Name: Un alto rendimiento y sistema de expresión de costo-eficiente de granzimas humanos en células de mamífero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Aprende a producir granzimas humanas glicosiladas y activas en células HEK293T mediante transfección con fosfato de calcio y cromatografía de afinidad. Este método eficiente facilita la investigación inmunológica.

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Este trabajo fue financiado por subvenciones de la Fundación Novartis para la Investigación Médico-Biológica y del Grupo de Investigación de la Universidad de Friburgo (a MW). Agradecemos a Li Zhao, Zhan Xu y Solange Kharoubi Hess por su apoyo técnico, así como a Radu Aricescu e Yvonne Jones (Universidad de Oxford, Reino Unido) por proporcionar el plásmido pHLsec, y a Thomas Schürpf (Escuela de Medicina de Harvard) por las útiles discusiones.

1. Producción del plásmido de expresión pHLsec-Gzm <ol><li> Preparar el ARN total de las células NK humanas (células primarias preparadas como en el 26 o la línea de células NK NK-92 que expresa los cinco Gzms humanos) utilizando un método de aislamiento de ARN adecuado y transcribir inversa utilizando un kit de primera cadena sintetizar ADNc, siguiendo el manufacturer` recomendaciones s. Amplificar ADNc Gzm usando PCR y el clon en pHLsec como se describe en 23 (especie de regalo de Radu Aricescu e Yvonne Jones, de la Universidad de Oxford, Reino Unido), utilizando los sitios AgeI y KpnI (Figura 1). NOTA: Utilice los siguientes cebadores indicados en la Tabla 1. </li><li> Confirmar inserciones correctas por secuenciación. Expandir los plásmidos de expresión en células DH5a y purificar utilizando un kit de aislamiento de plásmido libre de endotoxinas y siga las instrucciones del fabricante. </li><li> Resuspender los plásmidos purificados en libre de endotoxina, agua estéril a una concentración de 2 mg / ml y se almacena a -20 ° C until uso. </li></ol> 2. Expresión de Gzms en células HEK293T <ol><li> Preparación de los reactivos <ol><li> Preparar medio de cultivo estándar. Para Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) que contenía alta glucosa (25 mM), glutamax (4 mM), piruvato de sodio (1 mM) añadir 10% de suero estándar de ternera fetal (FCS), penicilina (100 unidades / ml), estreptomicina ( 100 g / ml). </li><li> Preparar medio de transfección. Para medio de cultivo sin penicilina-estreptomicina añadir 25 g / ml de cloroquina (añadir recién en el día de la transfección de las existencias 1,000x en PBS, almacenado a -20 ° C). </li><li> Preparar medio de cultivo libre de suero: Para medio libre de suero para células HEK293 añadir glutamina (4 mM), penicilina (100 unidades / ml), estreptomicina (100 g / ml), y 2,5 mg / L anfotericina B. </li><li> Preparar las soluciones descritas en la Tabla 2 y el filtro con un filtro de 0,45 micras antes de su uso: </li></ol></li><li> Ampliando las células HEK293T <ol><li> Crecer células HEK293T en 20 ml de cultomedio ure utilizando 150 x 25 mm placas de cultivo de tejidos. </li><li> Dividir celdas a 80% de confluencia (split-relación de 1: 4, por lo general cada día 3º). Las células se adhieren libremente, que pueden separarse mecánicamente sin tripsinización por rigurosamente pipeteando arriba y abajo. </li><li> Células de la placa la noche antes de la transfección para dar 60-70% de confluencia en el día de la transfección (densidad de siembra ~ 2 x 10 5 células / ml). Un tamaño habitual preparación consiste en 20 a 25 placas de cultivo. </li></ol></li><li> Transfección de fosfato de calcio <ol><li> 1 hr antes de la transfección, cambiar el medio de cultivo estándar a 20 ml de medio de transfección. Cerca del final de esta etapa de incubación 1 h, la mezcla 400 g de ADN plásmido con 10,95 ml ddH 2 0 y 1,55 ml de 2M CaCl 2 en tubos de 50 ml (1 tubo / 5 platos). </li><li> 1 a 2 min antes de la transfección, añadir 12,5 ml de 2x HBS a 12,5 ml de la solución de ADN-calcio, mezclar por inversión de los tubos y se incuba durante 30 segundos a RT. </li><li> Añadir ªmezcla e prepara en 2.3.2 directamente a las células (5 ml por placa), gota a gota en el medio. Espolvorear uniformemente sobre toda el área, convirtiendo el medio a un color ligeramente anaranjado. </li><li> Incubar las placas de cultivo de 7 a 11 horas en una incubadora de cultivo de tejidos (37 ° C, 5% de CO2 en aire humidificado). Después de la incubación, un precipitado fino es visible. Retire el medio de transfección, enjuagar cuidadosamente con PBS precalentado y añadir 20 ml de medio de cultivo libre de suero preparado en 2.1.3. Incubar durante 72 horas en una incubadora de cultivo de tejidos. </li><li> Analizar la eficacia de transfección y expresión mediante la ejecución de una muestra (~ 20 l) del sobrenadante celular en SDS-PAGE y tinción con azul brillante de Coomassie para visualizar una banda de granzima. </li></ol></li><li> Purificación de Gzms del sobrenadante del cultivo por Nickel-IMAC <ol><li> Después de la incubación, decantar los sobrenadantes de cultivo de células en tubos de 250 ml y clara por centrifugación. Llevar a cabo una primera vuelta (400 xg, 10 min, 4 °C) que despejará el medio de células separadas. Transferir el sobrenadante en fresco 250 ml tubos y centrifugado a 4000 xg, 30 min a 4 ° C para eliminar cualquier residuo de células restante. </li><li> Añadir 5 ml de NaCl 5 M, 6,25 ml de 2 M Tris-Base (pH 8) y 1 ml de 0,25 M NiSO4 por 250 ml de sobrenadante clarificado. Filtrar el sobrenadante usando una unidad de filtro de vacío 500 ml (0,45 mm). </li><li> Equilibrar una columna de níquel-IMAC con Su-tampón de unión A (10 volúmenes de columna, CV) utilizando un sistema de FPLC adecuado. </li><li> Aplicar el sobrenadante aclarado a la columna equilibrada a un caudal de 0,5 ml / min a 4 ° C. </li><li> Después se aplicó el sobrenadante, lavar la columna con Su-tampón de unión hasta la línea base de absorbancia UV se alcanza (por lo general 10 CV). </li><li> Eluir Gzms con un 20 ml-gradiente lineal (0 a 250 mM imidazol) a una velocidad de flujo de 0,5 ml / min mientras que la recogida de 2 ml fracciones. Analizar las fracciones de elución por SDS-PAGE y tinción de Coomassie. </li></ol></li><li> Enteroquinasa (EK)el tratamiento y la limpieza final por cromatografía de intercambio catiónico <ol><li> Piscina Gzm contiene fracciones en un tubo de diálisis con ≤10 MWCO. Guarde una pequeña muestra a -20 ° C como control pre-EK. </li><li> Añadir EK en 0,02 unidades / 50 ml de sobrenadante inicial directamente a la fracción reunida en el tubo de diálisis y diálisis O / N (al menos 16 horas) a temperatura ambiente en EK-buffer (4 L, el cambio búfer una vez). </li><li> El día siguiente, analizar EK tratada Gzms en comparación con el control pre-EK por SDS-PAGE y tinción de Coomassie. </li><li> Cuando el procesamiento N-terminal es completa, cambiar tampón de diálisis a S tampón A (4 L) y se dializa durante otras 4 horas a RT. Dializado filtro (0,45 m). </li><li> Equilibrar un S-columna con tampón S A. Cargar la muestra en la columna con un caudal de 0,5 ml / min a 4 ° C. </li><li> Después de cargar la muestra, lavar la columna con tampón A hasta S UV absorbancia se alcanza la línea de base (sobre 10 CV). Eluir los Gzms con un gradiente lineal de 30 ml (150 a 1000 mM de NaCl). GzmA correolaúdes en ~ 650 mM NaCl, GzmB en ~ 700 mM NaCl y GzmM en ~ 750 mM NaCl. </li><li> Analizar las fracciones de elución por SDS-PAGE y ensayos colorimétricos (véase más adelante). Fracciones que contienen Gzms piscina y concentrado (aproximadamente 30 veces, a una concentración de aproximadamente 100 mM) en filtros de giro (15 ml, 10 MWCO). Alícuota los preparativos GZM concentrados y almacenar a -80 ° C. </li></ol></li></ol> Actividad 3. Prueba Gzm <ol><li> Preparación de los reactivos <ol><li> Preparar tampón de ensayo colorimétrico: 50 mM Tris-Base, pH 7. <ol><li> Para la medición de GzmA, añadir Na-CBZ-L-lisina tiobencilo éster (S-Bzl) (BLT) para el tampón de ensayo a una concentración final de 0,2 mM y 5,5&#39;-ditio-bis (ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB) a una concentración de 0,22 mM. Para GzmB, incluir 0,2 mM Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl mM DTNB (AAD) y 0.22. Para GzmM, incluir 0,2 mM Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilida (pNA) (AAPL). Los péptidos sintéticos se añaden de soluciones de reserva adecuadas (en DMSO, stored a -20 ° C) a la memoria intermedia recién antes del ensayo. </li></ol></li><li> Preparar tampón de ensayo de escisión: NaCl 100 mM, 50 mM Tris-Base, pH 7,5 </li></ol></li><li> Ensayos colorimétricos <ol><li> Distribuir muestras pequeñas gzm (&lt;5 l) de fracciones de elución o poblaciones concentradas en las placas de 96 pocillos de fondo plano. Incluya un control positivo (preparaciones GZM probados o crudo lisados ​​de células NK) y un control negativo (tampón solamente). </li><li> Añadir 100 l de tampón de ensayo a cada pocillo (usando una pipeta multicanal). Incubar durante 10 minutos a 37 ° C. Medir la DO a 405 nm en un lector de microplacas. </li></ol></li><li> Ensayo de escisión <ol><li> Para los ensayos de escisión utilizando sustratos purificados, co-incubar un sustrato de proteína (nativo o recombinante, 100-400 nM; algunos ejemplos de sustratos gzm eficientes se presentan en la sección de resultados y en la nota al final de esta sección) con diluciones en serie de un Gzm (a partir de 400 nM) en tampón de ensayo durante diversos tiempos.Analizar mediante SDS-PAGE y tinción con plata o Coomassie; o mediante transferencia Western usando anticuerpos específicos. </li><li> Para los ensayos de escisión utilizando lisados ​​de células, suspender 10 6 células HeLa (o cualquier línea de células tumorales disponible) en 1 ml de tampón de ensayo y se lisan por congelación en un / baño de hielo seco de etanol y descongelación a 37 ° C tres veces. Eliminar los restos celulares por centrifugación (15.000 xg durante 10 min a 4 ° C). </li><li> Co-incubar el lisado aclarado con Gzms en diferentes concentraciones y tiempos que el anterior. La escisión se detecta por inmunotransferencia utilizando anticuerpos apropiados. NOTA: Algunos ejemplos de sustratos de buena fe para que los anticuerpos comerciales están disponibles: Oferta (BH3-interacción agonista muerte de dominio) y la caspasa 3 escindida por GzmB 27,28; múltiples ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas (hnRNPA1, A2 y U) escindidas por GzmA 29; citomegalovirus fosfoproteína 71 por GzmM 30. </li></ol></li></ol>

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<li>Thomas, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+protease+binding+to+nucleic+acids+promotes+nuclear+localization+and+cleavage+of+nucleic+acid+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Leukocyte protease binding to nucleic acids promotes nuclear localization and cleavage of nucleic acid binding proteins.</a> J Immunol. 192, 5390-5397 (2014).</li>
<li>Jacquemin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+B-induced+mitochondrial+ROS+are+required+for+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+death+and+differentiation%22%5BJournal%5D)">Granzyme B-induced mitochondrial ROS are required for apoptosis.</a> Cell death and differentiation. , (2014).</li>
<li>Kummer, J. A., Kamp, A. M., Citarella, F., Horrevoets, A. J., Hack, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+human+recombinant+granzyme+A+zymogen+and+its+activation+by+the+cysteine+proteinase+cathepsin+C%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Expression of human recombinant granzyme A zymogen and its activation by the cysteine proteinase cathepsin C.</a> The Journal of biological chemistry. 271, 9281-9286 (1996).</li>
<li>Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+assay+that+specifically+measures+Granzyme+B+proteolytic+activity%3A+hydrolysis+of+Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A colorimetric assay that specifically measures Granzyme B proteolytic activity: hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e52419(2014).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El papel clásico y ampliamente estudiado de GzmA y GzmB es la inducción de apoptosis en células de mamífero después de su entrega citosólica por la proteína formadora de poros PFN 1. Recientemente, el espectro citotóxica de los Gzms se amplió de manera significativa a partir de células de mamíferos a las bacterias 9,10, así como a ciertos parásitos 11. Además, las funciones no clásicos, extracelulares de GzmA y GzmB así como la importancia biológica de los diversos Gzms huérfanos son tod...

Los Gzms son una familia de serina proteasas altamente homólogas localizadas en los lisosomas especializados de CTL y células NK 1. Los gránulos citotóxicos de estas células asesinas también contienen las proteínas de la membrana de alteración PFN y GNLY que se liberan simultáneamente con los Gzms en el reconocimiento de una célula diana destinada para la eliminación de 2,3. Hay cinco Gzms en humanos (GzmA, B, H, K y M), y 10 Gzms en ratones (GzmA - G, K, M y N). GzmA y GzmB son los más abundantes y ampliamente estudiado en seres humanos y ratones 1. Sin embargo, estudios más recientes han comenzado a investigar las vías de muerte celular, así como los efectos biológicos adicionales mediadas por los otros llamados Gzms, huérfanos en la salud y la enfermedad 4. La función mejor conocida de las Gzms, en particular de GzmA y GzmB, es la inducción de la muerte celular programada en células de mamíferos cuando se entrega en las células diana por PFN 5,6. Sin embargo, Estudios más recientes también demostraron efectos extracelulares de los Gzms con profundo impacto en la regulación inmune y la inflamación, independientemente de la entrega citosólica por PFN 7,8. El espectro de las células que mueren de manera eficiente después de la entrada citosólica de las Gzms también fue recientemente se amplió a partir de células de mamíferos a las bacterias 9,10 e incluso ciertos parásitos 11. Estos recientes descubrimientos abrieron un campo completamente nuevo para los investigadores GZM. Por lo tanto, un sistema de expresión de mamíferos de alto rendimiento rentable aliviará significativamente el camino para los estudios futuros. Humanos, de ratón y de rata Gzms nativos se han purificado con éxito de la fracción de gránulos de CTL y NK células líneas 12-14. Sin embargo, en nuestras manos el rendimiento de tales técnicas de purificación está en el intervalo de menos de 0,1 mg / L de cultivo celular (observación no publicada y 12). Además, la resolución cromatográfica de un solo Gzm sin contaminación por other Gzms y / o proteínas que también están presentes en los gránulos es un reto (datos no publicados y 12,14). Gzms recombinantes se producen en bacterias, levaduras 15 16, células de insecto y en 17 incluso en las células de mamífero tales como HEK 293 18,19. Sólo los sistemas de expresión de mamífero tienen el potencial de producir enzimas recombinantes con modificaciones postraduccionales idéntica a la proteína citotóxica nativo. Modificaciones postraduccionales han sido implicados con la captación específica por endocitosis y la localización intracelular de la proteasa dentro de las células diana 20-22. Por lo tanto, mediante el uso de pHLsec 23 (una especie de regalo de Radu Aricescu e Yvonne Jones, de la Universidad de Oxford, Reino Unido) como la columna vertebral plásmido para la expresión Gzm, establecimos un sistema simple, tiempo y costo eficiente para la producción de proteínas de alto rendimiento en células HEK293T. pHLsec combina un promotor de CMV con un promotor-Β-actina de pollo; En conjunto, estos elementos demostrated el más fuerte promotor de la actividad en diversas líneas celulares 24. Además, el plásmido contiene un intrón de conejo Β-globina, señales de secreción y Kozak optimizada, una Lys-6xHis-tag y un poli-A de la señal. Los insertos se pueden clonar convenientemente entre la señal de secreción y la 6xHis-Lys-tag (Figura 1) asegurar la expresión óptima y eficacia de secreción para proteínas que carecen de dominios N-terminales apropiados. Para la expresión de los Gzms, que sustituye la secuencia señal de secreción endógena con la señal de secreción proporcionada por el vector seguido por una enteroquinasa (EK) sitio (DDDDK), de modo que el tratamiento EK activado el Gzms secretadas (Gzms activos comenzar con el N-terminal secuencia de aminoácidos IIGG 25). Adicionalmente a favor de este método, las células HEK293T crecen rápidamente en un medio de bajo precio, como medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), y son muy adecuadas para el método de transfección de fosfato de calcio rentable.

<table><tbody><tr><td>TRIzol Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026 Kit de</td><td>aislamiento de ARN total</td></tr><tr><td>SuperScript II Transcriptasa inversa</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>EX-CELL 293 Medio sin suero para células HEK 293 Sigma</td><td></td><td>14571C</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glucosa alta, Suplemento GlutaMAX, piruvato</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de diálisis SnakeSkin, 10K MWCO</td><td>Thermo Scientific</td><td>68100</td><td></td></tr><tr><td>Enteroquinasa de intestino bovino</td><td>Sigma</td><td>E4906</td><td>recombinante, &ge; 20&nbsp; unidades/mg de proteína</td></tr><tr><td>HisTrap Excel 5 ml columna</td><td>GE Healthcare</td><td>17-3712-06&nbsp;</td><td>Níquel IMAC</td></tr><tr><td>HiTrap SP HP 5 ml columna</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1152-01&nbsp;</td><td>Columna S</td></tr><tr><td>N-&alpha;-Cbz-L-lisina tiobencilada (BLT)</td><td>Sigma</td><td>C3647</td><td>Sustrato GzmA</td></tr><tr><td>Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD)</td><td>MP Biomedicals</td><td>2193608 _10mg</td><td>Sustrato GzmB</td></tr><tr><td>Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilida (AAPL)</td><td>Bachem</td><td></td><td>Sustrato GzmM</td></tr><tr><td>5,5&prime;-ditio-bis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB)</td><td>Sigma</td><td>D8130</td><td>Reactivo de Ellman</td></tr></tbody></table>

un alto rendimiento y sistema de expresión de costo-eficiente de granzimas humanos en células de mamífero

A High Yield and Cost-efficient Expression System of Human Granzymes in Mammalian Cells

Cuando los linfocitos T citotóxicos (CTL) o las células asesinas naturales (NK) reconocen células tumorales o células infectadas con patógenos intracelulares, liberan su contenido de gránulos citotóxicos para eliminar las células diana y el patógeno intracelular. La muerte de las células huésped y los patógenos intracelulares es provocada por las serina proteasas granulosas, granzimas (Gzms), entregadas al citosol de la célula huésped por la proteína perforina formadora de poros (PFN) y a los patógenos bacterianos por la proteína granulisina que altera la membrana procariota (GNLY). Para investigar los mecanismos moleculares de la muerte de las células diana mediada por los Gzms en entornos experimentales in vitro, son necesarios sistemas de expresión y purificación de proteínas que produzcan grandes cantidades de enzimas activas. Los sistemas de expresión de proteínas secretadas en mamíferos implican el potencial de producir proteínas completamente funcionales y correctamente plegadas que soportan modificaciones postraduccionales, como la glicosilación. Por lo tanto, utilizamos un método de precipitación de calcio rentable para la transfección transitoria de células HEK293T con Gzms humanos clonados en el plásmido de expresión pHLsec. La purificación de Gzm del sobrenadante de cultivo se logró mediante cromatografía de afinidad de níquel inmovilizado utilizando la etiqueta de polihistidina C-terminal proporcionada por el vector. La inserción de un sitio enteroquinasa en el extremo N-terminal de la proteína permitió la generación de proteasa activa que finalmente fue purificada por cromatografía de intercambio catiónico. El sistema se probó produciendo altos niveles de Gzm A, B y M humanos citotóxicos y debería ser capaz de producir prácticamente todas las enzimas del cuerpo humano con altos rendimientos.

En la siguiente sección vamos a presentar una documentación completa de un preparado GzmA para iluminar el método. También nos purificamos éxito GzmB y GzmM, produciendo resultados similares en cuanto a la eficiencia y la actividad de la purificación. Sin embargo, a partir de las preparaciones posteriores sólo mostraremos algunas piezas seleccionadas de datos. Preparaciones GzmB a partir de células 293T siguiendo el protocolo actual se utilizaron en varios estudios publicados, destacando su actividad en diversos sistema...

Describimos aquí un sistema de expresión de granzima rentable utilizando células HEK293T que produce altos rendimientos de proteasa pura, totalmente glicosilada y enzimáticamente activa.

Un alto rendimiento y sistema de expresión de costo-eficiente de granzimas humanos en células de mamífero

When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their ...

El objetivo general de este procedimiento es obtener altos rendimientos de granzimas glicosiladas con foliculina y enzimáticamente activas en células de riñón embrionario humano 293T. Esto se logra primero expandiendo las células HEK 293T en placas de cultivo de tejidos adecuadas. El tamaño habitual de preparación tras la expansión consiste en 20 a 25 placas de cultivo.El segundo paso consiste en transfectar transitoriamente las células expandidas con un plásmido de expresión de granzima utilizando el método eficiente de fosfato cálcico. A continuación, se recolectan los sobrenadantes celulares y las enzimas granzima secretadas se purifican mediante cromatografía de afinidad por inmovilización de metales. Los pasos finales son activar las enzimas granzima mediante tratamiento con enterocinasa y purificar aún más las proteasas mediante cromatografía de intercambio catiónico.Por último, la actividad enzimática se evalúa mediante un ensayo colimétrico rápido y fiable. Dado que la disponibilidad de proteasa activa en cantidades suficientes es un factor limitante en la investigación de granzimas, este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo, como la caracterización de nuevas vías de muerte celular en diferentes organismos o la identificación de nuevos sustratos de proteasa en enfoques de proteoma completo para expresar enzimas granulares. Primero, cultive células HEK 293T en 20 mililitros de medio de cultivo, utilizando placas de cultivo tisular de 150 por 25 milímetros. Pase las células al 80 % de confluencia; las células se adhieren débilmente, pero pueden separarse mecánicamente sin tripsina mediante pipeteo vigoroso hacia arriba y hacia abajo en la placa.Las células la noche anterior a la transfección para alcanzar una confluencia del 60 al 70% el día de la transfección. Una preparación habitual consta de 20 a 25 placas de cultivo. Una hora antes de la transfección, cambie el medio de cultivo estándar por 20 mililitros de medio de transfección; cerca del final del paso de incubación de una hora, mezcle 400 microgramos de ADN plasmídico con 10,95 mililitros de agua doblemente destilada y 1,55 mililitros de cloruro de calcio dos molar en tubos de 50 mililitros uno a dos minutos antes de la transfección.Añada 12,5 mililitros de tampón salino tamponado 2x a 12,5 mililitros de la solución de calcio de ADN, mezclando mediante inversión de los tubos antes de incubar durante 30 segundos. A temperatura ambiente, agregue esta mezcla gota a gota directamente a las células, a razón de cinco mililitros por placa, distribuyéndola uniformemente sobre toda el área, lo que hará que el medio adquiera un color ligeramente anaranjado. Incube las placas de cultivo durante siete a 11 horas en un incubador de cultivo de tejidos.Tras la incubación, es visible un precipitado fino. Retire el medio de transfección. Lave cuidadosamente con PBS precalentado y agregue 20 mililitros de medio de cultivo libre de suero antes de incubar durante 72 horas en un incubador de cultivo de tejidos. Analice la eficiencia de transfección y expresión realizando una muestra del sobrenadante celular en un gel SDS-PAGE y tiñendo con comassie.Azul brillante. Para visualizar una banda de granzima. Después de la incubación, vierta los sobrenadantes del cultivo celular en tubos de 250 mililitros y límpielos mediante centrifugación.Realice una primera centrifugación para eliminar el medio de las células desprendidas. Transfiera el sobrenadante a tubos nuevos de 250 mililitros y centrifugue a 4.000 G durante 30 minutos a cuatro grados Celsius para eliminar cualquier resto de debris celular. A continuación, agregue cinco mililitros de cloruro de sodio, 6,25 mililitros de tris base y un mililitro de sulfato de níquel más 250 mililitros de sobrenadante clarificado.Filtre el sobrenadante utilizando una unidad de filtración al vacío de 500 mililitros. Equilibre una columna de cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados de níquel con tampón de unión para His. A utilizando un sistema FPLC adecuado.Luego, aplique el sobrenadante clarificado a la columna equilibrada a un flujo de 0,5 mililitros por minuto a cuatro grados Celsius. Después de aplicar el sobrenadante, lave la columna con tampón de unión his hasta que se alcance la línea base de absorbancia ultravioleta o UV. Eluya las granzimas con un gradiente lineal de 20 mililitros de ILE a un flujo de 0,5 mililitros por minuto, recolectando fracciones de dos mililitros.Analice las fracciones elucianas mediante electroforesis SDS-PAGE y tinción con kumasi. Reúna las fracciones que contienen la enzima grand en un tubo dazing. Almacene una muestra pequeña a menos 20 grados Celsius como control previo a la enteroquinasa.Añada enterocinasa a 0,02 unidades por 50 mililitros del sobrenadante inicial directamente a la fracción agrupada en el tubo de diálisis y realice diálisis durante la noche a temperatura ambiente en tampón de enterocinasa. Al día siguiente, analice la fracción tratada con cinasa en comparación con el control previo a la enterocinasa mediante electroforesis en SDS-PAGE y tinción con azul de Comassie. Cuando el procesamiento del extremo terminal esté completo.Cambie el tampón de diálisis al tampón S A y realice una diálisis adicional de cuatro horas a temperatura ambiente antes de filtrar el DIALATE ocho. A continuación, equilibre una columna S con tampón S A. Cargue la muestra en la columna a un flujo de 0,5 mililitros por minuto a cuatro grados centígrados tras la carga de la muestra.Lave la columna con tampón S A hasta que se alcance la línea base de absorbancia UV. Eluya las granzimas con un gradiente lineal de cloruro de sodio de 30 mililitros; la granzima A se eluye a aproximadamente 650 milimolar de cloruro de sodio, la granzima B a aproximadamente 700 milimolar de cloruro de sodio y la granzima M a aproximadamente 750 milimolar de cloruro de sodio. Reúna las fracciones que contienen granzimas y concéntrelas hasta aproximadamente 100 micromolar utilizando filtros de centrifugación, alícuote las preparaciones concentradas de granzima y almacénelas a menos 80 grados Celsius.A continuación, analice las fracciones elucianas mediante electroforesis SDS-PAGE y ensayos colorimétricos. Para realizar los ensayos colorimétricos, distribuya muestras pequeñas de granzima provenientes de fracciones elucianas o de stocks concentrados en placas de 96 pocillos con fondo plano. Incluya un control positivo y un control negativo. Añada 100 microlitros de tampón de ensayo a cada pocillo.Incube bien la placa durante 10 minutos a 37 grados Celsius. Finalmente, mida la densidad óptica a 405 nanómetros en un lector de microplacas. Este protocolo producirá altos rendimientos de granzimas puras, como se demuestra en este gel representativo de electroforesis SDS-PAGE teñido con kumasi que muestra la granzima BE de la columna S.Las granzimas recombinantes muestran una actividad similar a la de las preparaciones nativas de proteasas, tal como se muestra en este ensayo colorimétrico que compara la actividad de la granzima B recombinante y nativa. Es importante destacar que el tratamiento con endo H indica que las granzimas producidas en células HEC 293T están completamente glicosiladas. Las granzimas recombinantes son capaces de escindir sustratos proteicos macromoleculares, como se demuestra en este ensayo representativo de escisión por granzima A utilizando el sustrato proteico bacteriano y UOCD.Aquí, la banda que representa la N-O-U-C-D escindida desaparece lentamente con el aumento de la concentración de granzima. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo producir enzimas gran en forma completamente glicosilada y proactiva con altos rendimientos en células HK 2 93 T.

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Investigación

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Biology

Biología

En la era genómica post-humana, la disponibilidad de proteínas recombinantes en conformaciones nativas es crucial para la investigación estructural, funcional y terapéutico y el desarrollo. Aquí se describe una prueba a gran escala y sistema de expresión de proteínas en células embrionarias humanas de riñón 293T que se pueden utilizar para producir una variedad de proteínas recombinantes.

Una expresión adecuada y el general de la Plataforma para la producción de proteínas secretadas por las células humanas

La expresión de proteínas recombinantes por sistemas de mamíferos se está convirtiendo en un método atractivo para producir complejos de proteínas para biología estructural. Aquí presentamos un sistema de expresión simple pero altamente eficiente utilizando células de mamíferos cultivadas en suspensión para purificar complejos de proteínas para estudios estructurales.

Expresión de proteínas recombinantes para la Biología Estructural en HEK 293F Suspensión Células: Un enfoque novedoso y accesible

Describimos un ensayo colorimétrico cuantitativo simple que mide específicamente la actividad proteolítica de Granzima B (GzmB) humana, de ratón o de rata. Este protocolo se puede adaptar fácilmente para determinar la actividad proteasa de otras proteasas de serina en gránulos mediante la hidrólisis de otros sustratos peptídicos sintéticos con una secuencia de reconocimiento adecuada.

Un ensayo colorimétrico que mide específicamente granzima B actividad proteolítica: La hidrólisis de Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

En este estudio se comparó la expresión de una proteína recombinante humana diana en diferentes plataformas de producción. Nos centramos en los cultivos tradicionales basados en fermentadores y en las plantas, describiendo la configuración de cada sistema y destacando, sobre la base de los resultados informados, los límites y ventajas inherentes a cada plataforma.

Un Análisis Comparativo de Expresión recombinante de proteínas en diferentes Biofactorías: Las bacterias, células de insecto y Plant Systems

La expresión de proteínas de la malaria en sistemas basados ​​en células sigue siendo un reto. Demostramos dos sistemas de libre expresión de células de paso y un paso IVT (en la traducción in vitro) para expresar proteínas recombinantes rhoptry malaria a partir de células HeLa. Utilizamos un sistema de purificación basado en la afinidad de Ni-resina para purificar las proteínas rhoptry.

Sistemas basados ​​en células HeLa Expresión Libre de Expresión de<em&gt; Plasmodium</em&gt; rhoptry Proteínas

Este es un protocolo rápido y rentable para la producción de proteínas de mamíferos secretadas y glicosiladas y su posterior purificación en un solo paso con rendimientos suficientes de proteína homogénea para la cristalografía de rayos X y otros estudios biofísicos.

Efficient Expresión células de mamíferos y Single-step La purificación de glicoproteínas extracelular para la cristalización

La producción a escala de laboratorio de proteínas eucariotas con la modificación postraduccional adecuada representa una barrera significativa. Este es un protocolo robusto con un rápido establecimiento y respuesta para la expresión de proteínas utilizando un sistema de expresión de mamíferos. Este sistema admite aminoácidos selectivos, marcaje selectivo de proteínas y moduladores de moléculas pequeñas de la composición de glicanos.

High Yield La expresión de proteínas recombinantes humanos con la transfección transitoria de células HEK293 en Suspensión

La purificación de los canales iónicos es a menudo difícil, pero una vez alcanzado, pueden permitir en vitro las investigaciones de las funciones y estructuras de los canales. Aquí, describimos los procedimientos paso a paso para la expresión y purificación de proteínas de mamíferos bestrophin, una familia de Ca2 +-activa los canales de Cl– .

Expresión y purificación de los canales iónicos de mamíferos Bestrophin

Proporcionamos protocolos escalables que cubren el diseño de constructo, la transfección transitoria y la expresión y purificación de variantes de proteína huntingtina humana de longitud completa en células HEK293.

Producción eficiente y escalable de variantes completas de huntingtina humana en células de mamíferos utilizando un sistema de expresión transitoria

La purificación, diálisis y activación de His-tag se emplean para aumentar los rendimientos de la expresión de proteínas del dominio catalítico soluble y activo metaloproteinasa-3 en bacterias. Las fracciones de proteínas se analizan a través de geles SDS-PAGE.

Expresión bacteriana y purificación de la metaloproteinasa-3 de matriz humana mediante cromatografía de afinidad

Los estudios estructurales y bioquímicos de los transportadores de membrana humana requieren cantidades de miligramos de proteína estable, intacta y homogénea. Aquí describimos métodos escalables para seleccionar, expresar y purificar transportadores de solutos humanos utilizando genes optimizados para codones.

Expresión y purificación de alto rendimiento de portadores de solutos humanos para estudios estructurales y bioquímicos

Aprende a producir granzimas humanas glicosiladas y activas en células HEK293T mediante transfección con fosfato de calcio y cromatografía de afinidad. Este método eficiente facilita la investigación inmunológica.

Un alto rendimiento y sistema de expresión de costo-eficiente de granzimas humanos en células de mamífero

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