Name: Correlativa confocal y microscopía electrónica de 3D de una célula sensorial específica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Aprende el método cocem3D que combina microscopía confocal y electrónica de barrido por bloques para visualizar la ultraestructura tridimensional de células sensoriales enteroendocrinas en tejido intestinal nativo.

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Nuestro sincero agradecimiento se expresa a las siguientes personas: Dres. Sam Johnson y Benjamin Carlson del Centro de Microscopía Óptica de Duke por su ayuda con el software de visualización de datos, y la Sra. Valerie Lapham y el Dr. John M. Mackenzie, Jr. del Centro de Microscopía Electrónica de la Universidad Estatal de Carolina del Norte por su asesoramiento sobre microscopía electrónica. Agradecemos a la Dra. Elaine B. Bohórquez por su asistencia editorial. Los autores contribuyeron de la siguiente manera: DVB, SM y RAL diseñaron experimentos y analizaron los datos. DVB realizó experimentos y FH realizó la representación manual de los datos. SM es director de Renovo Neural, donde se adquirieron los datos de SBEM. DVB escribió el manuscrito y todos los autores revisaron y editaron el manuscrito final. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH R01DK091946 y el I01BX002230 de subvenciones del Departamento de Asuntos de los Veteranos a RAL y, F32DK094704, a DVB.

Todo el cuidado de los animales y los experimentos se realizaron de acuerdo con un protocolo aprobado por el Comité Institucional Animal Cuidado y Uso de la Universidad de Duke. Cocem3D se deriva de una combinación de protocolos publicados previamente 10,11 y se aplicó aquí para estudiar una célula enteroendocrina específica usando un ratón reportero PyyGFP 12. Este método se puede aplicar fácilmente a otras células de interés utilizando ratones transgénicos reportero disponibles comercialmente. El método se describe en tres secciones: microscopía confocal correlativa, bloque cara de microscopía electrónica de barrido de serie (SBEM), y datos de renderizado en 3D. Correlativa Microscopía Confocal El objetivo de esta sección es para cosechar un segmento de tejido del colon distal de dimensiones que permitan confocal correlativa e imágenes SBEM. El protocolo es el siguiente: 1. La recolección de Tejidos <ol><li> Preparar10 ml de solución / ml de heparina 50 g en PBS. </li><li> Preparar xilazina / ketamina anestésico de stock mediante la mezcla de 10 ml de ketamina (100 mg / ml) y 1 ml de xilazina (20 mg / ml). <ol><li> Diluir xilazina / ketamina agotadas 1: 4 en 0,1 M PBS. </li></ol></li><li> Preparar una 100 ml de solución de fijación que contiene 4% de paraformaldehído y 0,1% de glutaraldehído en PBS. </li><li> Anestesiar el ratón PyyGFP, de 6 a 10 semanas de edad, con una dosis letal de anestésico xilazina / ketamina. Se inyecta la anestesia por vía intraperitoneal a 0,15 ml por 20 g de peso del ratón. </li><li> Confirmar anestesia adecuada ratón apretando la cola o dedos de los pies, y el uso de la pomada en los ojos para evitar la sequedad. </li><li> Utilice un flujo de la bomba peristáltica variable para perfundir fijador intracardially 10. Con unas tijeras quirúrgicas (13 cm de longitud) corte abrir la cavidad abdominal para exponer los intestinos, el corazón y los pulmones. Mantenga corazón con pinzas de patrón estrecho curvos (longitud 12 cm) e inserte la aguja de mariposa (19 G) de la bomba peristáltica into dejó ventrículo. Inmediatamente, corte aurícula derecha con unas tijeras rectas de primavera (longitud 4 mm). Perfundir a una velocidad de 2 ml / min primero con solución de heparina durante 1 min, y luego con solución de fijación enfriado en hielo durante 15 min hasta que la cola del ratón es completamente rígida. Nota: Es muy importante para perfundir a un ritmo lento para evitar ruptura de pequeños vasos en la mucosa intestinal. Estallando de los vasos comprometerá ultraestructura del tejido. Si la perfusión es adecuada, el hígado debe palidecer en el color dentro de 3-5 min. </li><li> Usando tijeras pequeñas abren la cavidad abdominal y los impuestos especiales todo el colon desde el cruce con el ciego hasta el recto distal. Coloque el tejido en PBS enfriado con hielo. Mientras sumergida en PBS, corte abierto con pequeñas tijeras de primavera del colon a lo largo del mesenterio. </li></ol> 2. La disección y fijación de segmentos de tejido <ol><li> El uso de un bisturí, cortar cerca de 6 segmentos de tejido pequeños (2 mm 2) en el colon distal. Haga esto en una hoja oimprontas dentales f y sumergido en unas gotas de PBS. </li><li> Post-fijar los segmentos de tejido en solución fijadora durante 3 horas a 4 ° C. </li></ol> 3. Los bloques de tejido micro-disección <ol><li> Preparar 5% de baja fusión de agarosa en PBS y guárdelo en un baño de agua a 45 ° C. </li><li> Insertar los segmentos de tejido en el 5% bajo punto de fusión de agarosa utilizando un pequeño recipiente de plástico, al igual que el tamaño estándar Tissue-Tek criomolde. </li><li> Montar las secciones embebidas en un micrótomo lámina vibrante y llenar el baño tampón con helado de PBS. </li><li> Cortar 300 micras tiras de tejido en el 0,8 amplitud y 0,04 mm Velocidad / seg. Nota: En este punto, las tiras de tejido serán desalojados de la agarosa. </li><li> Vuelva a insertar 300 tiras de tejido micras de agarosa y montarlos en micrótomo perpendicularmente a la hoja de la vibratome. </li><li> El uso de un vibratome, cortar tiras de tejido con un espesor de 50 micras. Nota: Los bloques de tejido finales deben ser aproximadamente 300 micras de ancho x 50 m de espesor. Estos dIMENSIONES están optimizadas a partir de experimentos piloto que confocal mostró que el espesor de la célula enteroendocrina es entre 15-20 micras y la longitud de 30-70 nm de la neuropod. Por lo tanto, una célula entera podría estar contenida dentro de un bloque de tejido 300 micras de ancho por 50 m de espesor si la orientación de la celda es paralela a la cara del bloque de tejido. Variar estas dimensiones en función de los tejidos y células de tipo de interés. </li><li> Guarde los bloques de tejido en PBS a 4 ° C. </li></ol> 4. confocal de imágenes <ol><li> Preparar una solución de tinción nuclear DAPI diluyendo en PBS a 1: 4000. </li><li> Incubar bloques de tejido en tinción nuclear DAPI durante 5 min. Nota: DAPI facilita las células individuales que distinguen por sus núcleos, lo cual es útil para correlacionar las imágenes confocal y SBEM. </li><li> Bloques de tejido de montaje sobre portaobjetos de vidrio cargada, añadir unas gotas de PBS, y se cubren con un cubreobjetos. </li><li> Utilizando un microscopio confocal, identificar bloques con vellosidades intactas y células PyyGFP de interés y les fotografiada para obtener z-pilas secciones ópticas. <ol><li> Utilice un objetivo 20X / 0.8 Zeiss Plan de Apochromat obtener z-pilas de 1 micras secciones ópticas. </li><li> Para el z-stack, utilizar los canales de 405 nm (DAPI) para determinar la relación a otras células, 488 nm GFP endógeno para localizar la célula de interés, y el contraste de interferencia diferencial (DIC) para determinar la ubicación relativa de la celda a la lumen. </li><li> Utilice resolución de imagen de 1024 píxeles o superior. </li></ol></li></ol> 5. Bloques de integración en agarosa <ol><li> Preparar 10 ml de fijador que contiene 4% de paraformaldehído y 2,5% de glutaraldehído en PBS. </li><li> Retire los bloques de tejido de la lámina de vidrio mediante la adición de PBS cuidadosamente en los bordes de la hoja de la cubierta para deslizar el cubreobjetos lejos de la lámina de vidrio sin dañar el bloque de tejido. A continuación, utilice un pincel de arte fino para transferir el bloque de tejido de la diapositiva a una 10,5 ml tubo de microcentrífuga que contiene 4% de paraformaldehído y 2,5% fijador de glutaraldehído. </li><li> Bloques de tejido post-fix O / N a 4 ° C. </li><li> Transferir bloques de tejido de PBS. A continuación, incrustar bloques planos en el 5% bajo punto de fusión de agarosa intercalando ellos entre dos láminas de vidrio. Nota: Incorporación de los bloques en una capa delgada de agarosa facilita la manipulación posterior durante la tinción. </li><li> Cortar la agarosa en una plaza y hacer una muesca en el lado superior. Nota: Este paso es necesario para mantener la orientación en los pasos posteriores. </li><li> Cuadras de las tiendas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con PBS a 4 ° C hasta su posterior procesamiento. </li></ol> Bloque cara de serie Microscopía Electrónica de Barrido (SBEM) En esta sección, se prepara el bloque de tejido y fotografiado con SBEM a baja magnificación. La imagen de encuesta de la cara del bloque se correlaciona entonces con los datos confocal para identificar la región que contiene la célula de interés. Una vez que la regiónse identifica, el tejido es proyectado en una resolución de 7 nm / pixel y rodajas de 70 nm. Esto fue suficiente para resolver y distinguir-denso grandes vesículas secretoras de núcleo de otros orgánulos. En las células enteroendocrinas, este tipo de vesículas varía entre 100 y 150 nm de diámetro 13. El protocolo es el siguiente: 6. Las secciones de tejido de tinción <ol><li> Retire el tejido de PBS y enjuagar tres veces, 5 minutos cada uno, en tampón cacodilato 0,1 M. </li><li> Bloques de la mancha de ácido tánico 1 h en 0,1% se disolvieron en tampón cacodilato 0,1 M para mejorar el contraste de las membranas celulares 14. </li><li> Llevar a cabo la posterior tinción y la deshidratación del tejido de acuerdo con el protocolo publicado 11. Siguiendo Deerinck et al. protocolo, preparar estas soluciones: 1) 1% (w / v) thiocarbonhydrazide (THC); 2) llevar solución aspartato; 3) acetato de uranilo al 1%, y 4) ferrocianuro tetraóxido de osmio / potasio (OsO4 / K Ferrocianuro). Mezcle 4% OsO4 y 2xK Ferrocianuro social [0,3 g K Ferrocianuro y 0,86 g de Na cacodilato en 10 ml de H2O] en proporción 1: 1 para hacer OsO4 / K Ferrocianuro. Nota: Tener el tejido embebido en agarosa facilita la manipulación durante la tinción. Retire con cuidado de agarosa para la infiltración de resina posterior. </li><li> Muestras Enjuague tres veces, 5 minutos cada uno, en tampón cacodilato 0,1 M y luego se tiñen con una solución de OsO4 / K Ferrocianuro durante 2 horas a 4 ° C. </li><li> Enjuague con agua ultra pura tres veces, 5 minutos cada uno, y la mancha con TCH durante 30 minutos a 60 ° C. </li><li> Enjuague en agua ultra pura tres veces, 5 min cada uno y las manchas con un 2% OsO4 (sin K Ferrocianuro) durante 60 minutos a temperatura ambiente. Enjuague de nuevo en agua ultra pura tres veces, 5 min cada uno. </li><li> Mancha con 1% de acetato de uranilo O / N a 4 ° C. Enjuague en agua ultra pura tres veces, 5 minutos cada uno. </li><li> Mancha con aspartato de plomo durante 30 min a 60 ° C. Enjuague en agua ultra pura tres veces, 5 minutos cada uno. </li><li> Deshidratar tejidos mediante lavado en solutions con concentraciones crecientes de etanol. Enjuague 2 veces, 5 minutos cada uno, con 50%, 75%, 85%, 95%, etanol absoluto y 100%. Al final, enjuague secciones con óxido de propileno dos veces, 10 min cada uno. </li></ol> 7. infiltrante y incrustación de tejidos Secciones en resina <ol><li> Infíltrate en los bloques de resina utilizando el kit comercialmente avaialble. Tejidos Insertar en resina utilizando un kit de empotramiento epon. Preparar una mezcla de resina de 48% Epoxy, 20% DDSA ml, 30 ml NMA%, y 2% DMP30. Agite la mezcla de resina vigorosamente durante 5 minutos y luego colocar la mezcla en vacío durante 30 minutos para permitir que las burbujas que salen a la superficie. </li><li> Mezclar la resina con óxido de propileno en proporción 1: 1 y agitar vigorosamente. Retire el enjuague final de la deshidratación de los tejidos, y añade resina mezclada con óxido de propileno. Lugar vial con muestras en un rotador O / N y dejar vial destapado. El día siguiente, añadir resina EPON recién hecho y se mezcla durante 90 min en los rotadores. </li><li> Insertar en bloques de resina lo más plana posible por intercalando enentre portaobjetos de vidrio que han sido curados con agente de liberación de líquido para evitar que se peguen entre sí 15. </li><li> Una vez que los bloques están incrustados plana, curar los bloques para una adición 48 horas a 60 ° C. </li><li> Tire de diapositivas aparte de liberar los bloques. </li></ol> 8. Montaje y Recorte de Tejidos Bloque de Imagen <ol><li> Bajo un microscopio de disección, que coincida con la orientación de los bloques de tejido embebido en resina con el de las micrografías confocales para facilitar la identificación de las regiones que contienen las células de interés antes de recortar el bloque. </li><li> Recorte el bloque de resina incrustado manualmente hasta un m bloque cara ~ 500 x 500. </li><li> Monte el bloque plano en un perno que contiene epoxi conductora y seco durante 30 min. Luego, coloque el bloque plano sobre una superficie seca y O / N a 60 ° C. </li><li> Escudo del bloque con el líquido de plata coloidal. Mantener las secciones de tejido plano para asegurar el corte en lonchas del bloque en ángulo recto para facilitar la correlating los bloques de la cara y micrografías confocales en serie. </li></ol> 9. SBEM <ol><li> Image el bloque usando un microscopio de barrido de electrones equipado con un sistema SBEM (e .g., 3Ver). </li><li> Establecer sección espesor inicial en ~ 2 micras incrementos y cortar hasta que la cara del tejido se desprende del bloque. </li><li> Adquirir una imagen Surver de toda la cara del bloque. </li><li> Uso de software de Fiji, tomar mediciones tanto del bloque de cara de serie y confocal micrografías para generar un denominador común y cuenta para la muestra deformaciones durante la fijación y tinción de 16. </li><li> Localice el área de interés en la cara del bloque multiplicando el denominador de las coordenadas en las imágenes confocal. Utilice también otras características estructurales, como la posición de las microvellosidades, células caliciformes o lámina propia, como una referencia. </li><li> Imagen de la región de interés a un 2,25 kV y 7 nm / pixel (o ampliación 15,147X) en el modo de vacío de alta. Incrementos Slice deben establecerseen 70 nm o menos. </li><li> Recopilar datos SBEM en formato .dm3 prima de 16 bits. </li></ol> 10. Optimización SBEM Imágenes en Segmentación de superficie <ol><li> Convertir imágenes SBEM de formato .dm3 prima de 8 bits .tiff. </li><li> Filtra .tiff imágenes utilizando un filtro de 0,8 desenfoque gaussiano en Fiji. </li><li> Escala hacia abajo el conjunto de datos al 25% del tamaño original y guardarlo como una pila .tiff para reducir al mínimo la cantidad de memoria RAM necesaria para manejar el juego. </li><li> Alinee la pila de imágenes SBEM utilizando el plugin Fiji &quot;alineación pila lineal con SIFT&quot; en el modo de traducción y cosechado usando el plugin &quot;3D de cultivos&quot;. Nota: El recorte ayuda a reducir aún más la cantidad de memoria RAM necesaria para la segmentación y la representación de volumen. </li></ol> Representación de datos en 3D 11. Microscopía Confocal <ol><li> Reconstruir z-pilas utilizando el modo automático de la herramienta &quot;superficies&quot; superan. Figura 1D, muestra una reconstrucción de cada canal utilizando la opción suave en el área de detalle de las superficies a 0.126 m, y de umbral como la intensidad absoluta. </li></ol> 12. Serie Bloque cara SEM Nota: la segmentación manual de datos es un proceso muy lento y en función de las características para ser prestados el procedimiento puede tardar varias semanas. La segmentación de los videos y las cifras presentadas en Bohórquez et al. 2014 8 se realiza de forma manual y tomó cerca de 500 horas de mano de obra. Se recomienda dar prioridad a las características esenciales que necesitan representación antes de comenzar el proceso de segmentación. El procedimiento es el siguiente: <ol><li> Utilice la herramienta de &quot;superficies&quot; en el modo de sorteo y la opción &quot;contorno&quot; en el modo de 50 ms dibujo segmentar manualmente y el volumen prestado la célula de interés. </li><li> Trazar contorno en cada rebanada de la célula para la representación más suave o cada 5 rebanadas de renderizado más rápido. </li><li> Exportación im definitivaedades utilizando la herramienta &quot;instantánea&quot; con una resolución de 300 dpi o más. </li></ol>

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</ol>

Dr. Satish Medicetty es un empleado del 100% y recibe sueldo de Renovo Neural Inc; Sin embargo, esto no altera la adherencia del autor a las políticas JoVE en los datos y materiales de uso compartido. Sin conflicto de intereses se declara para los autores restantes.

<html> Chemosensation Gastrointestinal está surgiendo como un nuevo campo emocionante en la investigación biomédica. Esto es en gran parte debido al descubrimiento de los receptores del gusto funcionales en las células enteroendocrinas 18. Estudios posteriores han demostrado que las células enteroendocrinas expresan receptores específicos para nutrientes, incluyendo hidratos de carbono, lípidos y aminoácidos 5,6,19,20. El factor catalítico para estos descubrimientos ha sido el desarrollo de los ratones reportero, en el que las células enteroendocrinas están etiquetados con fluorescencia 20. Hemos desarrollado uno de estos ratones, el ratón PyyGFP, para estudiar las células enteroendocrinas del intestino delgado y el colon distal 17,21. Estas células son de interés debido a que secretan PYY y péptido similar al glucagón 1, ambos de los cuales son inductores de saciedad 22,23. En ese momento, una cuenta de ultra-estructural completa de estas células faltaba, lo que creíamos era esencial para comprender sus mecanismos de señalización. ontenido &quot;&gt; En este sentido, describe un visualmente un método para superar la microscopía confocal con SBEM. El método se conoce como Cocem3D, lo que nos permitió documentar la ultraestructura completa de las células enteroendocrinas. Nos han informado de que estas células tienen una neuropod que contiene tres cuartas partes de todas las vesículas secretoras 8. Dentro del neuropod, hay neurofilamentos y al igual que los axones neuronales, neuropods se nutren de las células gliales entéricas 8. Más importante, es cuando estos neuropods que enteroendocrinas células se conectan físicamente a las neuronas que inervan el intestino y 9 de colon. Uno de los puntos fuertes de cocem3D es su simplicidad. La reducción de la muestra de tejido en un bloque que puede ser imaginada por confocal y SBEM facilita la identificación de una celda específica dentro de un tejido. Vesículas secretoras y otros orgánulos se pueden identificar con facilidad a una resolución de 7 nm / pixel. Debido a que las secciones en SBEM se descartan, más procescantar de los tejidos para identificar proteínas específicas no es una opción en este momento. Sin embargo, el desarrollo de métodos tales como ATUM 24, en el que se conservan las secciones del bloque de tejido, es probable que permitir la identificación de proteínas específicas en la célula. La determinación de la ubicación específica de los receptores quimiosensoriales en células enteroendocrinas es información esencial para el desarrollo de terapias de fármacos para la obesidad, porque las células enteroendocrinas son una interfaz sensorial entre la comida en el intestino y la saciedad en el cerebro.

La vida interior de una célula tiene lugar en el tiempo y el espacio. Cambios en el tiempo se estudian a menudo utilizando microscopía de lapso de tiempo combinado con técnicas de imagen de fluorescencia, como super-resolución microscopía. Espacio, en particular la disposición de los orgánulos dentro de una célula o interacciones célula a célula, sólo puede ser derivada por una cuenta completa de la estructura fina de la célula. Una relación completa de la estructura fina de una célula también puede aportar claridad a la función genómica en los casos en que el genoma está disponible, al igual que el C. elegans nematodos 1 o la tricoplax Placozoa plana adherentes 2. Microscopía electrónica de seccionamiento de serie es ahora un reproducible, eficiente en tiempo, y menos costosos de trabajo gracias al desarrollo de tecnologías automatizadas de microscopía electrónica 3D, como bloque cara de serie microscopía electrónica de barrido 3 (SBEM). La necesidad de información estructural de la función dilucidar es muy evidente en cierta cell tipos en función depende de las interacciones físicas de célula a célula, tales como neuronas, células gliales, o células epiteliales sensoriales. Estamos particularmente interesados ​​en la aclaración de cómo las señales sensoriales de los nutrientes en el lumen del intestino se transducen en una señal eléctrica que modula en última instancia comportamientos apetitiva. El circuito es compleja, pero comienza en la pared del intestino donde los nutrientes entran en contacto con las células epiteliales sensoriales, llamadas células enteroendocrinas. A diferencia de otras células epiteliales sensoriales, tales como las células gustativas, las células enteroendocrinas están dispersos por todo el epitelio intestinal en una proporción de uno a mil 4-7. En consecuencia, han sido difíciles de identificar y estudiar, y por mucho tiempo fueron vistos sólo como una fuente de hormonas intestinales. Pero con el desarrollo de los ratones reportero de fluorescencia de células específicas, la función sensorial complejo de estas células está emergiendo. Utilizando uno de estos ratones reportero, un YY-GFP (PyyGFP) ratón péptido, se encontró que enteroendocrine células tienen una cola citoplasmática prominente que nombramos neuropod. La aparición de neuropods sugiere una función conservada en la comunicación de célula a célula. Por lo tanto, razonó que mediante la documentación de la ultraestructura de una célula enteroendocrina, la función de neuropods podría derivarse. La necesidad de comprender la estructura de un apéndice en una célula dispersa que es difícil de identificar fue la razón principal para el desarrollo de un método para combinar la microscopía confocal y SBEM. La célula de interés se identificó utilizando ratones informadora de célula específica PyyGFP enteroendocrina. El método nos permitió documentar toda la ultraestructura de una célula enteroendocrina y su neuropod. Dentro neuropods, encontramos características estructurales de los axones neuronales, y fuera neuropods, encontramos una relación física con la glía entérica 8. De hecho, neuropods contienen aproximadamente 70% de todas las vesículas secretoras que sugieren un papel esencial en la función secretora de estas células. Basándose en eldatos estructurales, más recientemente, se encontró que a través de estos neuropods, células enteroendocrinas y las neuronas que inervan el intestino formar un circuito neuroepitelial, similar a la de las células gustativas en la lengua 8,9. El descubrimiento de estas características de los mecanismos chemosensory gastrointestinales tallo de datos estructurales reunió con este método de microscopía correlativa. Creemos que este método podría ser útil en otras áreas de la biología celular, en particular cuando las células se dispersan dentro de los tejidos en una proporción muy baja. Nos referimos al método como confocal correlativa y la cara del bloque de microscopía electrónica de barrido de serie en 3D (Cocem3D). El método se compone de los siguientes pasos principales: la disección de tejidos, microscopía confocal, imagen SBEM, SBEM y correlación de imágenes confocal, y la segmentación manual. En comparación con otros métodos correlativos, el concepto es bastante simple debido a que la correlación es física en lugar de química.

<table><tbody><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Life technologies</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Heparina sal sódica</td><td>Sigma</td><td>H4784</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>4%, recién hecho en PBS, pH final 7.4</td></tr><tr><td>Glutaraldehído</td><td>Sigma</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Cera dental</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>72660</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa de bajo punto de fusión</td><td>Life technologies</td><td>16520-100</td><td>5%, recién hecho en PBS</td></tr><tr><td>Standard Tissue-Tek Cryomold</td><td>Electrónica Microscopía Ciencias</td><td>62534-25</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp; tinte nuclear</td><td>Life technologies</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos y cubreobjetos</td><td></td><td></td><td></td>de vidrio cargados positivamente</tr><tr><td>Pincel de bellas artes #1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampón de cacodilato</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>11650</td><td></td></tr><tr><td>Ácido tánico</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>21700</td><td></td></tr><tr><td>EMbed 812 kit&nbsp;</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>Agente liberador de líquidos&nbsp;</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica</td><td>70880</td><td></td></tr><tr><td>Plata líquida coloidal&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica</td><td>12630</td><td></td></tr><tr><td>CircuitWorks epoxi conductor&nbsp; &nbsp;</td><td>ITW Chemtronics</td><td>CW2400</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica de caudal variable</td><td>VWR</td><td>70730-064</td><td></td></tr><tr><td>VT1200S Microtomo de cuchilla vibratoria Microscopio</td> confocal <td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 780i</td><td>Carl Zeiss&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de barrido Sigma VP&nbsp;</td><td>Carl Zeiss&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema 3view</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Renovo Neural Inc (Cleveland, OH)</td><td></td><td>http://www.renovoneural.com</td><td>Renovo proporciona servicios EM 3D</td></tr><tr><td>Software de Fiji</td><td>Software</td><td></td><td></td>de acceso abierto</tr><tr><td>Estación de computadora con 16 GB de RAM o más</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>software de visualización de datos Imaris 7.5&nbsp;</td><td>Plano de bits</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

correlativa confocal y microscopía electrónica de 3d de una célula sensorial específica

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Delineación de la ultraestructura de una célula es importante para la comprensión de su función. Esto puede ser un proyecto de enormes proporciones para tipos de células raras difundido a través de los tejidos hechos de diversos tipos de células, tales como células enteroendocrinas del epitelio intestinal. Estos sensores gastrointestinales de alimentos y bacterias han sido difíciles de estudiar debido a que se dispersan entre otras células epiteliales en una proporción de 1: 1000. Recientemente, los ratones transgénicos reportero se han generado para identificar células enteroendocrinas por medio de fluorescencia. Uno de ellos es el péptido YY-GFP ratón. El uso de este ratón, hemos desarrollado un método para correlacionar confocal y el bloque cara microscopía electrónica de barrido de serie. Hemos llamado el método cocem3D y aplicamos para identificar una célula enteroendocrina específico en el tejido y desvelar ultraestructura de las células en 3D. La resolución de cocem3D es suficiente para identificar orgánulos tan pequeño como vesículas secretoras y para distinguir las membranas celulares para el volumen de rendering. Cocem3D se puede adaptar fácilmente para estudiar la ultraestructura 3D de otros tipos de células específicos en su tejido nativo.

El método presentado aquí se utilizó para estudiar la ultraestructura de una celda específica dentro de una capa de epitelio. La célula de interés en este caso es la célula enteroendocrina difícil de alcanzar. Su identificación in situ ha sido posible sólo en los últimos años con el desarrollo de los ratones reportero de fluorescencia de células específicas. En 2011, hemos desarrollado un ratón en el que el promotor de la hormona PYY impulsa la expresión de la proteína verde fluorescente 17. En este ratón PyyGFP, células enteroendocrinas de la parte distal del intestino delgado y el colon se distinguen fácilmente bajo la luz ultravioleta. Este modelo de ratón fue una base para identificar un bloque de tejido que contiene una célula enteroendocrina y procesarla para SBEM. El método de correlación se conoce aquí como cocem3D y fue construido en los protocolos publicados previamente 10,11. La optimización de las dimensiones del bloque de tejido es crítica para la correlación. En experimentos preliminares,se determinó que en un bloque de tejido 300 m de largo x 50 m de espesor el número de imágenes SBEM se reduce a un mínimo al tiempo que cubre todo el cuerpo de la célula de interés. La Figura 1A muestra una vista panorámica de la disección utilizando una cuchilla que vibra a microtrome obtener el bloque de tejido con las dimensiones adecuadas. Al menos 100 bloques se obtuvieron antes de la clasificación a través de ellos para recoger aquellos con células intactas de interés. Bloques seleccionados se crean imágenes por microscopía confocal y de imagen z-pilas están separadas ópticamente cada 1 m (Figura 1B y C). La figura 1D muestra una vista renderizada volumen de una célula enteroendocrina en el íleon del ratón. Su neuropod prominente extiende por debajo de las células epiteliales para ~ 60 micras. La célula de interés se encuentra mediante la correlación de los confocal z-pilas una imagen SBEM de toda la cara del bloque con. Un ejemplo se presenta aquí de un bloque en el colon distal de un PyyGFPratón. Después de obtener confocal z-pilas (Figura 2a), el bloque está incrustado en una capa delgada de agarosa de bajo punto de fusión (Figura 2B). Esto es necesario para la posterior manipulación del bloque. Es importante mantener la orientación del bloque lo más plana posible para que coincida con las rodajas ópticas con las rodajas SBEM. En la Figura 2C, una imagen representativa se muestra de toda la cara del bloque de tejido. Partes de esta cifra se publicaron anteriormente en Bohorquez et al., 2014 8. Esta se correlacionó posteriormente con la imagen confocal, tomando en cuenta las señales de tejido y dimensiones. Figura 2D muestra una superposición de la imagen SBEM confocal y de la manzana, que revela la ubicación precisa de nuestra célula de interés. Una vez que la célula ha sido identificado, SBEM de imágenes se realiza en una resolución lo suficientemente alta para identificar vesículas secretoras y otros orgánulos celulares. El conjunto de datos que presentóre fue fotografiada en 7 nm por píxel como imágenes de la cuadra se tomaron cada 70 nm. El conjunto de datos contenían 643 imágenes que abarcan 45 m de la profundidad del tejido. A pocas micras se afeitan durante la exploración inicial de toda la cara del bloque a bajo aumento. El conjunto de datos SBEM prima fue adquirida en formato .dm3 y transformado a .tiff para la manipulación posterior. La pila SBEM fue recortada utilizando el software Fiji plugin &quot;de cultivos (3D)&quot; bloque que quede únicamente la región de interés. Esto reduce la cantidad de memoria RAM necesaria para la representación de volumen. La célula fue identificado por su posición y vesículas secretoras, y segmentado usando software Imaris. La figura 3 contiene una representación en 3D de la célula enteroendocrina. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52918/52918fig1.jpg" /> Figura 1:. Microscopía confocal correlativa (A) de flujo de trabajo para diseccionar un pedazo detejido intestinal en un tejido bloque 300 x 50 m de espesor. (B) Un bloque de tejido representativo de las dimensiones correctas. Tenga en cuenta que un bloque de tejido de estas dimensiones desde el intestino delgado de ratón abarca aproximadamente 3 vellosidades o, en el caso de los dos puntos sobre 8 criptas. (C) Una de las vellosidades en el intestino delgado que contiene una célula de interés. (D) Un confocal z-pila rendido en 3D usando el software Imaris muestra una célula enteroendocrina con un neuropod prominente corriendo debajo del epitelio intestinal. Azul = DAPI mancha nuclear. Bares = 10 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52918/52918fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52918/52918fig2.jpg" /> Figura 2: Bloque cara microscopía electrónica de barrido de serie (A) Imagen confocal de un sele.Dirección Ejecutiva bloque de tejido del colon que contiene células PyyGFP enteroendocrina (verde) de interés. (B) Una vez que el bloque se forma la imagen por microscopía confocal, se incrusta entonces plana en bajo punto de fusión de agarosa utilizando portaobjetos de vidrio. La reproducción del bloque de tejido en agarosa facilita la manipulación posterior, y la muesca en la esquina izquierda de ayuda para montar el bloque dentro del SBEM en la orientación correcta. (C) SBEM imagen de la cara del bloque. (D) Correlación de datos confocal con SBEM para identificar célula de interés (flecha blanca). Imágenes en cyd de esta figura son modificados de Bohórquez et al., 2014 8. Azul = tinción nuclear DAPI. Bares = 10 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52918/52918fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52918/52918fig3.jpg" /> Figura 3:. Datos renderizado en 3D (A) Interpretación de volumen de célula enteroendocrina utilizando software Imaris. La celda contiene un neuropod lleno de vesículas secretoras. Para una descripción completa de la ultraestructura de una célula enteroendocrina, consulte Bohórquez et al., 2014 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52918/52918fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí, presentamos un método, cocem3D, para revelar la ultraestructura de una célula específica en su tejido nativo mediante la combinación de microscopía electrónica de barrido confocal y serial de cara de bloque.

Correlativa confocal y microscopía electrónica de 3D de una célula sensorial específica

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

El objetivo general de este procedimiento es documentar la ultraestructura completa de una célula sensorial específica del intestino dispersa entre otras células epiteliales en tejido intestinal nativo. Esto se logra primero obteniendo un segmento de tejido de 300 por 50 micrones del intestino. A continuación, se obtienen pilas ópticas Z del segmento mediante microscopía confocal.Luego, los datos confocales sirven como guía para procesar e imaginar el tejido mediante microscopía electrónica de barrido de superficie de bloque seriada o SBEM. Finalmente, los datos de SBEM se segmentan para representar la ultraestructura de una célula sensorial específica del intestino en 3D. En última instancia, microscopía confocal correlativa y microscopía electrónica de barrido de superficie de bloque seriada.La microscopía electrónica se utiliza para mostrar una célula específica en su tejido nativo y revelar su estructura ultrafina en 3D. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología celular, como las interacciones específicas entre célula y célula que de otro modo no podrían visualizarse a nivel de microscopía óptica. Mediante el uso de este método, previamente informamos una relación química física oculta entre las células endocrinas entero sensoriales y el enter ggl.Después de aislar el colon de ratón, según el protocolo descrito, colóquelo en PBS frío y, mientras está sumergido, corte el tejido longitudinalmente a lo largo del mesenterio. Transfiera el tejido a unas gotas de PBS sobre una lámina de cera dental y, utilizando un escalpelo, corte aproximadamente seis segmentos pequeños de tejido del colon distal. Después de preparar agarosa al 5 % de punto de fusión bajo en PBS, úsela para embeber los segmentos de tejido en un recipiente plástico pequeño, como un molde criogénico estándar de Tissue-Tek. Monte las secciones embebidas en un microtomo de cuchilla vibrante y llene la bandeja de tampón con PBS frío. A continuación, corte tiras de tejido de 300 micrones de grosor con una amplitud de 0,8 y una velocidad de 0,04 milímetros por segundo.Recoja las tiras de tejido de 300 micrones en haces y monte las perpendicularmente a la cuchilla en un micrótomo. Luego, corte las tiras de tejido a un grosor de 50 micrones, consultando el protocolo descrito en el texto para obtener más detalles, antes de almacenar los bloques en PBS a cuatro grados Celsius. Después, image los bloques de tejido mediante microscopía confocal según el protocolo descrito en el texto, para infiltrar y embeber las secciones de tejido en resina.Retire el tejido del PBS y utilice tampón coate a 0,1 molar para enjuagarlo tres veces durante cinco minutos cada vez. Una vez que se haya preparado la resina y los tejidos se hayan teñido para microscopía electrónica, según el protocolo descrito en el texto, úsela para colocar los bloques de tejido entre portaobjetos de vidrio tratados con un agente liberador líquido; después de que los bloques de tejido hayan sido incluidos, realice un curado plano durante 48 horas adicionales a 60 grados Celsius. Luego, separe los portaobjetos para liberar los bloques bajo un microscopio estereoscópico y coincida la orientación de los bloques de tejido incluidos en resina con la de las micrografías confocales.Para facilitar la identificación de las regiones que contienen las células de interés, monte el bloque plano sobre un pin que contenga epoxi conductor y seque durante 30 minutos. Luego coloque el bloque plano sobre una superficie y séquelo durante la noche a 60 grados Celsius al día siguiente. Recubra el bloque con líquido de plata coloidal.Mantenga las secciones de tejido planas para garantizar el corte del bloque en el ángulo adecuado, lo que facilitará la correlación entre las micrografías de la superficie del bloque seriado y las micrografías confocales. Después de realizar la microscopía electrónica de barrido según el protocolo descrito, convierta las imágenes de SPEM del formato DM sin procesar a imágenes TIFF de ocho bits utilizando un filtro de desenfoque gaussiano de 0,8 en Fiji. Filtre las imágenes TIFF.Reduzca el conjunto de datos al 25 % de su tamaño original y guárdelo como una pila TIFF para minimizar la cantidad de memoria RAM necesaria para manejar el conjunto de datos con el complemento Fiji de alineación lineal de pilas mediante sift en modo de traslación. Alinee la pila de imágenes SPEM y utilice el complemento crop 3D para recortarlas. Para representar los datos, use la herramienta de superficies en modo de dibujo y la opción de contorno en modo de dibujo de 50 milisegundos para segmentar manualmente y representar en volumen la célula de interés.Dibuje los contornos en cada corte de la célula para una representación más suave o en cada cinco cortes para una representación más rápida. Utilice la herramienta de instantánea para exportar las imágenes finales con una resolución de 300 DPI o superior utilizando el ratón P-Y-Y-G-F-P. Todas las células enteroendocrinas de la parte distal del intestino delgado se identifican y procesan para SBEM como se muestra aquí.Un segmento de tejido seleccionado fue imagenado mediante microscopía confocal para obtener imágenes Zack, que están espaciadas ópticamente un micrón entre sí. Optimizar las dimensiones de los bloques de tejido es fundamental para la correlación topográfica entre los datos confocales y los de SBEM. Esta vista del volumen renderizado de una célula enteroendocrina en el íleon del ratón muestra un neuropodo prominente extendido debajo de las células epiteliales aproximadamente 60 micrones.Al correlacionar las pilas Z confocales con una imagen SBEM de toda la superficie del bloque, aquí se identifica la célula de interés en un bloque proveniente del colon distal de un ratón A-P-Y-Y-G-F-P. Es importante mantener la orientación del bloque lo más plana posible para que coincida con las secciones ópticas en las imágenes SBEM. Una vez identificada la célula, se realiza la imagenología SBEM con una resolución suficientemente alta como para identificar los conductos secretorios y otros orgánulos celulares.Este video contiene una representación en 3D de la célula enteroendocrina. El conjunto de datos contiene 643 imágenes que abarcan 45 micrones de profundidad del tejido. La célula contiene un neuropodo repleto de vesículas secretoras, así como microvellosidades.Después de ver este video, debería tener una comprensión clara de cómo documentar la ultraestructura completa de una célula sensorial específica del intestino dispersa entre otras células epiteliales en tejido intestinal nativo, utilizando la fluorescencia como guía para identificar la(s) célula(s) de interés y procesar el tejido para microscopía electrónica de barrido en serie por fase de bloque.

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Investigación

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Biology

Biología

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