Correlativa confocal y microscopía electrónica de 3D de una célula sensorial específica

El objetivo general de este procedimiento es documentar la ultraestructura completa de una célula sensorial intestinal específica dispersa entre otras células epiteliales en el tejido intestinal nativo. Esto se logra obteniendo primero un segmento de tejido de 300 por 50 micras del intestino. A continuación, se obtienen pilas ópticas Z del segmento mediante microscopía confocal.

Luego, los datos confocales sirven como guía para procesar y obtener imágenes del tejido mediante microscopía electrónica de barrido facial de bloque en serie o SBEM. Por último, los datos de SBEM se segmentan para representar en 3D la ultraestructura de una célula sensora intestinal específica. En última instancia, microscopía confocal correlativa y escaneo facial de bloques en serie.

La microscopía electrónica se utiliza para mostrar una célula específica en su tejido nativo y revelar su ultraestructura en 3D. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología celular, como las interacciones específicas de célula a célula que no podrían visualizarse de otra manera a nivel de microscopía óptica. Mediante el uso de este método, previamente informamos de una relación físico-química oculta entre las células endocrinas sensoriales y las ggl entrantes.

Después de aislar el colon del ratón, de acuerdo con el protocolo de texto, colóquelo en un PBS frío y agradable y, mientras está sumergido, corte el tejido a lo largo del mesentario, transfiera el tejido a unas gotas de PBS en una hoja de cera dental y, con un bisturí, maldiga unos seis pequeños segmentos de tejido del colon distal. Después de preparar aros de bajo punto de fusión al 5% en PBS, úselo para incrustar los segmentos de tejido en un pequeño recipiente de plástico, como el molde criogénico de tecnología de tejido de tamaño estándar, monte las secciones incrustadas en un micrótomo de cuchilla vibratoria y use PBS helado para llenar la bandeja tampón. A continuación, corte tiras de tejido de 300 micras a 0,8 de amplitud y a una velocidad de 0,04 milímetros por segundo.

Enrolle las tiras de tejido de 300 micras en aros y móntelas en un microtono perpendicular a la hoja. A continuación, corte tiras de tejido de un grosor de 50 micras, consultando el protocolo de texto para obtener más detalles, antes de almacenar los bloques en PBS a cuatro grados centígrados. Después de obtener imágenes de bloques de tejido mediante microscopía confocal de acuerdo con el protocolo de texto para infiltrar e incrustar secciones de tejido en resina.

Retire el tejido de PBS y use un tampón de co coato de 0,1 molares para enjuagarlo tres veces durante cinco minutos cada una. Una vez que se ha preparado la resina y se han teñido los tejidos para microscopía electrónica, de acuerdo con el protocolo de texto, utilícela para intercalar bloques de tejido entre portaobjetos de vidrio curados con un agente de liberación líquido después de que se hayan incrustado los bloques de tejido, cure los bloques en plano durante 48 horas adicionales a 60 grados Celsius. A continuación, separe los portaobjetos para liberar los bloques bajo un endoscopio de disección, haga coincidir la orientación de los bloques de tejido incrustados en resina con la de las micrografías confocal.

Para facilitar la identificación de las regiones que contienen las celdas de interés, monte el bloque plano sobre un alfiler que contenga un epoxi conductor y seque durante 30 minutos. A continuación, coloque el bloque sobre una superficie y séquelo durante la noche a 60 grados centígrados al día siguiente. Cubra el bloque con líquido de plata coloidal.

Mantenga las secciones de tejido planas para asegurar el corte del bloque en el ángulo correcto para facilitar la correlación de la cara del bloque en serie y las micrografías confocal. Después de llevar a cabo la microscopía electrónica de barrido de acuerdo con el protocolo de texto, convierta las imágenes SPEM de formato DM de tres bits en bruto a imágenes TIFF de ocho bits utilizando un filtro de desenfoque gaussiano de 0,8 en Fiji. Filtra las imágenes TIFF.

Reduzca la escala del conjunto de datos al 25% del tamaño original y guárdelo como una pila TIFF para minimizar la cantidad de memoria RAM necesaria para manejar el conjunto de datos con la alineación de pila lineal del complemento Fiji con tamizado en modo de traducción. Alinee la pila de imágenes SPEM y utilice el complemento crop 3D para recortarlas. Para representar los datos, utilice la herramienta superficies en el modo de dibujo y la opción de contorno en el modo de dibujo de 50 milisegundos para segmentar y renderizar manualmente el volumen de la celda de interés.

Traza contornos en cada porción de la celda para una representación más suave o cada cinco secciones para una representación más rápida. Utilice la herramienta de instantáneas para exportar las imágenes finales a una resolución de 300 ppp o más con el ratón P-Y-Y-G-F-P. Todas las células enteroendocrinas de la parte distal del intestino delgado se identifican y procesan para SBEM como se muestra aquí.

Se obtuvieron imágenes de un segmento de tejido seleccionado mediante microscopía confocal para obtener imágenes de Zack, que están espaciadas ópticamente a una micra de distancia. La optimización de las dimensiones de los bloques de tejido es fundamental para la correlación topográfica entre los datos confocales y SBEM. Esta vista de una célula enteroendocrina en el íleon del ratón muestra una vaina neurológica prominente extendida por debajo de las células epiteliales de aproximadamente 60 micras.

Al correlacionar las pilas Z confocales con una imagen SBEM de toda la cara del bloque, la celda de interés se identifica aquí en un bloque del colon distal del ratón A-P-Y-Y-G-F-P. Es importante mantener la orientación del bloque lo más plana posible para que coincida con los cortes ópticos de las imágenes SBEM. Una vez que se ha identificado la célula, las imágenes SBEM se realizan con una resolución lo suficientemente alta como para identificar los eslabones secretores y otros orgánulos celulares.

Este video contiene una representación en 3D de la célula enteroendocrina. El conjunto de datos contiene 643 imágenes que abarcan 45 micras de profundidad de tejido. La célula contiene una cápsula neurológica repleta de células secretoras y microvellosidades.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo documentar la ultraestructura completa de un intestino específico La célula sensorial se dispersa entre otras células epiteliales en el tejido intestinal nativo mediante el uso de la fluorescencia como guía para identificar la célula o células de interés y procesar el tejido para la microscopía electrónica de barrido de fase de bloqueo en serie.