Un alto rendimiento y sistema de expresión de costo-eficiente de granzimas humanos en células de mamífero

El objetivo general de este procedimiento es producir altos rendimientos de granzimas glicosiladas fólicas y enzimáticamente activas en células T 2 93 de riñón embrionario humano. Esto se logra expandiendo primero las células T HEC 2 93 en placas de cultivo de tejidos adecuadas. El tamaño habitual de preparación después de la expansión consta de 20 a 25 platos de cultivo.

El segundo paso es transfectar transitoriamente las células expandidas con un plásmido de expresión de granzima utilizando el método eficiente de fosfato de calcio. A continuación, se recolectan los supernatos celulares y se purifican las grandes enzimas secretadas mediante cromatografía de afinidad metálica inmovilizada. Los pasos finales son la activación de las grandes enzimas mediante el tratamiento con quinasas y la purificación adicional de las proteasas mediante cromatografía de intercambio catiónico.

En última instancia, la actividad enzimática se prueba mediante un ensayo métrico de chole rápido y fiable, ya que la disponibilidad de proteasa activa en cantidades suficientes es un factor limitante en la investigación de la granzima. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo, como la caracterización de nuevas vías de muerte celular en diferentes organismos, o la identificación de nuevos sustratos de proteasa en enfoques de proteoma completo para expresar grandes enzimas. Primero cultive células T HEC 2 93 en 20 mililitros de medio de cultivo, utilizando placas de cultivo de tejidos de 150 por 25 milímetros que dividen las células al 80% de fluidez Las células se adhieren sin apretar, pero se pueden separar mecánicamente sin tripsina pipeteando rigurosamente la placa hacia arriba y hacia abajo.

Las células la noche anterior a la transfección para dar un 60 a 70% de fluidez en el día de la transfección. Un tamaño de preparación habitual consta de 20 a 25 platos de cultivo. Una hora antes de la transfección, se cambió el medio de cultivo estándar a 20 mililitros de medio de transfección cerca del final de la etapa de incubación de una hora, se mezclaron 400 microgramos de ADN plasmático con 10,95 mililitros de agua destilada doble y 1,55 mililitros de cloruro de calcio de dos molares en tubos de 50 mililitros uno o dos minutos antes de la transfección.

A 12,5 mililitros de dos pilas de solución salina tamponada a 12,5 mililitros de la solución de calcio del ADN mezclada por inversión de los tubos antes de incubar durante 30 segundos. A temperatura ambiente, agregue esta mezcla, gota a gota directamente a las celdas a cinco mililitros por plato, espolvoree uniformemente sobre toda el área, convirtiendo el medio en un color ligeramente anaranjado. Incubar las placas de cultivo durante siete a 11 horas en una incubadora de cultivo de tejidos.

Después de la incubación, se ve un precipitado fino. Retire el medio de transfección. Enjuague cuidadosamente con PBS precalentado y agregue 20 mililitros de medio de cultivo libre de suero antes de incubar durante 72 horas en una incubadora de cultivo de tejidos, analice la eficiencia de la transfección y la expresión ejecutando una muestra del sobrenadante celular en la página SDS y tiñéndola con kumasi.

Azul brillante. Para visualizar una banda de granzima. Después de la incubación, decantar los sobrenadantes del cultivo celular en tubos de 250 mililitros y limpiarlos por centrifugación.

Realiza un primer giro que limpiará el medio de las células desprendidas. Transfiera el sobrenadante a tubos nuevos de 250 mililitros y centricírelo a 4.000 g durante 30 minutos a cuatro grados centígrados para eliminar los restos celulares restantes. A continuación, agregue cinco mililitros de cloruro de sodio, 6,25 mililitros de tris base y un mililitro de sulfato de níquel más 250 mililitros de sobrenadante aclarado.

Filtre el sobrenadante con una unidad de filtro de vacío de 500 mililitros. Equilibre una columna de cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados con níquel con su tampón de unión. A utilizando un sistema FPLC adecuado.

A continuación, aplique el sobrenadante aclarado a la columna equilibrada a un caudal de 0,5 mililitros por minuto a cuatro grados centígrados. Después de aplicar el sobrenadante, lave la columna con su tampón de unión hasta que se alcance la línea de base de absorción ultravioleta o UV. Eluir las granzimas con un gradiente ILE lineal de 20 mililitros a un caudal de 0,5 mililitros por minuto mientras se recogen fracciones de dos mililitros.

Analizar las fracciones elucianas mediante SDS page y tinción de kumasi. Tire de la gran zima que contiene fracciones en un tubo deslumbrante. Almacene una pequeña muestra a menos 20 grados centígrados como control de pre enteroquinasa.

Añadir enteroquinasa a 0,02 unidades por 50 mililitros de sobrenadante inicial directamente a la fracción agrupada en el tubo de diálisis y dializar durante la noche a temperatura ambiente en tampón enterocinasa. Al día siguiente, analice la quinasa tratada en comparación con el control de quinasa pre entrante mediante la página SDS y la tinción con azul de kumasi. Cuando se completa el procesamiento del terminal final.

Cambie el tampón de diálisis a un tampón S A y dialice durante otras cuatro horas a temperatura ambiente antes de filtrar el DIALATE eight. A continuación, equilibre una columna S con un búfer S. A.Cargue la muestra en la columna a un caudal de 0,5 mililitros por minuto a cuatro grados centígrados después de la carga de la muestra.

Lave la columna con tampón S A hasta alcanzar la línea de base de absorción de rayos UV. Eluir las granzimas con un gradiente lineal de cloruro de sodio de 30 mililitros, la granzima A eluye aproximadamente a 650 milimolar, el cloruro de sodio Granzima B a aproximadamente 700 milimolares de cloruro de sodio y la granzima M a aproximadamente 750 milimolares de cloruro de sodio. Agrupar las fracciones que contienen granzimas y concentrarlas hasta aproximadamente 100 micromolares en filtros de centrifugación, alícuota las preparaciones concentradas de granzimas y almacenar a menos 80 grados centígrados.

A continuación, analice las fracciones elucianas mediante ensayos métricos SDS Page y Chole para realizar los ensayos métricos Chole distribuyen pequeñas muestras de granzima a partir de fracciones ellucianas o stocks concentrados en 96. Las placas de fondo plano incluyen un control positivo y un control negativo. Agregue 100 microlitros de tampón de ensayo a cada uno.

Incubar bien la placa durante 10 minutos a 37 grados centígrados. Por último, mida la densidad óptica a 405 nanómetros en un lector de microplacas. Este protocolo producirá altos rendimientos de granzimas puras, como se demuestra en este gel de página SDS teñido con kumasi representativo que muestra granzima BE de la columna S.

Las granzimas recombinantes muestran una actividad similar a las preparaciones de proteasas nativas, como se muestra en este ensayo métrico de color que compara la actividad de la granzima B recombinante y nativa. Es importante destacar que el tratamiento con endo H indica que las granzimas producidas en las células T HEC 2 93 están completamente glicosiladas. Las grandes enzimas recombinantes son capaces de escindir sustratos de proteínas macromoleculares, como se demuestra en este ensayo representativo de granzima, una escisión, utilizando el sustrato de proteínas bacterianas y UOCD.

Aquí, la banda que representa el N-O-U-C-D escindido desaparece lentamente con el aumento de la concentración de granzima. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo producir grandes enzimas completamente glicosiladas y proactivas con altos rendimientos en las células T HK 2 93.