSOG mediante imagen espectroscópica de electrones. Este método permite analizar la ultraestructura de la cromatina dañada con resolución nanométrica.

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Agradecemos al Dr. Roger Tsien por proporcionarnos las construcciones miniSOG. Dr. Xuejun Sun por su ayuda con el TEM. Lisa Lem y Peter Shipple, del Cross Cancer Institute, por suministrar oxígeno. Hilmar Strickfaden tiene una beca postdoctoral de la Fundación contra el Cáncer de Alberta y fue apoyada por la Bayrische Forschungsallianz. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud y la Fundación del Cáncer de Alberta.

1. Generación de miniSOG líneas celulares <ol><li> Crecer células U2OS (osteosarcoma humano) en una placa de 35 mm que contiene 2 ml de glucosa baja en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que se suplementó con 10% de suero bovino fetal (FBS) a 37 ° C en un incubador humidificado con 5% de CO 2 atmósfera. </li><li> Transfectar las células cuando son 80% de confluencia mediante lipofección con la calidad de la transfección purificada (A269 / ratio de 280 1.8-2.0) construcciones de plásmidos que contienen las secuencias para miniSOG y mCherry etiquetados proteínas de reparación de acuerdo con el protocolo del fabricante del reactivo de transfección 19. Los plásmidos de expresión miniSOG pueden ser solicitados a la Tsien-Lab: <a href="http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm">http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm</a> </li><li> Ordenar las células que expresan la proteína recombinante con la etiqueta miniSOG y mCherry por fluorescencia de células activadas por la clasificación dos días después de la transfección. Recoger las célulascon la intensidad de fluorescencia intermedia con el fin de evitar las células que se sobreexpresan 20. </li><li> Cultivar las células positivas en un plato de 10 cm en 10 ml de medio DMEM que se complementa con 10% de FBS y 0,6 g / ml del agente de selección G418 (geneticina). </li><li> Después de colonias visibles han surgido en las placas, de pantalla para colonias mCherry positivas usando un microscopio de fluorescencia invertido y dibujar círculos alrededor de ellos (en la parte inferior de la placa) con un marcador permanente. Use un lente objetivo de aire bajo aumento (por ejemplo, 10 veces) y recoger clones usando una técnica estéril por rascarse cuidadosamente las colonias fuera y lentamente chupar ellos en una punta de pipeta de 1.000 l estéril. </li><li> Expandir las colonias seleccionadas y congelar partes de ellos hacia abajo usando el medio de crecimiento descrito en el paso 1.1 suplementado con 10% de sulfóxido de dimetilo. Pon a prueba las células para la formación DRF cultivándolas en 18 x 18 mm 2 cubreobjetos estériles y exponiéndolos a2 Gy de radiación. Las células irradiadas que expresan establemente un miniSOG mCherry etiquetados proteína de reparación debe mostrar el patrón típico característico focal de DSBs cuando visualizó con un microscopio de fluorescencia utilizando un filtro de set-para obtener imágenes de mCherry. </li></ol> 2. Cultivo Celular <ol><li> Cultura U2OS células que expresan establemente el miniSOG y mCherry etiquetados proteínas de reparación en las condiciones descritas en el paso 1.1. Cultivan las células a 80% de confluencia en una placa de fondo de vidrio de diámetro 35 mm que contiene 2 ml de DMEM. Asegúrese de que el pegamento que une la hoja de la cubierta para el plástico y el plástico utilizado es resistente a las soluciones acuosas y alcohólicas y resistente a la resina utilizada! </li><li> Antes de realizar el experimento, esbozar una pequeña zona de aproximadamente 1 mm 2 que contiene células que expresan las proteínas ectópicos por el rascado con una pluma de diamante estéril usando un microscopio de fluorescencia para identificar la región de interés. Alternativamente, puede utilizar un plato con fondo de cristal tsombrero contiene un cubreobjetos con un sistema de red pre-grabado al agua fuerte incorporado en el cubreobjetos. NOTA: Si utiliza la microscopía correlativa de alta calidad que combina ESI y fluorescencia imágenes microscópicas 21, asegúrese de que el grosor del cubreobjetos es compatible con los objetivos de inmersión en aceite. Debe tener el espesor No. 1,5 (desde 0,16 hasta 0,18 mm). Elija un área cerca del centro del plato para la región a ser examinada en el TEM con el fin de evitar problemas con la polimerización de la resina que puede ocurrir cerca de los bordes (véase el punto 4.10 a 4.13). </li></ol> 3. ADN Inducción Daños <ol><li> Irradiar las células con radiación gamma, utilice un fármaco radio, o inducir el daño por irradiación láser micro en un microscopio confocal (por ejemplo, como se describe en 18,22 o 23). </li><li> En este ejemplo, irradiar las células con 2 y 6 Gy de irradiación gamma en un microirradiate de cesio-137 fuente de radiación o láser usando el sol 405 nmIdentificación del láser de estado de un microscopio confocal después de la sensibilización de las células durante 20 min con 0,5 g / ml Hoechst. </li></ol> Preparación 4. Muestra <ol><li> Fijar las células con 1 ml de paraformaldehído al 4% en tampón cacodilato PRECAUCIÓN 0,1 M de sodio o en tampón fosfato 0,1 M pH 7,4 durante 30 min a RT en la oscuridad. PRECAUCIÓN: El paraformaldehído y cacodilato de sodio son tóxicos! Use guantes y disponer adecuadamente las sustancias tóxicas. </li><li> Lavar las células dos veces con 4 ml de tampón de cacodilato de sodio 0,1 M pH 7,4 o tampón fosfato pH 7,4. </li><li> Tratar las células fijadas con glicina 2 ml de 50 mM, 5 mM aminotriazol y 10 mM cianuro de potasio PRECAUCIÓN en tampón cacodilato 0,1 M de sodio o un tampón de fosfato 0,1 M (pH 7,4) (comprobar el pH!) Por 30 min con el fin de bloquear sin reaccionar grupos aldehído y para suprimir la especies reactivas de oxígeno generadas por grupos hemo, que puede aumentar el fondo. PRECAUCIÓN: cianuro de potasio es extremadamente tóxico! Wguantes de oído, trabajan bajo una capucha y disponer adecuadamente las sustancias tóxicas. La reacción es muy sensible a pH por lo que es importante que el pH verificados y precisa. </li><li> Registre el área que se seleccionó en el paso 2.2 en 2D o 3D en un microscopio de fluorescencia invertida, si se desea microscopía correlativa. </li><li> Preparar una solución de diaminobencidina 1 mg / ml de clorhidrato PRECAUCIÓN mediante la colocación de un comprimido de 10 mg de clorhidrato de diaminobencidina en un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Añadir 980 l de H2O destilada y 20 l de ácido clorhídrico concentrado (11,65 M) y mezclar hasta que la solución es de color marrón claro y translúcido. Diluir esta solución en 0,1 M de fosfato o tampón de cacodilato de sodio 0,1 M a una concentración final de 1 mg / ml mientras se ajusta el pH con hidróxido de sodio a un pH entre 7,0 y 7,6 (pH 7,4 se recomienda). PRECAUCIÓN: Diaminobencidina es tóxico! Use guantes y disponer adecuadamente las sustancias tóxicas. </li><li> Para fotooxidación, replace el tampón con 2 ml de una solución de 1 mg / ml de diaminobencidina hidrocloruro en tampón cacodilato 0,1 M de sodio o tampón fosfato. Proteger esta solución de la luz y enfriarlo en hielo para 4 o C con el fin de aumentar la solubilidad del oxígeno. Saturar la solución con oxígeno burbujeando oxígeno a través de la solución (utilizar una manguera que se inserta en la solución y conectado a una botella de oxígeno). Comprobar el pH de nuevo y ajustar si es necesario. NOTA: Es fundamental para la reacción de foto-oxidación que el pH está entre pH 7,0 y pH 7,6. </li><li> Montar el plato con las células fijadas con cuidado sobre un microscopio de fluorescencia invertido equipado con una lente de objetivo de 40x de inmersión en aceite y moverlo a la zona de interés. Excite la etiqueta miniSOG con luz azul utilizando cubos de filtro para las buenas prácticas agrarias o PPC. MiniSOG tiene un máximo de excitación a 448 nm con un hombro a 473 nm 10. </li><li> Continuar con la iluminación, incluso después de que el verde miniSOG fluorescencia jas desaparecido por completo y hasta que el producto fotooxidación marrón del Diaminobencidina polimerizado emerge en el canal de la luz transmitida. Cuando el producto de oxidación es visible en la mayoría de las células, apagar la iluminación de fluorescencia para detener la foto-oxidación. NOTA: La foto-oxidación puede tardar varios minutos, dependiendo de la lente del objetivo, las longitudes de onda de transmisión del filtro y la eficiencia, y la fuente de iluminación. </li><li> Postfix las células con 1 ml de glutaraldehído al 2% en cacodilato de sodio 0,1 M pH 7,4 tampón de pH o tampón de fosfato 7,4 durante 30 min. </li><li> Fijar las membranas de las células con 0,1% -0,5% de tetróxido de osmio durante 20 min en tampón cacodilato de sodio 0,1 M pH 7,4 o en 0,1 M tampón fosfato pH 7,4. NOTA: Se recomienda el uso de la concentración más baja posible de tetróxido de osmio requerido para estabilizar las membranas. Puesto que los precipitados DAB polimerizados tienen una alta densidad de nitrógeno, que puede ser detectada directamente por ESI, un fuertetinción de osmio no es necesario identificar la proteína marcada con miniSOG y podría ser perjudicial para la ESI. El tetróxido de osmio es muy tóxico! Trabajar en una campana extractora y disponer adecuadamente los residuos tóxicos. </li><li> Deshidratar, las células a través de una serie de etanol usando 30%, 50%, 70%, 90%, 98% 100 pasos de etanol (% cada 5 min). Posteriormente, se incuban las células en una mezcla 1: 1 de etanol al 100% y resina acrílica (LR White) y poner el plato en un agitador durante 4 horas para facilitar la infiltración en las células antes de la incubación de las células durante al menos otros 4 h en 100 resina acrílica% (LR White). </li><li> Con el fin de polimerizar la resina, cortar la tapa de un tubo de microcentrífuga de 2 ml marcado con un hoja de afeitar y recubrir el borde con acelerador de resina acrílica. Asegúrese de que el acelerador sólo cubre la llanta y no fluye en el tubo. Posteriormente, llenar cuidadosamente el tubo aproximadamente dos tercios con resina LR White usando una pipeta Pasteur. Tenga cuidado de que la resina no entra en contacto ingenioh el acelerador en la llanta! </li><li> Retire la resina que se infiltró en las células en el plato y colocar el plato boca abajo sobre el tubo de microcentrífuga de pie en posición vertical para que el ancho del tubo se llena casi por completo la ventana de observación de vidrio cubierto del plato. </li><li> Espere 1 a 2 min para el acelerador para sellar el tubo y el cubreobjetos, a continuación, invertir el tubo de manera que la resina en el tubo cubre ahora las células. </li><li> Coloque el plato con el tubo en un horno a 60 ° C y curar durante 12 horas. </li><li> Cuando se cura el bloque, retire el plato con el tubo de microcentrífuga de llenado de resina adjunta del horno y separar el tubo de microcentrífuga de la antena. Facilitar la separación por ciclos de congelación-descongelación en nitrógeno líquido y agua caliente. </li><li> Deseche el plato con fondo de cristal y cortar cuidadosamente abrir el tubo de microcentrífuga con una hoja de afeitar con el fin de quitar el bloqueo. </li><li> Marque el bloque con un marcador permanente. </li><li> Utilice una hoja de afeitar a trim el bloque de manera que nada más que la región de 1 mm 2 que contiene el área marcada previamente con el lápiz de diamante o de tungsteno (o contiene el área con las células de interés) se mantiene. </li><li> Monte el bloque en un ultramicrotomo, recorte el bloque con un cuchillo de cortar y cortar secciones ultrafinas de aproximadamente 50 nm usando un cuchillo de diamante. </li><li> Recoge las secciones de alta transmisión de 300 redes de malla. Estas rejillas tienen muy pequeñas barras de la rejilla y por lo tanto cubren menos células en el área de interés. </li><li> Cubra las secciones sobre las rejillas con aproximadamente 0,2 a 0,4 nm de carbono utilizando un dispositivo de recubrimiento de carbono para ayudar a estabilizar bajo el haz de electrones del TEM. </li></ol> 5. Microscopía Electrónica <ol><li> Cargar las rejillas en un TEM que está equipado con un filtro de energía. Después de sintonizar el microscopio y el filtro de energía de acuerdo con las instrucciones del fabricante, inspeccionar las células en las secciones en el modo de bajo aumento (transmisión normal) y compararellos a la fluorescencia de datos cuando sea apropiado (obtenido en el paso 4.4). </li><li> Una vez que un núcleo con características interesantes (pista daño en el ADN o ADN focos de reparación) se encuentra, cambie al modo de filtrado de energía y registrar un mapa de espesor. NOTA: Este procedimiento incluye la grabación de una pérdida de cero y una imagen sin filtrar. Espesores de hasta 0,3 recorrido libre medio (30% de los electrones del haz incidente se dispersa por la muestra) son lo suficientemente delgada como para generar buenos mapas elementales. </li><li> Mapas de relación de registro de los elementos fósforo y nitrógeno utilizando el software que controla el filtro de la energía del microscopio usado. Registre el mapa de fósforo imágenes de borde posterior en 175 eV pérdida de energía con una anchura de rendija de 20 eV y pre-borde imágenes a 120 eV pérdida de energía, también con una anchura de rendija de 20 eV. Para los mapas de nitrógeno, grabar imágenes de borde posterior de 447 eV con un ancho de ranura de 35 eV y pre-borde imágenes a 358 eV, también con un ancho de ranura de 35 eV. NOTA: Debido a que el contenido de los elementos fotografiados (fosfOrus y nitrógeno) es relativamente baja (aprox. 1%), elija &quot;Relación de Imagen&quot; (mapa elemental cualitativo) sobre el &quot;Método 3 ventana&quot; (cuantificar mapa elemental) con el fin de generar imágenes con una mejor relación señal-ruido. </li></ol> Procesamiento 6. Imagen <ol><li> Abra los mapas elementales de relación en un software de procesamiento de imágenes que puede manejar el formato de archivo de las imágenes adquiridas (por ejemplo, Micrografía Digital). Copie el mapa de nitrógeno en el canal rojo y el mapa de fósforo en el canal verde de una imagen RGB, a continuación, superponer y alinear los mapas. </li><li> Exportar la imagen compuesta como un archivo de formato de archivo de imagen etiquetada (TIFF). Abre la imagen en un software de procesamiento de imágenes que se pueden usar capas (por ejemplo, Photoshop). </li><li> Ajuste el rango dinámico de cada canal por reescalar los valores máximo y mínimo en la imagen a un conjunto de datos de 8 bits (0 a 255). </li><li> Restar el contenido de fósforo desde el mapa de nitrógeno (usando el&quot;Capas&quot; ventana) con el fin de generar un mapa cualitativo que muestra la distribución de la proteína. </li><li> Convertir los mapas del ácido nucleico (fósforo) y la proteína (nitrógeno), creado en el paso anterior en &quot;color indexado&quot; y crear una tabla de búsqueda de color amarillo en el espacio de color CMYK para el mapa que muestra la distribución de ácido nucleico y una tabla de búsqueda cian para mostrar el mapa no nucleoproteína. Los colores se eligen para generar el máximo contraste entre los dos mapas elementales. </li><li> Crear una nueva imagen e importar los mapas que muestran la distribución de fósforo y proteínas como las diferentes capas. Utilice el modo de transparencia &quot;pantalla&quot; con el fin de ver las dos capas superpuestas unas sobre otras. </li><li> Abra la imagen-cero pérdida adquirida en el paso 5.2. Esta imagen representa una imagen de la zona grabada que se ve una imagen TEM convencional como pero sólo contiene los electrones que han pasado a través de la muestra sin chocar con la muestra. Exportaciónesta imagen como una imagen TIFF. </li><li> Abra la imagen cero pérdida exportado en un editor de fotos y copiarlo en la capa superior de la imagen que muestra el mapa elemental. Alinear la imagen usando el modo de transparencia &quot;pantalla&quot;. </li><li> Umbral Opcionalmente la imagen para bajar de cero a segmento de la señal que se origina en el miniSOG. Añadir la imagen resultante como una capa separada como se describe anteriormente. </li></ol>

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<li>Lukas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1+nuclear+bodies+form+around+DNA+lesions+generated+by+mitotic+transmission+of+chromosomes+under+replication+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">53BP1 nuclear bodies form around DNA lesions generated by mitotic transmission of chromosomes under replication stress.</a> Nature. 13, 243-253 (2011).</li>
<li>Harrigan, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+stress+induces+53BP1-containing+OPT+domains+in+G1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Replication stress induces 53BP1-containing OPT domains in G1 cells.</a> The Journal of Cell Biology. 193, 97-108 (2011).</li>
<li>Aronova, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprint+of+%27Three-dimensional+elemental+mapping+of+phosphorus+by+quantitative+electron+spectroscopic+tomography+%28QuEST%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Reprint of 'Three-dimensional elemental mapping of phosphorus by quantitative electron spectroscopic tomography (QuEST).</a> J. Struct. Biol. 161, 322-335 (2007).</li>
<li>Fussner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+heterochromatin+reorganization+during+somatic+cell+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Constitutive heterochromatin reorganization during somatic cell reprogramming.</a> The EMBO journal. 30, 1778-1789 (2011).</li>
<li>Kepkay, R., Attwood, K. M., Ziv, Y., Shiloh, Y., Dellaire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KAP1+depletion+increases+PML+nuclear+body+number+in+concert+with+ultrastructural+changes+in+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">KAP1 depletion increases PML nuclear body number in concert with ultrastructural changes in chromatin.</a> Cell cycle. 10, Georgetown, Tex. 308-322 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

ESI puede servir como una herramienta excelente para examinar diferentes estados de la cromatina y ribonucleoproteínas en el núcleo debido a que es capaz de asignar específicamente a las zonas que son ricos en fósforo. Es profundamente aumenta la cantidad de detalle que se puede obtener por un microscopio electrónico y no depende de los métodos de contraste no específicos. Una desventaja de ESI es que requiere secciones más delgadas que TEM convencional al mismo voltaje de aceleración. Esto se puede superar mediante el ...

A pesar de los importantes avances en microscopía de luz en los últimos años 1, celulares biólogos todavía sufren de una brecha en la resolución. Esto limita la comprensión de las relaciones estructura-función en los procesos celulares fundamentales que implican la interacción coordinada entre los complejos macromoleculares (por ejemplo, en remodelación de la cromatina, la reparación del ADN, el ARN transcripción y replicación de ADN). Aunque los microscopios electrónicos de transmisión (TEM) es proporcionar la resolución necesaria, ha sido un reto para definir estos procesos estructuralmente debido a la incapacidad para etiquetar proteínas específicas al mismo tiempo ser capaz de determinar la composición bioquímica de las estructuras visualizadas. En ausencia de membranas internas para ayudar a diferenciar las estructuras nucleares, el núcleo ha sido particularmente difícil. Electron espectroscópica de imágenes (ESI) resuelve algunas de estas limitaciones, permitiendo la detección simultánea y diferenciación de ADN, ARN y protein-basada estructuras nucleares 2-5. Electron imágenes espectroscópicas: Con el fin de mapear las distribuciones elementales a alta sensibilidad y resolución en el microscopio electrónico, se puede usar un espectrómetro de imágenes que selecciona los electrones que han sido dispersos inelásticamente través de interacciones con electrones de la capa interior de un elemento en la muestra 6. Puesto que las cantidades de elementos específicos de la energía se pierden como consecuencia de la ionización de los átomos en la muestra, estos electrones se pueden separar y se visualizaron usando un espectrómetro que está unido al microscopio electrónico. Por lo tanto, el análisis del espectro de los electrones que han interactuado con el espécimen revela información cualitativa y cuantitativa acerca de la composición elemental de la muestra 7. Los electrones que no pierden energía cuando pasa a través de la muestra se encuentran en el &quot;pico de pérdida cero&quot; de la pérdida de energía de electronesespectro. La abundancia de estos electrones se relaciona con la masa, densidad y espesor de la muestra y se compone de electrones que pasan a través de la muestra sin chocar con la muestra o la pérdida de energía durante el paso a través de la muestra. Esta información puede ser útil para la cuantificación absoluta de los números de átomos de un elemento específico presente en la muestra 8. Dado que las muestras biológicas consisten principalmente de elementos ligeros que mal desvían los electrones en el haz incidente de la TEM, métodos de tinción usando sales de metal pesado tienen que ser aplicados con el fin de generar contraste en la muestra. La falta de especificidad de la mayoría de estos agentes de contraste y la incapacidad para visualizar más de una mancha donde es posible especificidad ha limitado el valor de la microscopía electrónica convencional en el estudio del núcleo. ESI tiene ventajas significativas sobre TEM convencional, en particular para el estudio de las estructuras del núcleo de la célula.Es posible explotar la naturaleza rica en fósforo de ADN y complejos macromoleculares que contienen ARN para distinguir los complejos de nucleoproteína de complejos de proteínas y para resolver diferentes complejos de nucleoproteína en función de su densidad de ácidos nucleicos. El material biológico restante se pueden obtener imágenes en base a su abundancia de nitrógeno. Asignación de sólo estos dos elementos y el análisis de su distribución y abundancia relativa dentro de las diferentes estructuras anatómicas nos proporciona una gran cantidad de información sobre el núcleo. Por ejemplo, es fácil identificar la cromatina y los ribosomas en el mapa que representan la abundancia de fósforo. El espacio interchromatin, complejos de poro nucleares, y los cuerpos nucleares, por otro lado, pueden detectarse fácilmente en la imagen del mapa de nitrógeno. Mini sistema generador de oxígeno singlete (miniSOG) Mientras ESI representa una poderosa técnica para el estudio de la estructura de la cromatina in situ, ya que tomas ventaja de las relaciones característicos en la composición elemental entre el fósforo y el nitrógeno, la composición elemental no puede normalmente ser usada para discriminar entre diferentes poblaciones de complejos de proteínas. Anticuerpos marcados con pequeñas partículas de oro en el rango nanométrico se han utilizado ampliamente para mapear la localización de moléculas individuales. Dado que la partícula de oro generalmente se une a un anticuerpo secundario, aparecerá dentro de una circunferencia de aproximadamente 20 nm alrededor del epítopo detectado por el anticuerpo primario. En las muestras post incrustación, los anticuerpos sólo pueden detectar los epítopos que están expuestos en la superficie de las secciones. Si bien es posible demostrar la presencia de un antígeno y relacionarlo con una cierta estructura anatómica de la célula, la información que se obtiene es incompleta, ya que la mayoría de los epítopos están oscurecidos por la resina. Técnicas, que utilizan protocolos similares a los utilizados para la microscopía de fluorescencia Pre-incrustación, permitir el acceso a los antígenos a lo largotoda la profundidad de la muestra pero los pasos de permeabilización que se requieren para permitir que el anticuerpo para penetrar en la célula típicamente requieren la eliminación de las membranas lipídicas y eliminar componentes que no pueden ser corregidos por aldehídos. Por otra parte, el fijador aldehído preferido para la preservación ultraestructura, glutaraldehído, comúnmente destruye epítopos y, en consecuencia, paraformaldehído se requiere típicamente. Esto es menos efectivo en la reticulación proteína-proteína. Otra desventaja de los anticuerpos que se etiqueta con una nanopartícula de oro es que el oro es un material muy denso en electrones que crea un fuerte contraste que puede oscurecer los detalles estructurales interesantes de la muestra, que tiene más débil contraste. La aparición de la proteína verde fluorescente (GFP) como una etiqueta proteína expresada ha transformado el uso de microscopía de fluorescencia para responder a preguntas de la biología celular. Etiquetado de una proteína con un pequeño dominio fluorescente permite el mapeo de su distribución in vivo </em&gt; sin la necesidad de procedimientos de permeabilización que pueden alterar la estructura. Con el fin de traducir el principio elegante de la utilización de etiquetas de proteínas para mapear las distribuciones de proteínas en una célula de Microscopía Electrónica, se necesitaba un sistema que es capaz de producir una señal de cerca de la estructura de interés y generar contraste en el TEM. Diaminobencidina polimerizado es una mancha que se utiliza a menudo en la histología para detectar la unión del anticuerpo. Esta mancha se deposita normalmente utilizando peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugada con un anticuerpo secundario. Aunque la reacción produce un resultado fiable, HRP no es catalíticamente activo en el citosol de las células 9. Los productos de reacción de HRP pueden también difunden lejos del lugar de generación de modo que su resolución es peor que el método Nanogold 10. Con el fin de evitar estos problemas, el sistema / ReAsH FLASH fue desarrollado 11. Se compone de proteínas de fusión recombinantes que poseen un motivo tetracisteína. Este motivo permite la unión deun fluoróforo biarsenic. Cuando excitado, el flash consolidado o ReAsH es capaz de generar el oxígeno atómico altamente reactivo y diaminobencidina tanto photoconvert (DAB) en un polímero que precipita inmediatamente en el lugar de las proteínas etiquetadas. El polímero DAB se puede teñir con tetróxido de osmio, que es denso en electrones y por lo tanto se puede utilizar para mapear la distribución de la proteína de fusión recombinante en el TEM. En 2011, Shu et al. 10 presentó el sistema miniSOG, que consiste en una pequeña 106 amino ácidos etiqueta de fusión derivada de una flavoproteína de Arabidopsis que es fluorescente y capaz de crear muchos radicales de oxígeno singlete cuando se excita con luz azul 448 nm. Estos radicales de oxígeno singlete se pueden utilizar para diaminobencidina foto-oxidar para formar polímeros en y cerca de la superficie de la proteína etiquetada, que es considerablemente más estrecha que los anticuerpos marcados inmunoelectrónica 11. Mientras que el sistema de flash / ReAsH requiere llevar el flúorcromo y la diaminobenzidina en las células antes de hacer la fotoconversión, el sistema miniSOG sólo requiere diaminobencidina y la luz y, además, es dos veces más eficaz en la polimerización de diaminobencidina. Aquí, miniSOG se emplea en combinación con ESI con el fin de mapear la ultraestructura de focos de reparación del ADN. Focos de reparación del ADN (DRF) ADN no reparado doble filamento se rompe representan una seria amenaza para la célula, ya que pueden dar lugar a translocaciones y pérdida de información genética. A su vez, esto puede conducir a la senescencia, el cáncer y la muerte celular. Muchas proteínas que están implicadas en la reparación de ADN de doble filamento romper acumulan en los focos que reunir en torno a una doble cadena de ADN romper 12-14. Aunque su función no se conoce, que representan el sitio en el núcleo que contiene el ADN de doble capítulo romper y es el sitio de ADN de doble hebra de romper la reparación. Foc reparación del ADNi (DRF) se han caracterizado por microscopía de fluorescencia y servir como biomarcadores de daño en el ADN 12,15. Ellos son enormes en relación con el tamaño de la rotura de doble cadena y se consideraron relativamente homogénea hasta que los estudios de microscopía de super-resolución recientes revelaron algunas pruebas de sub-compartimentación de moléculas en cada enfoque 16. Con el fin de entender cómo se organizan estos sitios, es necesario para visualizar todas las estructuras biológicos subyacentes respecto a la otra. Esto no se puede lograr mediante microscopía de fluorescencia, pero es posible a través de microscopía electrónica 17,18. Aquí, se describe un método que combina imágenes espectroscópicas de electrones con el método miniSOG para ilustrar el potencial de este enfoque combinado para explorar la ultraestructura de reparación del ADN de doble filamento romper.

<table><tbody><tr><td>Platos con fondo de cristal de 35 mm</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Platos con fondo de cristal de 35 mm cuadriculados</td><td>MatTek</td><td>P35G-2-14-CGRD&nbsp;</td><td>No está hecho para objetivos de inmersión</td></tr><tr><td>LR Blanco: resina acrílica</td><td>emsdiasum</td><td>14381</td><td></td></tr><tr><td>LR Blanco acelerador</td><td>emsdiasum</td><td>14385</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;-Diaminobencidina tetraclorhidrato 10 mg comprimidos Sigma</td><td></td><td>D5905</td><td></td></tr><tr><td>Slim Bar Grids 300 Mesh</td><td>SPI</td><td>1161123</td><td></td></tr><tr><td>Pluma de laboratorio con punta de tungsteno</td><td>emsdiasum</td><td>41148</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de osmio</td><td>emsdiasum</td><td>19100</td><td></td></tr><tr><td>Carbon Coater 208 carbono</td><td>Cressington</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra micrótomo Leica EM UC6</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CS5</td><td>Adobe</td><td></td><td>podría incluso trabajar con versiones anteriores</td></tr><tr><td>Micrograph Digital V.2.30</td><td>Gatan</td><td></td><td>podría incluso trabajar con versiones anteriores</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma</td><td>H-1399</td><td></td></tr><tr><td>Effectene</td><td>Quiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miniSOG-Constructs</td><td>Tsien-Lab</td><td></td><td><a href="mailto:tsienlab@yahoo.com">tsienlab@yahoo.com</a></td></tr><tr><td>MDC1 miniSOG mCherry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>53BP1 miniSOG mCherry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rad52 miniSOG mCherry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cesio 137 fuente de radiación "MARCOS 1"</td><td>&nbsp;( J.L. Shepherd & Asociado)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ/FiJi</td><td>de código</td><td></td> abierto <td>http://fiji.sc/Fiji</td></tr><tr><td>tubos Eppendorf de 2 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>05-408-146</td><td></td></tr><tr><td>Cuchillo de diamante ultra 35&deg;</td><td>Cuchillo</td> de corte Diatome <td></td><td></td></tr><tr><td>ultratrim</td><td>Diatome</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cacodilato de sodio trihidrato</td><td>emsdiasum</td><td>12300</td><td>Precaución ¡Tóxico!</td></tr><tr><td>Glutaraldehído EM Grado 8%</td><td>emsdiasum</td><td>16020</td><td>Precaución ¡Tóxico!</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico</td><td>emsdiasum</td><td>21180</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico</td><td>emsdiasum</td><td>21190</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>emsdiasum</td><td>19202</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de osmio solución al 4%</td><td>emsdiasum</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia invertida Axiovert 200M</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido</td> <td>clorhídricoFisherbrand</td><td>A142-212</td><td></td></tr><tr><td>Solución de hidróxido de sodio 10M</td><td>Fluka</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>Oxígeno</td><td>Medigas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-amino-1,2,4-triazol</td><td>Sigma</td><td>A8056</td><td></td></tr><tr><td>cianuro de potasio</td><td>Sigma</td><td>207810</td><td>Precaución ¡Tóxico!</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>emsdiasum</td><td>15058</td><td>Precaución ¡Tóxico!</td></tr><tr><td>Hoja de afeitar de un solo filo de acero al carbono</td><td>emsdiasum</td><td>71960</td><td>Precaución ¡Afilado!</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D 5546</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Life Technologies</td><td>11811-023</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Electrónico de Transmisión 200 kV</td><td>JEOL</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>GIF Tridiem 863 Filtro de energía</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualización de minisog tagged proteínas de reparación de adn en combinación con electron espectroscópico imaging (esi)

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

Los límites a la resolución óptica y el reto de identificar poblaciones específicas de proteína en microscopía electrónica de transmisión han sido obstáculos en la biología celular. Muchos fenómenos no se pueden explicar mediante análisis in vitro en los sistemas simplificados y necesitan información estructural adicional in situ, en particular en el rango entre 1 nm y 0,1 m, con el fin de ser plenamente comprendido. Aquí, imágenes espectroscópicas de electrones, una técnica de microscopía electrónica de transmisión que permite el mapeo simultáneo de la distribución de las proteínas y ácidos nucleicos, y una etiqueta de expresión, miniSOG, se combinan para estudiar la estructura y organización de ADN de doble hebra focos romper la reparación.

ESI Comparando las imágenes ESI del núcleo (Figura 1) con las imágenes de TEM convencionales (por ejemplo, la Figura 7-1) revela un aumento dramático en las estructuras anatómicas que pueden ser fácilmente distinguido. Las crestas de la cromatina aparecen en amarillo y es muy fácil de identificar las chromocenters en células de ratón. Nucleolos se puede distinguir fácilmente de la cromatina por su estructura redonda y color...

Las imágenes espectroscópicas electrónicas pueden obtener imágenes y distinguir el ácido nucleico de la proteína con una resolución nanométrica. Se puede combinar con el sistema miniSOG, que es capaz de etiquetar específicamente proteínas marcadas en muestras de microscopía electrónica de transmisión. Ilustramos el uso de estas tecnologías utilizando como ejemplo los focos de reparación de roturas de doble cadena.

Visualización de miniSOG Tagged proteínas de reparación de ADN en combinación con Electron espectroscópico Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

El objetivo general del siguiente experimento es mapear la distribución de las proteínas de reparación del ADN alrededor de roturas en doble cadena del ADN a escala nanométrica. Con el fin de estudiar la ultraestructura de la cromatina dañada que está siendo reparada mediante imágenes espectroscópicas electrónicas. Esto se logra generando constructos de expresión de ADN que codifican proteínas de fusión de proteínas de respuesta al daño del ADN utilizando una proteína fluorescente y la etiqueta mini SOG.Como segundo paso, los constructos se introducen en las células mediante transfección, y luego las células se dañan mediante irradiación con láser o con rayos gamma. A continuación, las células irradiadas y fijadas pasan por los pasos de preparación para microscopía electrónica con el fin de hacer visible en el microscopio electrónico la distribución de la proteína de reparación marcada con mini SOG. La imagen espectroscópica electrónica resultante proporciona imágenes detalladas que permiten el análisis de la ultraestructura de la cromatina y la relación de proteínas específicas con los focos de reparación del ADN.La principal ventaja de esta tecnología frente a otras tecnologías existentes como la marcación con inmunogold es que no depende de la disponibilidad de anticuerpos y que marca de forma bastante densa las estructuras de interés. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a que la fotooxidación es muy sensible al pH, a la intensidad de la luz y a la saturación de oxígeno. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de fotooxidación, saturación de oxígeno e iluminación son sensibles a cambios muy pequeños, por lo que es importante ilustrar cómo se realiza el método para poder reproducirlo.El Dr. Hilmar Fadden, un posdoctorado en mi laboratorio, le demostrará el método para el cultivo. Células de osteosarcoma humano que expresan establemente las proteínas de reparación marcadas con mini SOG y M cherry, tal como se describe en el protocolo de texto adjunto. Después de dividir las células procedentes de una placa de 10 centímetros, cultive las células hasta alcanzar una confluencia del 80%.A continuación, coloque las células bajo un microscopio de fluorescencia y utilice un lápiz estéril de diamante para delinear un área pequeña de aproximadamente un milímetro cuadrado que contenga células que expresan las proteínas ectópicas; una vez marcadas, sensibilice las células añadiendo herx a la solución para que la concentración final sea de 0,5 microgramos por mililitro, y luego colóquelas en el incubador a 37 grados Celsius durante 20 minutos. A continuación, irradie las células con microirradiación láser utilizando el láser de estado sólido de 405 nanómetros de un microscopio confocal con el fin de inducir daño en el ADN; tras el daño en el ADN, fije las células en la oscuridad usando un mililitro de paraformaldehído al 4 % en tampón de citato de sodio 0,1 molar a temperatura ambiente después de 30 minutos.Lave las células dos veces con cuatro mililitros de tampón de Cate de sodio 0,1 molar a un pH de 7,4. A continuación, trate las células fijadas con dos mililitros de una solución que contiene 50 milimolar de glicina, cinco milimolar de amino triazol y 10 milimolar de cianuro de potasio a un pH de 7,4 durante 30 minutos. Reemplace el tampón con dos mililitros de tampón de fotooxidación a un pH de 7,4, que se preparó según se describe en el protocolo de texto adjunto.Luego, incube la muestra a oscuras sobre hielo mientras se burbujea oxígeno en la solución para mantenerla saturada de oxígeno. A continuación, monte cuidadosamente la placa con las células fijadas sobre un microscopio de fluorescencia invertido equipado con un objetivo de inmersión en aceite de 40 x y muévala al área de interés que se delimitó previamente. Excite la etiqueta mini SOG con luz azul utilizando cubos de filtro para la proteína verde fluorescente.Continúe con la iluminación incluso después de que la fluorescencia verde del mini SOG haya desaparecido por completo y hasta que el producto marrón de fotooxidación del diaaminobencidina polimerizado aparezca en el canal de luz transmitida. Luego, postfije las células con un mililitro de glutaraldehído al 2% en tampón de citato sódico 0,1 molar, pH 7,4, durante 30 minutos.A continuación, fije las membranas celulares con tetróxido de osmio al 0,1-0,5 % en tampón de catecolato de sodio 0,1 molar durante 20 minutos a pH 7,4. Una vez fijadas, deshidrate las células mediante una serie de lavados con etanol. Luego, incube las células en una mezcla uno a uno de etanol al 100 % y resina acrílica en agitador durante cuatro horas.A continuación, retire la mezcla y agregue resina acrílica al 100 % a las muestras durante cuatro horas adicionales. Para polimerizar la resina, corte la tapa de un tubo microcentrífugo de dos mililitros etiquetado con una cuchilla de afeitar y cubra el borde con acelerador de resina acrílica. Llene cuidadosamente el tubo aproximadamente hasta dos tercios de su capacidad con resina LR white utilizando una pipeta Pasteur.Tenga cuidado de que la resina no entre en contacto con el acelerador en el borde. Retire la resina que ha infiltrado las celdas del platillo y coloque el platillo boca abajo sobre el tubo de microcentrífuga colocado en posición vertical, de modo que el ancho del tubo llene casi por completo la ventana de observación cubierta con vidrio del peso del platillo. Deje de uno a dos minutos para que el acelerador selle el tubo y la cubeta.Luego invierta el tubo para que la resina en el tubo cubra ahora las células. Coloque el recipiente con el tubo en un horno a 60 grados Celsius y polimerice durante 12 horas. Cuando el bloque esté polimerizado, retire el recipiente con el tubo de microcentrífuga lleno de resina del horno y separe el tubo de microcentrífuga del recipiente.Deseche el recipiente con fondo de vidrio y corte cuidadosamente el tubo de microcentrífuga con una cuchilla de afeitar para liberar el bloque. Con una cuchilla de afeitar, recorte el bloque de modo que solo permanezca la región de un milímetro cuadrado que contiene el área marcada previamente con el lápiz de diamante o de tungsteno. A continuación, monte el bloque en un ultramicrotomo y recórtelo con una cuchilla de desbaste hasta acercarse a las células.Luego cambie a un cuchillo de diamante y corte secciones ultradelgadas de aproximadamente 50 nanómetros a través de las células. Recoga las secciones sobre rejillas de alta transmisión de 300 mallas. A continuación, coloque las rejillas en un revestidor de carbono y recubra las secciones con alrededor de 0,2 a 0,4 nanómetros de carbono para ayudar a estabilizarlas bajo el haz de electrones del microscopio electrónico de transmisión.Cargue las rejillas en un microscopio electrónico de transmisión equipado con un filtro de energía. Inspeccione las células en las secciones utilizando el modo de transmisión normal con baja magnificación y compárelas con las imágenes de fluorescencia tomadas anteriormente. Una vez que se encuentre un núcleo con una trayectoria de daño en el ADN o focos de reparación del ADN, cambie al modo de filtrado de energía y registre la muestra con un mapa de espesor.A continuación, registre las imágenes del mapa de fósforo tras el borde a una pérdida de energía electrónica de 175 con un ancho de rendija de 20 electronvoltios. También registre imágenes previas al borde a una pérdida de energía de 120 electronvoltios, asimismo con un ancho de rendija de 20 electronvoltios para el registro de los mapas de nitrógeno. Imágenes tras el borde a 447 electronvoltios con un ancho de rendija de 35 electronvoltios e imágenes previas al borde a 358 electronvoltios.También con un ancho de rendija de 35 electrones voltios. Abra los mapas de relación elemental en un software de procesamiento de imágenes como este. Copie el mapa de nitrógeno en el canal rojo y el mapa de fósforo en el canal verde de una imagen RGB.Luego superponga y alinee los mapas. Exporte la imagen compuesta como un archivo en formato de archivo de imagen etiquetado y, a continuación, abra la imagen en un software de procesamiento de imágenes que pueda utilizar capas. A continuación, ajuste el rango dinámico de cada canal reescalando los valores mínimo y máximo de la imagen a un conjunto de datos de ocho bits.Luego reste el contenido de fósforo del mapa de nitrógeno dentro de la ventana de capas. Convierta la imagen a un color indexado y cree una tabla de búsqueda amarilla en el espacio de color CMYK para el mapa que muestra la distribución de ácidos nucleicos y una tabla de búsqueda cian para mostrar el mapa de proteínas no cromatínicas. A continuación, cree una imagen nueva e importe los mapas que muestran las distribuciones de fósforo y proteína no cromatínica como capas diferentes.Utilice el modo de transparencia de pantalla para ver ambas capas superpuestas una sobre la otra. Aquí se muestran mapas de relación espectroscópica de electrones desde el interior de un núcleo celular, que indican las ubicaciones de fósforo y nitrógeno cuando los dos mapas de relación se superponen entre sí en el espacio de color RGB. Se obtiene una imagen como la mostrada aquí en esta imagen.Las estructuras amarillas representan proteínas nucleares que reflejan la presencia de fósforo y nitrógeno. Aquí, la imagen espectroscópica de electrones se utiliza para observar los cambios en la estructura de los focos tras la irradiación gamma en células U2 OS. En la fila superior, las imágenes de células que expresan establemente proteínas de reparación marcadas con M cherry corresponden a células que no fueron irradiadas.La segunda fila muestra células que fueron fijadas tres horas después de la radiación. La tercera fila muestra células fijadas seis horas después de la radiación. La imagen espectroscópica de electrones revela que la estructura de los focos parece reorganizarse con el tiempo, ya que la cantidad relativa de la proteína 53BP1 en el foco, indicada por el aumento de la señal de nitrógeno, parece incrementarse, mientras que la cromatina, indicada por la señal de fósforo, adopta una posición más periférica.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar células irradiadas que expresan proteínas mini so reparadoras para analizar la ultraestructura de la cromatina en focos de reparación de DA mediante imágenes espectroscópicas electrónicas. No olvide que trabajar con tampón de cianuro de potasio y óxido de osmio puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como trabajar en una campana extractora y usar guantes, durante la realización de este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Se presenta un procedimiento por el cual puede ser de dos dimensiones de agarosa-gel de análisis para identificar la estructura de los intermediarios de replicación que se producen después de la irradiación UV.

Visualización de intermediarios de replicación inducidos por UV en E. coli Con dos dimensiones-gel de agarosa Análisis

En este video, describimos el método de inmunofluorescencia para visualizar la localización de las proteínas de reparación del ADN γH2AX y 53BP1 en los sitios de roturas de ADN de doble cadena en núcleos celulares irradiados.

Visualización basada en inmunofluorescencia de las interacciones de las proteínas de reparación del ADN

Aquí, se demuestra el estudio de diferentes enfoques de reconocimiento de lesiones de ADN a través de imágenes AFM de una sola molécula con el sistema de reparación de escisión de nucleótidos como ejemplo. Se describen los procedimientos de preparación de muestras de ADN y proteínas, así como los detalles experimentales y analíticos de los experimentos de AFM.

Investigaciones de Microscopía de Fuerza Atómica de Reconocimiento de Lesión de ADN en Reparación de Excisión de Nucleótidos

Aquí se demuestra cómo se puede usar el Ensayo de Ligación de Proximidad in situ (PLA) para detectar y visualizar las interacciones directas proteína-proteína entre ATM y p53 en cultivos de células en suspensión expuestos al estrés genotóxico.

Detección y visualización de los complejos de proteínas inducidos por daño de ADN en cultivos de células en suspensión usando el ensayo de ligación de proximidad

Microirradiation láser es una herramienta útil para estudios de reparación del ADN en las células vivas. Se muestra un enfoque metodológico para el uso de láseres de rayos UVA para inducir varias lesiones del ADN. Hemos optimizado un método para microirradiation local que mantiene el ciclo normal de la célula; así, las células irradiadas proceden a través de mitosis.

Avanzadas técnicas de Microscopía Confocal para estudiar las interacciones proteína-proteína y cinética en las lesiones del ADN

Estudiar la cinética de reparación de daños de ADN requiere un sistema para inducir lesiones en regiones definidas del nucleares. Se describe un método para crear localizados roturas de doble cadena utilizando un microscopio confocal de escaneo láser equipado con un 405 nm láser y procedimientos automatizados para cuantificar la dinámica de los factores de reparación de estas lesiones.

Investigación de reclutamiento de la proteína a las lesiones del ADN usando 405 Nm láser Micro-irradiación

Reparación de roturas del DNA de doble cadena es un proceso dinámico, que requiere no sólo la formación de complejos de reparación en los descansos, pero también su resolución después de la lesión se trata. Aquí, utilizamos microscopia de la inmunofluorescencia para roturas de doble hebra transitorias y duradera como una herramienta para diseccionar este mecanismo de mantenimiento del genoma.

Caracterización de procesos de reparación del ADN en transitoria y duradera doble cadena DNA roturas por microscopia de la inmunofluorescencia

Después del daño del ADN, las células humanas activan vías de reparación esenciales para restaurar la integridad de su genoma. Aquí, describimos el método de inmunofluorescencia indirecta como un medio para detectar proteínas de reparación del ADN, analizar su reclutamiento espacial y temporal, y ayudar a interrogar la interacción proteína-proteína en los sitios de daño del ADN.

Visualización de la interacción de proteínas de reparación del ADN por inmunofluorescencia

Este artículo introduce pasos esenciales de immunostaining y de la inmunoprecipitación de la cromatina. Estos protocolos se utilizan comúnmente para estudiar los procesos celulares relacionados con el daño del ADN y para visualizar y cuantificar el reclutamiento de proteínas implicadas en la reparación del ADN.

Visualización Y Cuantificación De La Endonucleasa Basada En El Daño Específico Del ADN Específico Del Sitio

El presente protocolo describe métodos para evaluar las proteínas de reparación del daño del ADN en organoides de cáncer de ovario derivados de pacientes. Aquí se incluyen métodos integrales de recubrimiento y tinción, así como procedimientos de cuantificación detallados y objetivos.

Visualización de proteínas de reparación del daño del ADN en organoides de cáncer de ovario derivados de pacientes a través de ensayos de inmunofluorescencia

El siguiente protocolo presenta la detección de focos de ADN monocatenario en la fase G1 del ciclo celular utilizando la sincronización del ciclo celular seguida de la tinción inmunofluorescente de RPA2.

Visualización de focos de ADN monocatenario en la fase G1 del ciclo celular

Aprende a visualizar proteínas de reparación de ADN marcadas con miniSOG mediante imagen espectroscópica de electrones. Este método permite analizar la ultraestructura de la cromatina dañada con resolución nanométrica.

Visualización de miniSOG Tagged proteínas de reparación de ADN en combinación con Electron espectroscópico Imaging (ESI)

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