Generación de Scalable, metálico de alta Aspect Ratio nanocompuestos en una Biológica Medio Líquido

El objetivo general de este procedimiento es generar compuestos micro y nano lineales con alta relación de aspecto, utilizando materiales de partida que contienen cobre y cisteína. Esto se logra primero combinando nanopartículas de cobre sometidas a sonicación o sulfato de cobre con cistina y agua en un matraz de cultivo estéril con ventilación. El segundo paso de la síntesis consiste en colocar los componentes combinados en el matraz dentro de una incubadora con 5 % CO₂ a 37 grados Celsius durante al menos seis horas.

A continuación, el matraz se inspecciona visualmente y mediante microscopía de luz blanca. Para determinar el grado de formación de estructuras lineales, el paso final consiste en detener la síntesis colocando el matraz de síntesis en un refrigerador mantenido a cuatro grados Celsius. Finalmente, se utiliza microscopía digital para caracterizar las estructuras sintetizadas. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la colocación de electrodos es que la síntesis descrita puede escalarse fácilmente en forma líquida y el proceso ocurre en condiciones fisiológicas.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia o el diagnóstico de enfermedades como el cáncer, ya que las estructuras sintetizadas pueden ser degradadas por las células, lo que potencialmente proporciona un medio para la administración de fármacos. Tuve la idea inicial de este método cuando estábamos realizando experimentos para investigar la toxicidad potencial de diferentes nanomateriales. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos finales de la síntesis pueden ser difíciles de aprender.

Procedimientos incorrectos pueden resultar en estructuras agregadas o en ausencia total de estructuras. Para realizar la síntesis por autoensamblaje utilizando nanopartículas de cobre o CMPs, prepare una solución de nanopartículas de cobre pesando al menos dos miligramos de CMPs. Use guantes desechables durante este paso para evitar el posible contacto de los CMPs con la piel.

Coloque las nanopartículas en un vial de vidrio estéril vacío de 16 mililitros junto con el vial que contiene los CMP. Añada agua desionizada estéril en el volumen apropiado para preparar una solución de dos miligramos por mililitro y agite la solución en vórtex durante 20 segundos para lograr la dispersión de las nanopartículas antes de iniciar la síntesis. No llene el vial más de la mitad con agua, ya que esto inhibiría el proceso.

Al mezclar mediante vortex, los CMP se sedimentarán rápidamente en el fondo del vial y tendrán un color oscuro. Somete la solución de CNP a sonicación durante 17 minutos a temperatura ambiente para lograr una dispersión máxima de los CMP antes del inicio de la síntesis. Verifica periódicamente que los CMP se estén mezclando debido a la sonicación; tras una sonicación exitosa, los CMP permanecerán en suspensión en la solución durante al menos 30 minutos, y la solución tendrá un color oscuro.

Pese 7,29 miligramos de cistina para la síntesis. Dado que la cistina no es directamente soluble en agua, coloque la cistina en un recipiente de pesaje antiestático, dentro del recipiente que contiene cisteína. Añada un volumen suficiente de hidróxido de sodio estéril 1 molar para que la cistina se disuelva completamente y se obtenga una solución de 72,9 miligramos por mililitro.

Disuelva completamente la cisteína en 100 microlitros de hidróxido de sodio uno molar. Luego, combine siete microlitros de la cisteína disuelta con 6.643 microlitros de agua estéril en un matraz estéril para síntesis. Coloque el matraz con la solución combinada en el incubador durante 30 minutos a 37 grados Celsius con la tapa del matraz ventilada para lograr una mezcla eficaz.

Esta será la solución de trabajo de cisteína. Re-suspender la solución de CNP de dos miligramos por mililitro mediante vortex durante 30 segundos, ya que los CMP se habrán sedimentado después del paso de sonicación para un volumen total de síntesis de siete mililitros. Transferir la solución de trabajo de cisteína a un frasco de cultivo celular de 25 centímetros cuadrados y añadir 350 microlitros de CMP re-suspendidos.

Sustituya la tapa del matraz y ajústela de forma segura. Después de combinar todos los componentes para la síntesis, mezcle suavemente en el matraz agitándolo de cuatro a cinco veces. Coloque el matraz en el incubador de dióxido de carbono y ventile el matraz aflojando la tapa para permitir el intercambio de gases dentro y fuera del matraz.

Durante la síntesis, deje que la reacción continúe en el incubador durante aproximadamente 24 horas. Durante este proceso, se puede observar mediante microscopía y a simple vista la formación de compuestos altamente lineales. Este paso es fundamental para asegurar que se estén formando algunas estructuras y que el proceso de autoensamblaje no continúe demasiado tiempo.

Finalice la síntesis de los biocompuestos una vez que se observen estructuras lineales en el matraz, cerrando herméticamente el frasco de síntesis, y etiquete el frasco con las condiciones de síntesis, incluyendo la fecha utilizada para la síntesis y la incubación, así como la duración de la síntesis antes de su interrupción. Luego, almacene el recipiente en un refrigerador una vez que las estructuras generadas permanezcan estables en esta forma durante al menos un año. Alternativamente, para realizar la síntesis por autoensamblaje utilizando sulfato de cobre, sustituya los CMP por sal de sulfato de cobre empleando técnica estéril, y disuelva al menos dos miligramos de sulfato de cobre en un volumen suficiente de agua desionizada estéril para obtener una solución de dos miligramos por mililitro.

Los cristales de sulfato de cobre se disuelven fácilmente a esta concentración, pero agite el vial mediante vortex si es necesario e inspeccione visualmente para asegurarse de que todos los cristales se hayan disuelto tras la preparación del sulfato de cobre. Realice la síntesis como se acaba de demostrar, pero sustituya los CMP por el sulfato de cobre. Caracterice los biocompuestos derivados de los CMP y del sulfato de cobre mediante microscopía de luz blanca y microscopía electrónica para la caracterización e inspección de los biocompuestos.

La parasíntesis mediante microscopía de luz blanca utiliza un microscopio invertido. Los compuestos se asentarán sobre la superficie inferior del matraz en cuestión de minutos después de colocar el matraz en posición horizontal, y luego podrán enfocarse. Utilice el ajuste de campo claro en el microscopio para maximizar el contraste entre los biocompuestos y el medio líquido. Los compuestos derivados de CMP y sulfato de cobre aparecerán de color transparente a opaco, mientras que los agregados de CNP no reaccionados aparecerán de color muy oscuro.

Utilice microscopía invertida de luz blanca para evaluar la eficacia de la síntesis en un experimento determinado. Por ejemplo, documente la presencia o ausencia de CMP no reactivos en la síntesis. Frascos utilizados para biocompuestos derivados de CNP a partir de frascos con diferentes parámetros, como tiempo de incubación o duración de la sonicación.

Los CMP individuales son demasiado pequeños para observarlos con un microscopio óptico, pero los agregados de CNP no reactivos aparecerán como objetos oscuros y de forma redonda. Esto contrasta con los compuestos de CNP sintetizados con éxito, que tendrán una alta relación de aspecto, forma lineal y una variedad de longitudes diferentes. Evite llevar a cabo la síntesis durante un período de tiempo demasiado prolongado antes de su terminación, ya que esto dará lugar a estructuras altamente ramificadas de tipo erizo, que son difíciles de dispersar en estructuras individuales una vez formadas.

Utilice también microscopía óptica invertida para evaluar la eficacia de la síntesis en un experimento determinado utilizando sulfato de cobre. Dado que el sulfato de cobre se disuelve completamente, al emplear este protocolo, la solución parecerá menos oscura que la solución obtenida mediante CMPs.

Documente el tamaño y extensión de los compuestos de sulfato de cobre mediante la comparación de matraces con distintas condiciones de síntesis, como el tiempo de síntesis antes de la terminación. Para concentrar primero los compuestos biológicos mediante parasíntesis, añada seis mililitros de estructuras derivadas de CNP o estructuras derivadas de sulfato de cobre a un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugue durante 10 minutos a 500 veces G y temperatura ambiente para formar un precipitado en volúmenes más pequeños.

Añada 500 microlitros de estructuras en solución a tubos de tamaño 0,6 mililitros, centrifugue a 2000 ×g y temperatura ambiente durante al menos 10 minutos para formar un precipitado. Coloque las estructuras en agua estéril desionizada y someta a ultrasonido durante al menos 10 minutos para resuspender. Con este proceso a lo largo del tiempo, las estructuras se fragmentan y su longitud media disminuye.

Documente los cambios en el tamaño de los compuestos con diferentes tiempos de sonicación utilizando un microscopio invertido de luz blanca y una cámara digital. Nuestros resultados representativos muestran que, tras el descubrimiento de biocompuestos en medio de cultivo celular durante 82 horas, las dispersiones iniciales uniformes de CMPs se agregan en microestructuras. Con el tiempo, las partículas se eliminan y se forman agregados más grandes. Finalmente, aparecen agregados más grandes con estructuras lineales, formando estructuras tipo erizo.

Se muestra la transformación de los CMP en biocompuestos lineales. Los CMP se combinaron con cisteína y agua a partir de dispersiones iniciales homogéneas de CMP. Los agregados forman microestructuras tras tres horas, y estructuras intermedias se forman a las seis horas.

Las estructuras de alta relación de aspecto formadas se analizan mediante microscopía electrónica. La caracterización de los biocompuestos sintetizados mediante microscopía electrónica de transmisión muestra las nanopartículas de celulosa (CNP) como material inicial, junto con los compuestos lineales formados a partir de los CMP, que son redondeados según se observa por microscopía electrónica de barrido o SEM. Las características nano y micro de los compuestos formados a partir de CMP y cisteína se muestran mediante SEM.

Las características de los compuestos formados a partir de sulfato de cobre y cisteína también se representan mediante microscopía electrónica de barrido y espectroscopía de rayos X por dispersión de energía. Se muestra el análisis elemental por espectroscopía de rayos X por dispersión de energía de los materiales de partida y de los componentes lineales sintetizados. Los CMP iniciales muestran un pico prominente de cobre sin azufre.

Los biocompuestos a partir de PCM y cistina muestran la aparición de picos de azufre y carbono debidos a la cistina a partir de sulfato de cobre. El material muestra picos para cobre y azufre. Los biocompuestos de sulfato de cobre y cistina muestran la aparición de picos de carbono debidos a la cistina. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 12 a 24 horas si se lleva a cabo adecuadamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar monitorear el progreso de la síntesis tanto a simple vista como mediante el microscopio, para que las estructuras sintetizadas no se vuelvan demasiado agregadas. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la marcación con fluorescencia de las estructuras, con el fin de responder preguntas adicionales, como si las estructuras sintetizadas se unen a las células. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar los reactivos para la síntesis, combinarlos correctamente, monitorear el progreso de la síntesis, y concentrar y modificar las estructuras tras la síntesis.