Name: La inducción directa de Hemogenic endotelio y la Sangre por la sobreexpresión de factores de transcripción en células madre pluripotentes Humanos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-03T10:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Aprende a inducir endotelio hemogénico y células sanguíneas a partir de células madre pluripotentes humanas mediante la sobreexpresión de factores de transcripción. Este método permite estudiar la transición endotelial a hematopoyética en un modelo in vitro controlado y eficiente.

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Agradecemos a Matt Raymond por su ayuda editorial. Este trabajo fue apoyado por fondos del Instituto Nacional de Salud (U01HL099773, R01HL116221 y P51 RR000167) y la Fundación Charlotte Geyer.

1. Virus Preparaciones y factor de transcripción Combinaciones <ol><li> Preparar soluciones con plásmido de expresión lentiviral pSIN-EF1α que contiene ADN que codifica la proteína para ETV2, GATA1, GATA2, TAL1 y LMO2 (Tabla 1). </li><li> Medir la concentración y pureza de las preparaciones de plásmido utilizado para la producción de lentiviral mediante el registro de la absorción UV con un espectrofotómetro a 230 nm, 260 nm, y 280 nm. Nota: preparaciones de ADN demuestran A260 / 280 y A260 / 230 valores superiores a 1,8 se consideran en general de buena calidad. 280 Los valores más bajos A260 / pueden indicar contaminación de proteínas, mientras que los valores más bajos A260 / 230 indican impurezas con sales o algún disolvente tal como fenol. Concentración de plásmido recomendada es de 1 a 3 mg / l. </li><li> Producir lentivirus para transducciones como se describe en los protocolos publicados previamente 11. La inducción de la SE con potencial de pan-mieloide requiere co-expresión de ETV2 y GATA1 o ETV2 y GATA2.La inducción de la SE con potencial de eritro- y megacariocítico requiere GATA2 y TAL1. La adición de LMO2 mejora significativamente el rendimiento de las células-eritro megacariocítica de hPSCs en presencia de GATA2 y TAL1 10. </li></ol> 2. Protocolo Cultura hPSCs <ol><li> Crecer células madre pluripotentes en colonias cerradas con bordes afilados para el 70-80% de confluencia antes de subcultivo. Mark y eliminar espontáneamente diferenciadas colonias antes de pases células. </li><li> Diluir gel de matriz extracelular comercial (véase la Tabla 2) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y las placas de capa de 6 pocillos durante la noche a 4 ° C, o durante al menos una hora a 37 ° C antes de su uso. Antes de pases células, aspirar la matriz, añadir 2 ml de culturemedium completa comercial fresco (ver Tabla 2) y mantener las placas a 37 ° C, 5% de CO 2 hasta que las células están listas para la siembra. </li><li> HPSCs Passage <ol><li> Aspirate medio de un pozo confluente de una placa de 6 pocillos con hPSCs y añadir 1,5 ml de la solución de pre-calentado dispasa II (2 mg / ml en DMEM / F12, se esteriliza por filtración a través de filtros de 0,22 micras). Incubar durante 5-7 min a 37 ° C, 5% de CO 2 hasta que los bordes de las colonias empiezan a levantar de la superficie. </li><li> Aspirar solución de dispasa II y cuidadosamente se lavan las colonias dos veces mediante la adición de aspiración y luego 2 ml de medio DMEM / F12 fresco. Luego, utilizando una pipeta de vidrio de 5 ml serológica, se disocian hPSCs con 3 ml de medio de cultivo completo fresco comercial (véase la Tabla 2) pipeteando la suspensión celular arriba y abajo varias veces. </li><li> Añadir 0,5 ml de suspensión celular a cada pocillo de una placa de 6 pocillos que contenía 1,5 ml de medio de cultivo completo comercial (véase la Tabla 2). Agite la placa de ida y vuelta y de derecha a izquierda varias veces para asegurar una distribución de células uniforme cuando situar la placa en la incubadora. Mantenga las células a 37 ° C, 5% de CO 2 por 108.24 h. </li><li> El siguiente cambio medio día al medio de cultivo completo comercial fresco (ver Tabla 2) y examinar hPSCs morfología. Resultados pases acertados en pequeñas colonias, así conectados a retención HPSC morfología. hPSCs deben ser alimentados con 2.5-3 ml freshmedium por pocillo sobre una base diaria y se pasaron cada 4-5 días en no más de un 70-80% de confluencia. NOTA: Si se mantuvieron hiPSCs en fibroblastos de embriones de ratón (MEFs), tienen que ser transferidos a condiciones de alimentación libre y pases 2-3 veces antes de transducción para asegurar la diferenciación eficiente. </li></ol></li></ol> 3. Inducción de Hematoendothelial Pprecursors de hPSCs (día 0, la transducción de hPSCs) <ol><li> Para preparar medio de reacción se combinan 1,3 ml de medio libre de suero completa comercial (ver Tabla 2), virus, polibreno, y Y27632 inhibidor ROCA (Tabla 1): añadir 1,3 l de inhibidor ROCA 10 mM a 1,3 ml de medio a una concentración final deción de 10 m, y polibreno a una concentración final de 6 mg / ml. <ol><li> Añadir una cantidad apropiada de concentrado viral (s) a una concentración final de 0,5 a 1,0 MOI (multiplicidad de infección) de cada virus por célula. Mantener medio de reacción en hielo oa 4 ° C hasta que la suspensión de una sola célula está listo. NOTA: La misma cantidad de MOI para cada virus en el GATA1 / ETV2, GATA2 / TAL1, y mezclas de GATA2 / TAL1 de reacción / LMO2 es óptimo para la inducción de la diferenciación. Culturas Sin embargo, en ETV2 / GATA2 transducidas duplicando MOI para GATA2, en relación con ETV2, aumenta la diferenciación. Se recomienda 2 para MOI de ETV2 y 1 MOI de GATA2 (por ejemplo, si concentrado viral se estima aproximadamente 6,8 x 10 7 partículas / ml, añadir 10 l de ETV2 y 20 l de GATA2 concentrados virales a: Por lo tanto, para estos cultivos, la relación de 1 0.68 x 10 6 células por una de las reacciones ETV2 / GATA2 en un pozo de 35 mm de una placa de 6 pocillos). </li></ol></li><li> Preparar hPSCs en una sola susp celularensión. <ol><li> Crecer hPSCs en condiciones libres de alimentador como se describe en la sección 2. El día 4 a partir del último paso, observar la densidad celular y la morfología bajo un microscopio invertido. hPSCs deben crecer en colonias apretados con bordes afilados sin diferenciación espontánea y llegar a ~ 60-70% de confluencia en el día de la transducción. </li><li> Aspirar medio, añadir 1.5-2 ml de reactivo comercial de disociación celular (Tabla 1) por pocillo e incubar a 37 ° C con 5% de CO 2 durante 5-7 min. </li><li> Recoger las células en volúmenes iguales de medio completo comercial (ver Tabla 2) con 10 M de inhibidor de ROCK, contar las células y determinar la viabilidad. Precipitar las células por centrifugación a 200 xg durante 5 min y luego se resuspenden las células en medio completo comercial con 10 M de inhibidor de ROCK una concentración de 3.4-5 x 10 6 células por ml. NOTA: La viabilidad celular es fundamental para la transducción viral exitosa y posterior diferenciación.Típicamente, la viabilidad celular antes de la transducción debe exceder de 90%. </li></ol></li><li> Añadir 200 l de la suspensión celular, que contiene 0.68-1 6 células x10, en 1,3 ml del medio de reacción preparada en 3.1. </li><li> Aspirar la solución de la matriz de la placa de 6 pocillos recubiertos noche preparado en 2.2., La transferencia de la mezcla de reacción a un pocillo de una placa de 6 pocillos y distribuir uniformemente las células. Incubar a 37 ° C con 5% de CO 2 durante 24 horas. Después de 24 horas a menos 80% de las células debe estar unido a la matriz. </li></ol> 4. Inducción de Hematoendothelial Precursores de hPSCs (día 1-7) <ol><li> 24 horas después de la transducción, eliminar el medio que contiene virus y lavar las células unidas con medio de cultivo celular incompleta comercial (véase la Tabla 1) y luego añadir 3 ml por pocillo de medio de cultivo celular incompleta comercial que contiene citoquinas hematopoyéticas: SCF 100 ng / ml, TPO 50 ng / ml, bFGF 20 ng / ml (en adelante como 3F-medio). </li><li> Reemplace medio total, con frescos 3F-medio en los días 2, 3 y 4 días para eliminar las células muertas y los desechos. Después del día 4, cuando están surgiendo células hematopoyéticas flotantes, reemplace la mitad del 3F-medio cada dos días, manteniendo el volumen total de 4 ml. NOTA: pSIN-EF1α plásmidos de expresión lentiviral incorporan gen de resistencia a puromicina permitiendo de este modo para la selección positiva de las células transducidas. El 1 mg / ml de puromicina se puede añadir al medio durante los primeros 1-2 días de diferenciación para eliminar los cualquier hPSCs indiferenciadas residuales. </li><li> Observar la morfología celular en el día 4 bajo un microscopio invertido: racimos apretados de células con morfología típica endotelial comienzan a aparecer (Figuras 2A, 3A). Células de la sangre de la Ronda aparece desde el día 5 al día 7 de diferenciación, mientras que algunas zonas pueden retener hPSCs morfología. Analizar HE y la diferenciación hematopoyética tal como se describe a continuación. NOTA: diferente hematoendothelial Exitosaiation resulta en la producción de células sanguíneas que aparecen células redondas como refráctiles débilmente unido a las células endoteliales planas subyacentes. Estas células proliferan activamente la formación de pequeños agregados, y, finalmente, separar y flotador (Figuras 2A y 3A). Glóbulos en directo se pueden distinguir visualmente de las células muertas y moribundas en función de su capacidad de reflejar la luz y ampliar en las condiciones de cultivo. </li></ol> 5. Análisis de Hemogenic endotelio (HE) etapa de diferenciación. <ol><li> Detectar la formación de HE entre los días 3 y 4 de la diferenciación por la observación microscópica de las células con morfología endotelial. No hay células de la sangre que flotan en el cultivo en esta etapa de diferenciación. La presencia de SE puede confirmarse mediante tinción de inmunofluorescencia y citometría de flujo análisis utilizando anticuerpos VE-cadherina, CD73, CD226 y CD43. <ol><li> Para evaluar la formación de HE by células utilizan el análisis de citometría de flujo en el día 3y 4 días de un experimento. Recoger las células por incubación de las culturas con el reactivo de disociación celular comercial (ver Tabla 1) durante 5-10 minutos a 37 ° C, 5% de CO 2 y luego usar hasta 1 x 10 5 células por reacción de tinción (citometría de flujo procedimiento de tinción se describe en 12). NOTA: VE-cadherina + HE células adquieren expresión de principios CD226 marcador hematopoyético, pero carecen de la expresión de CD73 y CD43 6. En contraste, las células no expresan CD73 HE (Figuras 2B, 3B). </li></ol></li><li> La tinción de inmunofluorescencia para derivados de HPSC HE. <ol><li> Lavar la monocapa adjunta de células con tampón fosfato salino (PBS) y luego fijar las células en paraformaldehído al 4% de 30 a 60 min a temperatura ambiente. </li><li> Lavar las células de nuevo con PBS y después se permeabilizan utilizando 0,1% de Triton X-100 en PBS durante 20 min a temperatura ambiente. </li><li> Lavar las células en PBS dos a tres veces y luego se incuban entampón de bloqueo que consiste en PBS con suero bovino fetal al 10% (FBS), por 30 a 120 min. </li><li> Preparar solución de tinción, que contiene ambos anticuerpos primarios (1: 1000 dilución) de ratón anti-CD43 humana y de conejo anti-humanos VE-cadherina en PBS con 5% de FBS, (Tabla 1). </li><li> Aspirar el tampón de bloqueo de las células y añadir 1 ml por pocillo de tampón de tinción con los anticuerpos primarios añadidos; incubar 3 horas a temperatura ambiente, o durante la noche a 4 ° C. </li><li> Se lavan las células tres veces mediante la adición de 2 ml de PBS con 5% de FBS. </li><li> Preparar un segundo tampón de tinción, que contiene anticuerpos secundarios en dilución 1: 500 en PBS con 5% de FBS: burro anti-conejo conjugado con colorante fluorescente verde, y anti-ratón conjugado con colorante fluorescente rojo (Tabla 1). Añadir 1 ml por pocillo de tampón de tinción secundaria y se incuba a temperatura ambiente durante 1 hr. </li><li> Lavar tres veces con PBS sin suero. Las células se tiñen con 300 nM DAPI solución de trabajo en DH2 O durante 10-15 min. </li><li> Lavar las células con PBS dos veces y añadir 2.3 ml de PBS en bien con células teñidas. Observar con filtros de fluorescencia de microscopio verde, rojo y azul. </li></ol></li></ol> 6. Análisis de Inducidos hematopoyéticas Precursores <ol><li> Mantener culturas de diferenciación hasta que las células flotantes se expanden significativamente, hasta 10-14 días, cambiando el medio de 3F-medio, como se describe en 3.1, cada dos días. </li><li> Se disocian y recoger la diferenciación de monocapas de células mediante el tratamiento de las células con un reactivo de disociación celular comercial (véase la Tabla 1) durante 5-10 min a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Realizar citometría de flujo utilizando anti-VE-cadherina, anticuerpos CD43 y CD45 para evaluar la hematopoyesis en las culturas 12. Tenga en cuenta que una gran parte de las células, hasta el 40% de las células ETV2 y GATA2 transducidas, co-expresa VE-cad y CD43. Los siguientes anticuerpos pueden utilizarse para detectar linajes celulares específicos siguientes eXpansion o la diferenciación de células progenitoras de sangre inducidos: CD235a (células eritroides), CD41a (megacariocítica), CD32 (todos los tipos de células mieloides), CD66b (neutrófilos) y CD163 (macrófagos). </li><li> Realizar CFC-ensayo utilizando un medio clonogénico comercial (Tabla 1) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. <ol><li> Traslado 1-2 x 10 4 células en 3 ml de medio clonogénica comercial (ver Tabla 3) para evaluar el número de células y tipos de colonias hematopoyéticas formadoras de colonias. Densidad óptima de siembra permite la identificación y el aislamiento de colonias individuales que crecen por separado unos de otros y no se solapan. Densidad de siembra puede variar entre los experimentos en función de la eficiencia de la diferenciación, pero no debe exceder de 1 x 10 4 células por 1 ml de medio clonogénico comercial. </li><li> Mezclar células en medio clonogénica comercial por agitación suave, y la transferencia de 3 ml de suspensión de dos 35 mm platos ultra-bajas de fijaciónpara el ensayo de CFC, 1,5 ml de la suspensión a cada plato. Distribuir uniformemente medio y se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 14 días. Evite molestar a los platos; observar la formación de colonias en el día 7 y el día 10 del ensayo. </li><li> Identificar y contar colonias hematopoyéticas según sus morfologías en el día 14. </li></ol></li></ol>

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</ol>

IS es accionista fundador y consultor de Cynata.

El método anteriormente descrito para la diferenciación hematopoyética de hPSCs por la sobreexpresión de TFS, representa un enfoque rápido y eficiente para la generación de HE y mieloides y erytho magakaryocytic progenitores de hESCs y CMPI, permitiendo así la producción de hasta 30 millones de células de sangre de un millón de células madre pluripotentes 10. Este método exhibió diferenciación consistente en múltiples células madre y iPSCs líneas 10. Durante la diferenciación por ETV2 y GATA2, fact...

La capacidad única de células madre pluripotentes humanas (hPSCs) para auto-renovarse y diferenciarse en células de las tres capas germinales, incluyendo sangre, que sean una herramienta valiosa para los estudios sobre el mecanismo de desarrollo hematopoyético, el modelado de enfermedades de la sangre, la detección de drogas, Los estudios de toxicidad y el desarrollo de terapias celulares. Debido a la formación de la sangre en los embriones producto de endotelio hemogenic (HE) a través de una transición hematopoyético endotelial 1,2, la generación de la ES en culturas sería esencial para estudiar los mecanismos moleculares que regulan la endotelial a la transición hematopoyético y especificación hematopoyético. Los métodos actuales para estudios de HE se basan en la inducción de la diferenciación hematoendothelial en los agregados (EBS) con la adición de citoquinas hematopoyéticas 3-5, y de cocultivo con células estromales hPSCs-hematopoyesis de apoyo 6,7 o en cultivos de dos dimensiones con extracelular matrices y moldes cytokines 8,9. Estos métodos de diferenciación clásicos se basan en la introducción de señales externas que actúan en la superficie celular y que inician cascadas de vías moleculares que eventualmente conducen a la activación de programa transcripcional guiar el desarrollo hematoendothelial. Por lo tanto, la eficiencia de hPSCs diferenciaciones en estos sistemas se basa en una inducción efectiva de esas señales, la transducción de señales al núcleo, y la activación resultante de reguladores transcripcionales específicos. Además, el estudio de HE en cultivos de diferenciación convencionales requiere la etapa adicional de aislamiento de células HE usando la clasificación de células. Aquí se describe un protocolo sencillo para la inducción directa de HE y sangre por la sobreexpresión de factores de transcripción hematopoyéticas. Este método permite la inducción eficiente de HE en un plato y la observación directa del endotelial a la transición hematopoyéticas sin la necesidad de aislamiento de HE utilizando un procedimiento de clasificación de células engorroso. Formación de SE y la sangre a partir de células madre pluripotentes humanas pueden ser inducidas de manera eficiente mediante la sobreexpresión a pocos factores de transcripción (TFS). La combinación óptima de TFS capaces de inducir robusta hematopoyesis-pan mieloide de hPSCs incluye ETV2 y GATA1 o GATA2. En contraste, la combinación de GATA2 y TAL1 induce erythromegakaryocytopoiesis 10. Programación hPSCs través de la sobreexpresión de estos factores que diferencia hPSCs directamente a la VE-cad + CD43 - CD73 - células HE que adquieren gradualmente el fenotipo hematopoyético definirse por la expresión de principios del CD43 marcador hematopoyético 7. Este método basado en lentiviral para la programación directa del método de pluripotentes células madre humana es aplicable para la generación de HE y las células de sangre para estudios mecanísticos, estudios de endotelial a la transición hematopoyético, y la regulación transcripcional de desarrollo hematopoyético y especificación. Aunque la current protocolo describe la producción de sangre usando la expresión constitutiva de los transgenes, resultados similares podrían obtenerse utilizando ARNm modificado 10.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Table 1. Inducción de la diferenciación de hPSCs con factores de transcripción y análisis de endotelio hemogénico y células sanguíneas.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro&nbsp;</td><td></td><td>Plásmido Addgene #61061</td><td>Vector lentiviral</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro&nbsp;</td><td></td><td>Plásmido Addgene #61063</td><td>Vector lentiviral</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro&nbsp;</td><td></td><td>Plásmido Addgene #61062</td><td>Vector lentiviral</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plásmido #61062</td><td>Vector lentiviral</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plásmido #61064</td><td>Vector lentiviral</td></tr><tr><td>Bromuro de hexadimetrina (polibreno)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689-10G</td><td>Polímero catiónico utilizado para aumentar la eficiencia de la infección</td></tr><tr><td>Y-27632 (diclorhidrato) Inhibidor de ROCK</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72302</td><td>Inhibidor de la vía RHO/ROCK Inhibe el</td></tr><tr><td>reactivo de disociación celular ROCK StemPro Accutase <</td><td>a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/ stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td><td>A11105-01</td><td>Reactivo</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> de disociación celular <tr><td>Medio de cultivo incompleto (sin factor de crecimiento)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; mTeSR1 Formulación personalizada&nbsp;</td><td>Instituto de Investigación WiCell (Madison, WI)</td><td>MCF</td><td><a name="¡RANGO! D12">Medio mTeSR1 sin suero sin bFGF y TGFb&nbsp; </a></td></tr><tr><td>humano SCF</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>TPO humano</td> de primera calidad <td>Peprotech</td><td>300-18</td><td>Humano de grado de investigación</td></tr><tr><td>FGF-básico</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Grado premium</td></tr><tr><td>CD144 (VE-CAD) FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>560411</td><td>Marcador endotelial (FACS)</td></tr><tr><td>CD226 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>338305</td><td>Hematopoyético ( FACS)</td></tr><tr><td>CD43 PE</td><td>BD Biociencias</td><td>560199</td><td>Hematopoyéticas (FACS)</td></tr><tr><td>CD73 APC</td><td>R& D Systems</td><td>FAB5795A</td><td>Marcador endotelial (FACS)</td></tr><tr><td>CD45 APC</td><td>BD Biosciences</td><td>555485</td><td>Hematopoyético (FACS)</td></tr><tr><td>7AAD</td><td>Life Technologies</td><td>A1310</td><td>Ensayo vivo/muerto (FACS)</td></tr><tr><td>Paraformaldehído&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td>Fijación de células&nbsp;</td></tr><tr><td>Tritón X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-500ML&nbsp;</td><td>Permeabilización&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3007003</td><td>Suero fetal bovino</td></tr><tr><td>Ratón anti-humano CD43</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>551457 Anticuerpo primario puro para la tinción de inmunofluorescencia (IF)</td></tr><tr><td>Conejo anti-humano VE-cadherina</td><td>BenderMedSystem</td><td>BMS158</td><td>Primario (IF)</td></tr><tr><td>Anti-conejo Alexa Fluor 488-conjugado</td><td>JacksonResearch</td><td>715-486-152</td><td>Secundario (IF)</td></tr><tr><td>Anti-ratón Alexa Fluor 594-conjugado</td><td>JacksonResearch</td><td>715-516-150&nbsp;</td><td>Secundaria (IF)</td></tr><tr><td>Tinción de ácido nucleico DAPI</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td><td>D1306&nbsp;</td><td>Ensayo vivo/muerto (IF)</td></tr><tr><td>Medio clonogénico MethoCult H4435 Tecnologías</td><td>de células madre</td> enriquecidas <td>4435</td><td>Ensayo de CFC</td></tr><tr><td>Solución de tinción de Wright</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>32857</td><td>Tinción de citospins</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Table 2. hPSCs culture.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Células Madre Pluripotentes Humanas (hPSCs)&nbsp;</td><td>Instituto de Investigación WiCell (Madison, WI)</td><td>Células madre embrionarias humanas hESCs (WA01, WA09); iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) Células madre pluripotentes inducidas sin transgenes Las</td><td>hPSCs son capaces de autorrenovarse y diferenciarse en células de tres capas germinales</td></tr><tr><td>Medio completo sin suero para el cultivo de hPSCs&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Medios mTeSR1&nbsp; &nbsp;</td><td>Instituto de Investigación WiCell (Madison, WI)</td><td>M500&nbsp;</td><td>Medio sin suero con factores de crecimiento para el cultivo de ESC/iPSC sin alimentador</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences/ Corning&nbsp;</td><td>356234</td><td>Matriz para el mantenimiento de ESC/iPSCs humanas</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, polvo&nbsp;</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td><td>12500-062</td><td>Medio basal&nbsp;</td></tr><tr><td>HyClone Dulbecco's PBS powder</td><td>Fisher Scientific</td><td>dSH30013.04</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Dispasa II, powder</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td><td>17105-041</td><td>Proteasa neutra, Disociación celular</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Table 3. Primers para la detección de la integración genómica del virus.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nombre del Primer</td><td><fuerte>Delantero (Fwd)&nbsp; 5' -->3' </fuerte></td><td><fuerte>Reverso (Rev) 5'->3' </fuerte></td><td><fuerte>Descripción&nbsp; </td></tr><tr><td>pSIN EF1a Fwd</td><td>TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA-</td><td>-</td><td>EF1a secuencia promotora</td></tr><tr><td>GATA1 Rev</td><td>--</td><td>TCC CTG TAG GCC AGT GC</td><td>&nbsp; Región de codificación&nbsp;</td></tr><tr><td>GATA2 Rev</td><td>--</td><td>GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG</td><td>&nbsp; Región de codificación&nbsp;</td></tr><tr><td>TAL1 Rev</td><td>--</td><td>AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT</td><td>&nbsp; Región de codificación&nbsp;</td></tr><tr><td>LMO2 Rev</td><td>--</td><td>GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC</td><td>&nbsp; Región de codificación&nbsp;</td></tr><tr><td>ETV2 Rev</td><td>--</td><td>GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC &nbsp;</td><td>&nbsp; Región de codificación&nbsp;</td></tr></tbody></table>

la inducción directa de hemogenic endotelio y la sangre por la sobreexpresión de factores de transcripción en células madre pluripotentes humanos

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

Durante el desarrollo, las células hematopoyéticas se derivan de un subconjunto especializado de las células endoteliales, el endotelio hemogenic (HE). HE desarrollo Modeling in vitro es esencial para estudios mecanísticos de la transición-endotelial hematopoyético y especificación hematopoyético. Aquí se describe un método para la inducción eficiente de SE a partir de células humanas pluripotenciales (hPSCs) mediante la sobreexpresión de diferentes conjuntos de factores de transcripción. La combinación de ETV2 y GATA1 o GATA2 TFS se utiliza para inducir HE con potencial de pan-mieloide, mientras que una combinación de factores de transcripción y GATA2 TAL1 permite la producción de HE con eritroide y megacariocítica potencial. La adición de LMO2 a GATA2 y la combinación TAL1 acelera sustancialmente la diferenciación y aumenta células eritroides y megacariocíticos producción. Este método proporciona un medio eficiente y rápida de HE inducción de hPSCs y permite la observación del endotelio hematopoietic transición en una placa de cultivo. El protocolo incluye procedimientos hPSCs transducción y análisis post-transducción de SE y progenitores de sangre.

El diagrama esquemático de HE y la inducción de sangre de hPSCs por la sobreexpresión de factores de transcripción se muestra en la Figura 1. ETV2 con la combinación GATA1 o GATA2 induce la hematopoyesis pan-mieloide, mientras que un GATA2, TAL1 +/- combinación LMO2 induce la hematopoyesis predominantemente eritro-megacariocítica. Ambas combinaciones TF directamente inducidos células el que posteriormente transforman en células progenitoras de sangre con un espectro diferente de diferenciación hematopoy...

Este protocolo describe la inducción eficiente de endotelio hemogénico y progenitores hematopoyéticos multipotenciales a partir de células madre pluripotentes humanas a través de la expresión forzada de factores de transcripción.

La inducción directa de Hemogenic endotelio y la Sangre por la sobreexpresión de factores de transcripción en células madre pluripotentes Humanos

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

El objetivo general de este procedimiento es generar células sanguíneas eritroides y mieloides a partir de células madre pluripotentes humanas mediante la expresión forzada de factores de transcripción. Este método es aplicable para la generación de endotelio homogénico en células sanguíneas para estudios sobre la transición endotelial a hepo y la regulación transcripcional del desarrollo y la especificación de hepo. La principal ventaja de esta técnica es que el método proporciona un medio ineficiente y rápido para la inducción de endotelio homogénico a partir de células madre humanas preport, y permite observar la transición hemmie endotelial en una placa de cultivo celular.La Dra. Bruske, asistente de investigación en el laboratorio de la Dra. Lin, demostrará el procedimiento. Antes de comenzar, recubra seis placas de pozo con una matriz extracelular como matrigel diluyéndola según las instrucciones del fabricante y vertiéndola en los pozos. Incube las placas durante 30 a 60 minutos a 37 grados Celsius para el medio de transducción. Primero, prepare alícuotas de lentivirus para cada conjunto de transducción de manera que la multiplicidad de infección estimada, o MOI, de virus a células sea de un virus por célula, y manténgalas a cuatro grados Celsius.A continuación, combine medio completo sin suero para virus hbsc poli cerebro hasta una concentración final de seis microgramos por mililitro y el inhibidor de ROCK Y 2 7 6 3 2 hasta una concentración final de 10 micromolares en un volumen total de 1,3 mililitros para cada conjunto de transducción, y coloque las mezclas en hielo para preparar las células. Comience con un lote saludable de células madre pluripotentes al 70 % de confluencia, aproximadamente cuatro días después del último pase. Si las células madre pluripotentes humanas se mantuvieron en MAPS, deben transferirse a condiciones libres de alimentador, dos o tres pases antes de los experimentos de transducción, y deben representar cultivos de células madre pluripotentes sanos.Libre de diferenciación espontánea. Aspire el medio de CPEH y agregue dos mililitros de solución de disociación enzimática, como Accutase, por pocillo de una placa de seis pocillos, incubando la placa a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono durante cinco a siete minutos. Luego, agregue dos mililitros de medio completo con 10 micromoles de inhibidor de ROCK y recoja las células desprendidas.Después de preparar una suspensión celular homogénea, tome una pequeña alícuota y cuente las células viables mediante el método de exclusión con azul de tripano. A continuación, centrifugue las células a 200 × g durante cinco minutos y resuspenda el sedimento en medio completo con inhibidor de ROCK 10 micromolar a una concentración final de 3,4 × 10⁶ células vivas por mililitro. Luego, agregue 200 microlitros de la suspensión celular que contiene 0,68 × 10⁶ células a cada uno de los 1,3 mililitros de medio de transducción preparado anteriormente.Retire la placa de seis pocillos recubierta con matriz de 37 a grados Celsius. A continuación, aspire la solución de matriz y transfiera cada una de las mezclas de transducción a un pocillo, y gire suavemente la placa para distribuir las células uniformemente en el pocillo. 24 horas.Después de la transducción, visualice las pocetas bajo el microscopio para asegurarse de que al menos el 80 % de las células estén adheridas. Deseche la solución vírica y lave las células adheridas con medio incompleto sin factores de crecimiento. A continuación, agregue tres mililitros del medio suplementado con citocinas, denominado medio tres F, a las células.Incube las células durante la noche al día siguiente. Cambie el medio por medio F fresco que contenga un microgramo por mililitro de puromicina, para eliminar las células no transducidas residuales.Cambie este medio cada 24 horas para eliminar las células muertas. Después de 48 horas de tratamiento, suspenda la puromicina y utilice únicamente medio tres F fresco el día cuatro. Después de la transducción, observe las células al microscopio para detectar la aparición de células agrupadas con morfología endotelial y determinar así la formación de células hematoendoteliales.Primero, asocie las células entre los días tres o cuatro del plato de cultivo con la solución de desprendimiento celular. Recolecte las células desprendidas en medio completo y centrifúgelas, resuspenda las células en tampón máximo a temperatura ambiente y cuente las células en un hemocitómetro, luego incube una vez 10 a la quinta células por reacción de tinción con anticuerpos adecuados para la detección de v-catrín, CD226, CD73 y CD43. Marcadores de superficie celular.Se describe la realización de citometría de flujo en el protocolo escrito a partir del día cuatro. Después de la transducción, continúe la diferenciación de las células reemplazando la mitad del medio de cada pocillo cada 48 horas; entre los días cinco y siete, aparecerán células sanguíneas redondeadas ligeramente agregadas y flotando por encima de la capa de células endoteliales. Mantenga los cultivos hasta 14 días, durante los cuales las células en suspensión deben expandirse significativamente.Análisis citométrico de flujo de ETV dos, GATA uno y ETV dos. Las células transducidas con GATA dos muestran la formación de hemodermis terin positiva, que puede identificarse por la expresión de CD226 y la ausencia de expresión de CD73 entre los días tres y cuatro de diferenciación. El análisis citométrico de flujo de ETV dos, GATA uno y ETV dos muestra la inducción de células sanguíneas que expresan CD43 a los siete días.Después de la transducción, el análisis por citometría de flujo de las células inducidas por gata two TAL one LMO two en el día 14 post-transducción muestra la formación de células sanguíneas que expresan CD 2 35 A y CD 41 A. Las preparaciones de citosina teñidas al derecho de células hematopoyéticas inducidas por gata two TAL one lmo two mostraron morfologías de eritroide, macrófago y células megacariocíticas en ensayos de formación de colonias. La transducción de células madre pluripotentes humanas puede realizarse en menos de una hora durante la realización del procedimiento de transducción. Es importante considerar siempre la viabilidad de las células madre, incluir inhibidor de ROCK en la mezcla de reacción y utilizar una cantidad óptima de virus por célula tras los primeros tres días.Después de la transducción, se pueden realizar métodos como tinción inmunológica, ensayo de formación de colonias y citometría de flujo para responder preguntas sobre la eficiencia de la diferenciación y el tipo de enfermedad hematológica inducida. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo mantener y infectar células madre pluripotentes humanas y qué esperar en cultivos diferenciados durante los primeros siete a 10 días. Una vez que los factores de transcripción se han entregado con éxito en células madre pluripotentes humanas, las células pierden su pluripotencia y gradualmente se comprometen hacia un destino hematopoyético.Por lo tanto, los investigadores dispondrán de un modelo in vitro conveniente para estudiar los mecanismos moleculares de la transición de endotelial a hematopoyética. No olvide que trabajar con regiones que contienen lentivirus puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como el uso de equipo de protección personal y la eliminación adecuada de materiales que contengan virus, durante la realización de este procedimiento.

direct-induction-hemogenic-endothelium-blood-overexpression

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Aquí se muestra un protocolo simple y eficaz para la generación de iPSCs humanos de 3-4 ml de sangre periférica utilizando un único vector lentiviral reprogramación. La reprogramación de células de la sangre fácilmente disponibles promete acelerar la utilización de la tecnología de IPSC para hacerla accesible a una comunidad de investigación más amplia.

Generación de las células madre pluripotentes inducidas a partir de sangre periférica mediante el STEMCCA vector lentiviral

Se desarrolló un método para derivar directamente las células madre neurales humanas a partir de células progenitoras hematopoyéticas enriquecidas a partir de células de sangre periférica.

La inducción directa de las células madre neurales humanas a partir de células de sangre periférica progenitoras hematopoyéticas

El protocolo descrito aquí detalla la inducción de un programa hemogénico en fibroblastos embrionarios de ratón a través de la sobreexpresión de un conjunto mínimo de factores de transcripción. Esta tecnología puede trasladarse al sistema humano para proporcionar plataformas para futuros estudios de la hematopoyesis, la enfermedad hematológica y el trasplante de células madre hematopoyéticas.

La reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón con factores de transcripción para inducir un programa Hemogenic

Proponemos un protocolo para reprogramar células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) en células madre pluripotentes inducidas (iPSCs). Al colocar las células sanguíneas transducidas en placas recubiertas de matriz con centrifugación, las iPSC se inducen con éxito a partir de células flotantes. Esta técnica sugiere un protocolo de reprogramación simple y efectivo para células como PBMC y CBMC.

Inducida por la generación de células madre pluripotentes a partir de células de la sangre usando el virus Sendai y centrifugación

Este protocolo describe un método detallado para la generación eficiente de iPSCs libres de integración a partir de células de sangre periférica adultas humanas. Con el uso de cuatro vectores episomales basados en oriP/EBNA para expresar los factores de reprogramación, KLF4, MYC, BCL-XL o OCT4 y SOX2, se pueden obtener miles de colonias de iPSC a partir de 1 mL de sangre periférica.

Generación de Integración libres de células madre pluripotentes inducidas a partir de células mononucleares de sangre periférica humana Utilizando vectores episomales

Aquí, presentamos pluripotentes humanas protocolos de cultura de la célula de vástago (hPSC), solía diferenciarse hPSCs a CD34+ de progenitores hematopoyéticos. Este método utiliza la manipulación de la fase específica de canónica WNT de señalización especificar las células exclusivamente ya sea definitivo o primitiva hematopoyética programa.

Dirige la diferenciación de progenitores hematopoyéticos primitivo y definitivo de las células madre Pluripotent humanas

Aquí, presentamos un protocolo para formar con precisión endotelio hemogénico a partir de células madre pluripotentes humanas en una condición libre de alimentador y xeno. Este método tendrá amplias aplicaciones en el modelado de enfermedades y cribado de compuestos terapéuticos.

Diferenciación de endotelio hemogénico de células madre pluripotentes humanas en una condición definida libre de alimentador y xeno

Este protocolo demuestra la inducción de un programa hemogénico en fibroblastos dérmicos humanos mediante la expresión forzada de los factores de transcripción GATA2, GFI1B y FOS para generar células hematopoyéticas madre y progenitoras.

Reprogramación hemogénica de fibroblastos humanos por expresión forzada de factores de transcripción

Aquí se presenta un protocolo simple para la diferenciación dirigida de células endoteliales hemogénicas de células madre pluripotentes humanas en aproximadamente 1 semana.

Diferenciación dirigida de células endoteliales hemogénicas de células madre pluripotentes humanas

Este protocolo describe la generación de vasos sanguíneos autoorganizados a partir de células madre pluripotentes humanas y pluripotentes inducidas. Estas redes de vasos sanguíneos exhiben una red endotelial extensa y conectada rodeada de pericitos, actina del músculo liso y una membrana basal continua.

Generación de organoides de vasos sanguíneos humanos a partir de células madre pluripotentes

Aquí se describe un flujo de trabajo simple para diferenciar las células endoteliales de las células madre pluripotentes humanas, seguido de un protocolo detallado para su estimulación mecánica. Esto permite el estudio de la mecanobiología del desarrollo de las células endoteliales. Este enfoque es compatible con los ensayos posteriores de células vivas recogidas del chip de cultivo después de la estimulación mecánica.

In vitro Modelo de vaso humano fetal en chip para estudiar la mecanobiología del desarrollo

Aprende a inducir endotelio hemogénico y células sanguíneas a partir de células madre pluripotentes humanas mediante la sobreexpresión de factores de transcripción. Este método permite estudiar la transición endotelial a hematopoyética en un modelo in vitro controlado y eficiente.

La inducción directa de Hemogenic endotelio y la Sangre por la sobreexpresión de factores de transcripción en células madre pluripotentes Humanos (Video) | JoVE Journal

La inducción directa de Hemogenic endotelio y la Sangre por la sobreexpresión de factores de transcripción en células madre pluripotentes Humanos

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