Name: Preparación Facile y Eficiente de la glicopolímeros fluorescentes Tri-componentes a través de polimerización BALSA controlado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Aprende a sintetizar glicopolímeros fluorescentes mediante polimerización RAFT controlada. Este método eficiente produce polímeros de baja dispersidad con propiedades de unión específicas para investigación en glicobiología.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por los Laboratorios Químicos de la Estación Experimental de la Universidad de Missouri, y por la Asociación de Fibrosis Quística de Missouri.

1. Síntesis de Glycomonomer 2-Lactobionamidoethyl metacrilamida <ol><li> Disolver 2 g de ácido lactobiónico en 3,0 ml de metanol anhidro y lentamente añadir etanol absoluto en una caída de la moda del reloj hasta la solución justa convierte nublado, y se eliminan los disolventes mediante evaporación rotatoria. </li><li> Disolver el residuo, de la etapa 1.1, en 3,0 ml de metanol anhidro y, una vez más, se añade lentamente etanol absoluto hasta justo nublado, y se evaporan los disolventes a través de evaporación rotatoria. Repita este paso 3 veces para obtener lactobiono-1,5-lactona (1,94 g, rendimiento 98%). Este producto es de suficiente pureza para ser utilizado en las siguientes reacciones. </li><li> Añadir 1,0 g de lactobionolactona en 3,0 ml de metanol a N - (2-aminoetil) metacrilamida (AEMA, 0,58 g) y éter monometílico de hidroquinona (MEHQ, 1,0 mg), un inhibidor de la auto-polimerización, en 2,0 ml de metanol, seguido por 1,0 ml de trietilamina. Se agita a TA durante 48 h. </li><li> Añadir 20 ml de H2O desionizada (DH 2 </sub&gt; O) al matraz de reacción, a continuación, eliminar el metanol y trietilamina libre por evaporación a sequedad mediante evaporación rotatoria. </li><li> Para eliminar cualquier ácido lactobiónico restante, añadir 20 ml de dH 2 O, a continuación, pasar la solución acuosa a través de una columna de intercambio de aniones (forma OH -, 10 mm x 20 mm) en un vaso de recepción que contiene 1,0 mg de MEHQ. </li><li> Eliminar trietilamina, producido en la Etapa 1.5, mediante la evaporación a sequedad mediante evaporación rotatoria. </li><li> Añadir 20 ml de dH 2 O y quitar sin reaccionar AEMA por adición lenta de 1 mg alícuotas de resina de intercambio catiónico (forma H +) hasta que no ninhidrina materiales reactivos son detectables. Monitorear la eliminación tomando 1 ml de alícuotas de la solución después de cada adición de resina, aplicándolo a una placa de cromatografía en capa fina, a continuación, la pulverización de la placa con una ninhidrina 2% en solución de etanol. Cuando no se observa de color azul profundo a desarrollarse cuando la placa se calienta a 90 ° C durante 1 min, se ha alcanzado el punto final. </li><li&gt; Se filtra la solución a través de un embudo de vidrio poroso, transferir el filtrado a un tubo de ensayo, congelar la muestra a -80 ° C, y luego se liofiliza. </li><li> Eliminar MEHQ de la muestra disolviendo el material liofilizado en una cantidad mínima de metanol (~ 0,5 ml), a continuación, añadir acetona anhidra frío (-20 ° C, 15 ml) para precipitar el producto. Recoger el precipitado por filtración utilizando un embudo de vidrio fritado, a continuación, secar el precipitado en un desecador a vacío para obtener metacrilamida 2-lactobionamidoethyl (LAEMA) como un polvo blanco (0,94 g, rendimiento 68%). Este producto es de suficiente pureza para ser utilizado en las siguientes reacciones. </li></ol> 2. Síntesis de monómero 2-Gluconamidoethyl metacrilamida Nota: La preparación de metacrilamida 2-gluconamidoethyl (Gaema), que no posee un azúcar colgante, es una adaptación de un método publicado 15. <ol><li> Añadir 2,0 g de AEMA disuelto en 10 ml de metanol a una soluciónde D-gluconolactona (1,6 g) en 30 ml de metanol y, con agitación, se añade lentamente 1,6 ml de trietilamina. </li><li> Se agita la reacción a temperatura ambiente durante 24 hr. </li><li> Se filtra el producto precipitado utilizando un embudo de vidrio fritado y enjuagar el precipitado tres veces con 10 ml cada uno de isopropanol, a continuación, lavar con 10 ml de acetona seca. Secar el producto precipitado en un desecador a vacío. </li></ol> 3. BALSA Glycopolymer Síntesis <ol><li> Para quitar el MEHQ presente en N comercial inhibidor - (2-hidroxietil) acrilamida (HEAA), añadir 1 ml de HEAA a un tubo de microcentrífuga de 2 ml, seguido por la adición de 0,5 g de nanopartículas de óxido de aluminio. Centrifugar el tubo a 300 xg durante 30 segundos, y el uso de la HEAA capa superior en la siguiente reacción. </li><li> Añadir con cuidado 32,8 mg de LAEMA (70,0 mol), 1,7 mg de AEMA (10,5 mol) y 27,5 l de HEAA (270 mol), todos disueltos en 0,4 ml de dH 2 O, a un tubo de 1 ml Schlenk bien limpia, por lo tanto que tiene un Monomer relación molar de 20: 3: 77. </li><li> En una reacción paralela, con el fin de producir polímeros de control que no poseen ningún azúcar colgante, en lugar de utilizar LAEMA en el paso 3.2, sustituir 21,4 mg de Gaema (70,0 mmol) en la reacción. </li><li> Para el tubo de Schlenk respectivo (es decir, 3,2 o 3,3), añadir secuencialmente 50 l de DMF que contiene 0,53 mg de (ácido 4-cianopentanoico) -4-ditiobenzoato (1,9 mol, agente de RAFT), y 50 l de DMF que contiene 250 g de 4,4&#39;-azobis (ácido 4-cianovalérico) (0,9 mol, iniciador). Mezclar suavemente golpeando el dedo. </li><li> Congele los contenidos que figuran en el tubo Schlenk que emplean un hielo seco: baño de etanol (75 g de hielo seco en 100 ml de etanol), aplicar un vacío dentro de 10 a 50 mTorr, a continuación, cierre la válvula de Schlenk y permitir la solución para descongelar lentamente a RT . Repita este ciclo de congelación-descongelación evacuar dos veces más. Asegúrese de que todos los reactivos se disuelven después del último deshielo. </li><li> Coloque el tubo de Schlenk en una ba de plástico con cierreg, evacuar el aire de la bolsa, y luego sellarlo. La transferencia de la bolsa que contiene el tubo de Schlenk a un baño de agua precalentado a 70 ° C y se incuba durante 24 hr. </li><li> Transferir cuidadosamente la solución en el tubo de Schlenk a una bolsa de diálisis preparada (MWCO = 3,500), y dializar contra dH 2 O (10 x 2 l) durante 24 horas, cambiando el H2Od cada hora durante las primeras 8 horas. Después de la diálisis, la transferencia de la muestra desde el tubo de diálisis a un tubo de ensayo, congelar la muestra a -80 ° C, y luego liofilizar la misma. </li></ol> Nota: La estadística resultante poli-metacrilamida / acrilamida (PMA) copolímeros que contienen colgante 4- O -β-D-galactopiranosil-D-gluconamida (lactobionamida) (de la Etapa 3.2) o D-gluconamida (del Paso 3.3), respectivamente, son obtenido. Por conveniencia de la discusión, estos dos glicopolímeros se abrevian como PMA-LAEMA y PMA-Gaema, respectivamente. 4. Post-modificación de glicopolímeros con fluoróforos </p&gt; <ol><li> Disolver 5,0 mg de glycopolymer PMA-LAEMA o PMA-Gaema que contiene ~ 0,9 mol de grupos funcionales de amina primaria en 0,9 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS, fosfato de sodio 0,1 M, NaCl 0,15 M, pH 7,5), respectivamente. </li><li> Añadir lentamente 0,6 mg de éster de succinimidilo carboxifluoresceína en 100 l de DMF a las soluciones con agitación rápida. Revuelva suavemente las reacciones de 16 horas en la oscuridad a temperatura ambiente. </li><li> Si bien protegido de la luz, cargar la muestra en un tubo de diálisis preparada (MWCO = 3,500) y dializar contra dH 2 O (2 L) durante 16 horas, cambiando la solución de diálisis cada hora durante las primeras 8 horas. Después de la diálisis, la transferencia de la muestra desde el tubo de diálisis a un tubo de ensayo, congelar la muestra a -80 ° C, y luego liofilizar la misma. </li></ol> Nota: Después de la liofilización, glicopolímeros fluorescentes PMA-LAEMA-fluoresceína y PMA-Gaema-fluoresceína, respectivamente, se obtienen. 5. Caracterización de la Glycopolímeros <ol><li> Determinar el número promedio de peso molecular (Mn), el peso promedio de peso molecular (M w) y la dispersidad (M w / M n) de los glicopolímeros en un sistema de HPLC comercial equipado con cromatografía de permeación en gel (GPC) de software, una GPC columna adecuada para el peso molecular de interés, y un detector de índice de refracción, utilizando 0,1 M Tris / tampón 0,1 M de cloruro de sodio (pH 7) como eluyente a un caudal de 0,6 ml / min 14. Utilice normas polietilenglicol como patrones de peso molecular (MW: 200-1,200,000 g / mol). </li><li> Cuantificar las concentraciones reales de los grupos funcionales amina primaria dentro de los glicopolímeros 16. Analizar el contenido total de carbohidratos de los glicopolímeros sintetizó de acuerdo con un método publicado 17. </li><li> Realizar pruebas de composición estructural y la pureza del LAEMA glycomonomers, Gaema y glicopolímeros PMA-LAEMA, PMA-Gaema en D2O por espectroscopía de RMN 14. </li></ol> 6. Los ensayos de unión de los glicopolímeros sintéticos con lectina-revestidos perlas de agarosa <ol><li> Añadir 1,5 ml de PBS a 50 l de suspensión de Erythrina lectina (ECL) perlas de agarosa recubiertas crista galli-, centrifugar a 300 xg durante 1 min, y retirar con cuidado y desechar el sobrenadante. Repita este paso dos veces, y luego volver a suspender las perlas en 0,5 ml de PBS. </li><li> Añadir 3 g de PMA-LAEMA-fluoresceína o PMA-Gaema-fluoresceína (control negativo) en 6 l de PBS a la suspensión de perlas, e incubar las mezclas, en la oscuridad, a temperatura ambiente durante 1 hr. </li><li> Lavar las mezclas con 1,5 ml de PBS tres veces, y los granos de volver a suspender en 0,2 ml de PBS. Cargar una alícuota (4 l) en un pozo en un portaobjetos de microscopio de inmunofluorescencia (recubierto de teflón), cubrir con un cubreobjetos, y observar por microscopía de fluorescencia utilizando un filtro FITC (longitud de onda de excitación: 467 a 498 nm, longitud de onda de emisión: 513- 566 nm) y un objetivo de 10X para examinar la unión de tél fluorescente glicopolímeros con las perlas 14. </li></ol>

<ol><li>Scharfman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+binds+to+neoglycoconjugates+bearing+mucin+carbohydrate+determinants+and+predominantly+to+sialyl-Lewis+x+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa binds to neoglycoconjugates bearing mucin carbohydrate determinants and predominantly to sialyl-Lewis x conjugates.</a> Glycobiology. 9 (8), 757-764 (1999).</li>
<li>Song, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+targeting+of+alveolar+macrophages+via+RAFT-based+glycopolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">In vivo targeting of alveolar macrophages via RAFT-based glycopolymers.</a> Biomaterials. 33 (28), 6889-6897 (2012).</li>
<li>Wolfenden, M. L., Cloninger, M. J. Chapter 14. Multivalency in carbohydrate binding. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWolfenden%2C+ML+%22Carbohydrate+Recognition%3A+Biological+Problems%2C+Methods%2C+and+Applications%22">Carbohydrate Recognition: Biological Problems, Methods, and Applications</a>. Wang, B., Boons, G. .-J. , John Wiley, & Sons, Inc., Chapter. 349-370 (2011).</li>
<li>Moad, G., Rizzardo, E., Thang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radical+addition-fragmentation+chemistry+in+polymer+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Radical addition-fragmentation chemistry in polymer synthesis.</a> Polymer. 49 (5), 1079-1131 (2007).</li>
<li>Spain, S. G., Gibson, M. I., Cameron, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+synthesis+of+well-defined+glycopolymers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Polym.+Sci.%2C+Part+A%3A+Polym.+Chem%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the synthesis of well-defined glycopolymers.</a> J. Polym. Sci., Part A: Polym. Chem. 45 (11), 2059-2072 (2007).</li>
<li>Bernard, J., Hao, X., Davis, T. P., Barner-Kowollik, C., Stenzel, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+various+glycopolymer+architectures+via+RAFT+polymerization%3A+From+block+copolymers+to+stars%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Synthesis of various glycopolymer architectures via RAFT polymerization: From block copolymers to stars.</a> Biomacromolecules. 7 (1), 232-238 (2006).</li>
<li>Bulmus, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAFT+polymerization+mediated+bioconjugation+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Polym.+Chem%22%5BJournal%5D)">RAFT polymerization mediated bioconjugation strategies.</a> Polym. Chem. 2, 1463-1472 (2011).</li>
<li>Ting, S. R. S., Chen, G., Stenzel, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+glycopolymers+and+their+multivalent+recognitions+with+lectins%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis of glycopolymers and their multivalent recognitions with lectins.</a> Polymer Chemistry. 1, 1392-1412 (2010).</li>
<li>Vazquez-Dorbatt, V., Lee, J., Lin, E. W., Maynard, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+glycopolymers+by+controlled+radical+polymerization+techniques+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Synthesis of glycopolymers by controlled radical polymerization techniques and their applications.</a> Chembiochem. 13, 2478-2487 (2012).</li>
<li>Jiang, X., Ahmed, M., Deng, Z., Narain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylated+glyco-functionalized+quantum+dots%3A+Synthesis%2C+characterization%2C+and+cytotoxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">Biotinylated glyco-functionalized quantum dots: Synthesis, characterization, and cytotoxicity studies.</a> Bioconjugate Chem. 20 (5), 994-1001 (2009).</li>
<li>Deng, Z., Li, S., Jiang, X., Narain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Well-defined+galactose-containing+multi-functional+copolymers+and+glyconanoparticles+for+biomolecular+recognition+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Well-defined galactose-containing multi-functional copolymers and glyconanoparticles for biomolecular recognition processes.</a> Macromolecules. 42 (17), 6393-6405 (2009).</li>
<li>Qin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galactosylated+N-2-hydroxypropyl+methacrylamide-b-N-3-guanidinopropyl+methacrylamide+block+copolymers+as+hepatocyte-targeting+gene+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">Galactosylated N-2-hydroxypropyl methacrylamide-b-N-3-guanidinopropyl methacrylamide block copolymers as hepatocyte-targeting gene carriers.</a> Bioconjugate Chem. 22 (8), 1503-1512 (2011).</li>
<li>Albertin, L., Wolnik, A., Ghadban, A., Dubreuil, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+RAFT+polymerization+of+N-acryloylmorpholine%2C+synthesis+of+an+ABA+triblock+glycopolymer+and+study+of+its+self-association+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Aqueous RAFT polymerization of N-acryloylmorpholine, synthesis of an ABA triblock glycopolymer and study of its self-association behavior.</a> Macromol. Chem. Phys. 213 (17), 1768-1782 (2012).</li>
<li>Wang, W., Chance, D. L., Mossine, V. V., Mawhinney, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAFT-based+tri-component+fluorescent+glycopolymers%3A+synthesis%2C+characterization+and+application+in+lectin-mediated+bacterial+binding+study%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj.+J%22%5BJournal%5D)">RAFT-based tri-component fluorescent glycopolymers: synthesis, characterization and application in lectin-mediated bacterial binding study.</a> Glycoconj. J. 31 (2), 133-143 (2014).</li>
<li>Deng, Z., Ahmed, M., Narain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+well-defined+glycopolymers+synthesized+via+the+reversible+addition+fragmentation+chain+transfer+process+in+aqueous+media%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Polymer+Sci.+Part+A%3A+Polym.+Chem%22%5BJournal%5D)">Novel well-defined glycopolymers synthesized via the reversible addition fragmentation chain transfer process in aqueous media.</a> J. Polymer Sci. Part A: Polym. Chem. 47 (2), 614-627 (2009).</li>
<li>Noel, S., Liberelle, B., Robitaille, L., De Crescenzo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+primary+amine+groups+available+for+subsequent+biofunctionalization+of+polymer+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantification of primary amine groups available for subsequent biofunctionalization of polymer surfaces.</a> Bioconjugate Chem. 22 (8), 1690-1699 (2011).</li>
<li>Biermann, C. J., McGinnis, G. D. Preparation of alditol acetates and their analysis by gas chromatography (GC) and mass spectrometry (MS). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFox%2C+A+%22Analysis+of+Carbohydrates+by+GLC+and+MS%22">Analysis of Carbohydrates by GLC and MS</a>. , CRC Press. 87-170 (1989).</li>
<li>Thomas, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+and+molecular+weight+control+of+the+polymerization+of+acrylamide+via+RAFT%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Kinetics and molecular weight control of the polymerization of acrylamide via RAFT.</a> Macromolecules. 37 (24), 8941-8950 (2004).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Un protocolo de fácil y eficiente para glicopolímeros fluorescentes tri-componente basado en balsa, con y sin un carbohidrato colgante, y su uso en un ensayo de unión a lectina, se demuestra en este informe. El protocolo comienza con la preparación de glycomonomers LAEMA y Gaema. A través de una copolimerización balsa controlada de un solo paso, glicopolímeros con rendimiento reproducible, composición de monómeros predecible y baja dispersidad, se obtienen. Después de post-modificación de glicopolímeros con carboxifluoresceína succinimidil éster, la unión de la respectiva glycopolymer marcado fluorescente resultante es fácilmente comprobable por su especificidad de unión de lectina. En los pasos de preparación iniciales de los glycomonomers que se van a emplear en la síntesis glycopolymer posteriores, se utilizaron ácido lactobiónico fácilmente disponibles y gluconolactona. En teoría, los hidratos de carbono de interés, de monosacáridos a oligosacáridos complejos, pueden ser converted para glycomonomers conjugando el azúcar blanco en el grupo hidroxilo primario en C6 de la glucosa. Después de la oxidación del residuo de glucosa reductor, y su posterior deshidratación de una lactona, el producto puede entonces hacerse reaccionar con la amina primaria en AEMA para formar el correspondiente glycomonomer fácilmente. Otros ejemplos de esta ruta se pueden ver en un informe reciente 14. Cabe señalar que antes de iniciar cualquier etapa de polimerización, MEHQ, un potente inhibidor de la polimerización, se debe quitar de todas las preparaciones de monómero y glycomonomer justo antes del uso. Esto se consigue fácilmente mediante el uso de la cantidad mínima de metanol para disolver el glycomonomer que posee MEHQ después tratar inmediatamente con acetona a -20 ° C para precipitar el producto libre de inhibidores con alto rendimiento. Imprescindible en cualquier esquema de polimerización de radicales, se hizo hincapié en la atención al detalle y monómero purezas. Como es típico de un sistema de polimerización balsa, que consiste enuna fuente de radicales, un reactivo de balsa, un monómero y disolvente. En esta presentación visualizado, un sistema de polimerización de RAFT de un solo paso se describe que se centra en la producción de copolímeros estadísticos generados a partir de una mezcla de reacción que posee tres monómeros diferentes en una solución acuosa. Dos reacciones RAFT mediada separados se presentan en la que uno utiliza un glycomonomer que posee un colgante, no reductor terminal de hidratos de carbono (es decir, β-D-galactosa), y el otro, que posee un poliol con ningún residuo de hidratos de carbono enlazado. Común a ambas reacciones RAFT mediada eran monómeros que poseen un grupo hidroxilo singular que sirve como una molécula espaciadora, y otro que posee una amina libre para la post-modificación con un fluoróforo-amino reactiva. Dado que la presencia de oxígeno en la mezcla de reacción y el medio ambiente es perjudicial para la polimerización mediada BALSA, su retirada de rastrear los niveles se realiza fácilmente a través de varias de congelación-evaciclos cuate-descongelación mientras se mantiene el recipiente de reacción tubo Schlenk bajo alto vacío. Cabe señalar que la relación molar de monómeros diferentes en la reacción se puede ajustar según sea necesario. También, mediante la variación de la cantidad de agente de RAFT utilizado, la longitud de los polímeros resultantes se puede controlar 18. Sin embargo, la relación molar del agente de RAFT a iniciador debe ser siempre mayor que dos para asegurar la baja dispersidad del producto. En estas condiciones, la evolución de la copolimerización es constante, y la reproducibilidad de la reacción es muy alta. Dicho esto, es poco probable que se obtiene una distribución totalmente uniforme de todos los monómeros que participan dentro de un copolímero estadístico, debido a sus diferentes velocidades de polimerización. Caracterización de la distribución de los diferentes monómeros en el polímero es todavía muy difícil. El método posterior a la modificación, que aquí se presenta, es a la vez simple y más amenable para el uso de una selección más amplia de marcadores fluorescentes, en comparación con otros protocolos aplicados a glicopolímeros etiqueta 2,11. Estos incluyen muchos de los fluoróforos de amina reactiva solubles en agua, los puntos cuánticos, biotinas, y otros. Las especificidades de unión de los sintetizados, glicopolímeros marcados son fácilmente verificable utilizando lectinas con afinidades de unión conocidos. PMA-Gaema poseer sin azúcar colgante es un control negativo apropiado. Glicopolímeros con diferentes etiquetas fluorescentes preparados a través de esta ruta se han utilizado con éxito en las investigaciones de lectina mediada por la unión bacteriana 14. Tal como se presenta, esta preparación fácil y eficiente de glicopolímeros fluorescentes estadísticos debe proporcionar un gran potencial para una amplia variedad de investigaciones glycobiological.

En las últimas dos décadas, las investigaciones con glicopolímeros sintéticos han experimentado un desarrollo lento pero continuo, lo que demuestra un potencial significativo en el examen de los mecanismos infecciosos que incluyen la investigación que se centra en el reconocimiento de lectina procesa 1-3. Desde glicopolímeros sintéticos que poseen restos de azúcar multivalentes presentan eficacias de unión a lectina mucho más altos, en comparación con los hidratos de carbono monovalentes, son de gran demanda en el campo de la glicobiología 3. De particular interés en la investigación clínica es el uso de glicopolímeros fluorescentes para caracterizar la unión con hidratos de carbono disponibles en las superficies celulares respiratorios humanos y glicoproteína mucosa bacteriana lectina mediada. Temprano en estudios in vitro empleado glicopolímeros basado en poliacrilamida disponibles comercialmente en las pruebas de unión bacterianas. Varias de estas sondas mostraron resultados prometedores, pero expresaron su preocupación respecto, varianzas fácil obtención, y muchos-a-muchos, tanto en polYmer peso molecular y contenido glycoepitope. Un protocolo económica en el laboratorio fue desarrollado que proporcionaría un control satisfactorio de contenido de la estructura, el tamaño, y la pureza de glicopolímeros sintéticos dirigidos lectinas bacterianas. En búsqueda de un enfoque sintético adecuado para glicopolímeros, una técnica relativamente nueva polimerización fue probada usando un tipo de polimerización radical controlada que emplea adición-fragmentación de transferencia de cadena reversible (RAFT) agentes 4. Tales reactivos BALSA Recientemente se han utilizado en algunas preparaciones glycopolymer 5-7. En comparación con otros protocolos de preparación glycopolymer, polimerizaciones RAFT mediada demuestran varias ventajas, incluyendo la tolerancia a una variedad de estructuras de monómeros y condiciones de reacción, el potencial de compatibilidad con las soluciones acuosas, y baja dispersidad tamaño de los productos poliméricos deseados 8,9. De notable interés son protocolos para la preparación de BALSA-baSED-tri componente glicopolímeros, permitiendo el control de las composiciones de monómeros diferentes, cada uno de los cuales pueden tener funciones distintas 10-13. Sin embargo, la mayoría de los esfuerzos de investigación anteriores o bien carecían de hidratos de carbono anoméricos colgante 10, o emplear intensificaron polimerizaciones resultantes en copolímeros de tri-bloque, que consisten en homopolímeros unidos covalentemente, que a menudo sirven para diferentes propósitos que los polímeros estadísticos que son copolímeros en los que la secuencia de monómero residuos siguen una regla estadística 9-13. Recientemente, empleando el compuesto de RAFT tiocarboniltio (ácido 4-cianopentanoico) -4-ditiobenzoato en un entorno acuoso, la preparación de un grupo de balsa basa glicopolímeros estadísticos tri-componente lineales que contienen azúcares colgantes específicas y su aplicación en la lectina de unión mediada bacteriana pruebas se informó 14. El objetivo general de este método, presentado de una manera visual, es preparar a los tri-componenteglicopolímeros fluorescentes estadísticos a través de copolimerización controlada por balsa. Debido a la facilidad del protocolo de polimerización de un solo paso, el control fino sobre la longitud del polímero y composiciones, y la alta reproducibilidad de la reacción, este protocolo puede aplicarse fácilmente a otras síntesis basado en la balsa de glicopolímeros con estructuras deseadas.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><fuerte>Reactivo</fuerte></td></tr><tr><td>Ácido lactobiónico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>153516</td><td></td></tr><tr><td>D-Gluconolactona&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2164</td><td></td></tr><tr><td>N-(2-hidroxietil) acrilamida (HEAA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>697931</td><td></td></tr><tr><td>Sal sódica de naranja II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O8126</td><td></td></tr><tr><td>Éter monometílico de hidroquinona (MEHQ)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>54050</td><td>Inhibidor de polimerización</td></tr><tr><td>N-(2-aminoetil) clorhidrato de metacrilamida (AEMA)</td><td>Polysciences, Inc</td><td>24833-5</td><td></td></tr><tr><td>Trietilamina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-616</td><td></td></tr><tr><td>Resina de intercambio aniónico IRN-78 en forma de hidróxido, malla 80</td> Resina de intercambio catiónico <td>Sigma-Aldrich</td><td>10343-U</td><td></td></tr><tr><td>50Wx8, malla 200</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>217514</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de aluminio, malla ~150&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1522</td><td>Tipo WN-6, Neutro, Grado de Actividad Super I</td></tr><tr><td>Nihidrina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4876</td><td>Se utilizó una solución de etanol de ninhidrina al 0,2% en la prueba</td></tr> de <tr><td>ácido 4-Ciano-4-(fenilcarbonotioltio)pentanoico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>722995</td><td>agente RAFT</td></tr><tr><td>4,4&prime;-Azobis(ácido 4-cianovalerico)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11588</td><td>Iniciador de polimerización</td></tr><tr><td>Éster de carboxifluoresceína succinimidil &nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>Erythrina Cristagalli perla de agarosa recubierta de lectina</td><td>Vector Laboratories</td><td>AL-1143&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><fuerte>solvente</fuerte></td></tr><tr><td>dH2O</td><td></td><td></td><td>Producido por el sistema de purificación de agua Barnstead, 18 megaohmio-cm</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A461-4</td><td>ACS grado o superior</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td>ACS grado o mejor</td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-100</td><td>ACS grado o mejor</td></tr><tr><td>Dimetilformamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22705</td><td>ACS grado o mejor</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Fisher Scientific</td><td>A929-4</td><td>ACS grado o mejor</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Membrana de diálisis (MWCO: 3,500)</td><td>Spectrum Labs</td><td>132720</td><td></td></tr><tr><td>Estándar analítico de polietilenglicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O2393</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Schlenk, 1 ml</td><td>Quark Glass</td><td></td><td>Personalizado</td></tr><tr><td>TSK-GEL G4000 PWxl&nbsp;</td><td>Tosoh Biociencia &nbsp;</td><td>8022</td><td>Se utiliza para el análisis GPC de los glicopolímeros</td></tr><tr><td>Empower 3 con el paquete GPC/SEC</td><td>Sistema</td> de HPLC de Waters Corporation <td></td><td></td></tr><tr><td>Waters Alliance&nbsp;</td><td>Waters Corporation</td><td></td><td>Equipado con detector de índice de refracción (Waters 2414) y detector de fluorescencia (Waters 2475)</td></tr><tr><td>Espectrómetro de RMN Avance III 800 MHz</td> Microscopio de fluorescencia <td>Bruker Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BX43</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>Utilizado con el filtro FITC en la prueba de unión de glicopolímeros</td></tr><tr><td>Rotavap / Rotoevaporador</td><td>Heidolph</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fritted embudo de disco</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-310-109</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizador</td><td>Labconco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio de inmunofluorescencia</td><td>Polysciences</td><td>18357-1</td><td></td></tr><tr><td>Revco Ultima Plus -80&nbsp; &#176; C Congelador</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bolsa de vacío de plástico y bomba manual</td> Bomba de vacío <td>Ziploc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, accionamiento directo, Maxima C Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>vacuómetro</td><td>Sargent-Welch</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparación facile y eficiente de la glicopolímeros fluorescentes tri-componentes a través de polimerización balsa controlado

Facile and Efficient Preparation of Tri-component Fluorescent Glycopolymers via RAFT-controlled Polymerization

Glicopolímeros sintéticos son herramientas instrumentales y versátiles usados ​​en varios campos de investigación bioquímica y biomédica. Un ejemplo de una síntesis fácil y eficiente de glicopolímeros estadísticos fluorescentes bien controlados utilizando adición-fragmentación de transferencia de cadena reversible (RAFT) polimerización basado se demuestra. La síntesis comienza con la preparación de metacrilamida glycomonomer 2-lactobionamidoethyl que contiene β-galactosa obtenido por reacción de lactobionolactona y N - (2-aminoetil) metacrilamida (AEMA). 2-Gluconamidoethyl metacrilamida (Gaema) se utiliza como un análogo estructural que carece de una β-galactósido terminal. La siguiente reacción de copolimerización de RAFT mediada implica tres monómeros diferentes: N - (2-hidroxietil) acrilamida como espaciador, AEMA como objetivo para su posterior etiquetado de fluorescencia, y los glycomonomers. Tolerante de sistemas acuosos, el agente de RAFT usado en la reacción es (ácido 4-cianopentanoico) -4-ditiobenzoato.Se observaron dispersities Bajos (≤1.32), composiciones de copolímero predecibles, y una alta reproducibilidad de las polimerizaciones entre los productos. Polímeros fluorescentes se obtienen mediante la modificación de los glicopolímeros con carboxifluoresceína succinimidil éster dirigidos a los grupos funcionales de amina primaria en AEMA. Especificidades de unión a lectina de los glicopolímeros resultantes se verificaron mediante pruebas con perlas de agarosa correspondientes recubiertas con lectinas glycoepitope reconocer específicos. Debido a la facilidad de la síntesis, el control estricto de las composiciones de productos y la buena reproducibilidad de la reacción, este protocolo se pueden traducir hacia preparación de otros glicopolímeros a base de balsa con estructuras y composiciones específicas, según se desee.

Síntesis de glycomonomer Ácido lactobiónico se usa en este documento como un ejemplo para la preparación de glycomonomers. El uso de métodos en el informe inicial sobre la síntesis de LAEMA 11, se observaron diversas rendimientos en la preparación con la pureza insatisfactoria. El método de purificación modificado usando resinas de intercambio catiónico y aniónico para eliminar el material de partida sin reaccionar ofrecido rendimiento de producto estable y de alta pureza, que se confirma por 1 H y 13 C RMN espectroscopia (Figura 1). BALSA síntesis glycopolymer y después de la modificación de glicopolímeros con fluoróforos En contraste con los bloques-glicopolímeros preparados a través de polimerizaciones RAFT escalonadas, este protocolo copolimerización de un solo paso proporciona una distribución uniforme en todo el glycomonomer cadena principal del polímero. Los glicopolímeros muestran aquí contienen 20% en moles de glycomonomer, 77% en moles de HEAA como un espaciador, y 3% en moles de AEMA como un objetivo para la post-modificaciones (véase la Figura 2). 1 H y 13 C-espectroscopía de RMN confirman las estructuras de PMA-LAEMA y PMA-Gaema (Figuras 3 y 4). Como se muestra en la Figura 5, cuando representa frente a los perfiles de elución de GPC de la glycopolymer sintetizado sin balsa, tanto PMA-LAEMA y PMA-Gaema tienen dispersities bajas, lo que demuestra la eficacia del enfoque de balsa. Como era de esperar, PMA-Gaema tiene un M n menor que el de PMA-LAEMA debido a la falta de un azúcar colgante de PMA-Gaema. Análisis de los hidratos de carbono y grupos funcionales de amina primaria contenido de los glicopolímeros RAFT reveló que la relación de monómeros en los glicopolímeros de productos es coherente con la relación estequiométrica de los monómeros de partida empleados en la reacción de polimerización de RAFT mediada (Tabla 1). Esto significa un control estricto de la compositio monómerons en los glicopolímeros sintetizados, tal como fue diseñado. Reacción de los grupos funcionales amina primaria con fluoróforos activados es una técnica ampliamente utilizada en el etiquetado de proteínas. Esta técnica se emplea aquí para etiquetar glicopolímeros purificadas con carboxifluoresceína. Después de post-modificación, se obtuvieron polímeros fluorescentes (Figura 6). No hay degradación de los polímeros marcados con fluoresceína en la reacción se detectó por análisis GPC (datos no mostrados). La unión de las pruebas glicopolímeros sintéticos con perlas de agarosa lectina recubierto Para evaluar la especificidad de unión de lectina de las glicopolímeros sintetizados, se utilizaron perlas de agarosa-lectina recubierto con especificidad de unión a carbohidratos conocida. Lectina Erythrina crista-galli (ECL), empleado en los experimentos, tiene una especificidad de unión hacia β-D-galactósido. Figura 7A demuestra claramente que PMA-LAEMA-Fluoresceína, que contiene β-D-galactósido como un carbohidrato colgante, exhibió fuerte unión con la lectina ECL. En contraste, la unión a la ECL de la glycopolymer PMA-Gaema-fluoresceína, que no posee un azúcar colgante negativa, se muestra en la Figura 7B. Este resultado ejemplifica la eficacia de unión y afinidad de la glycopolymer fluorescente sintetizada. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52922/52922fig1.jpg" /> Figura 1. Asignado 1 H- (a) y 13 C-RMN (b) los espectros (D 2 O) para LAEMA. (Esta cifra se ha modificado de Wang et al. 14) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> &lt;p class = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52922/52922fig2.jpg" /> Figura 2. Ilustración esquemática de la síntesis de glycopolymer fluorescente PMA-LAEMA contiene β-galactosidasa como azúcar colgante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52922/52922fig3.jpg" /> Figura 3. Asignado 1 H- (A) y 13 C-RMN (B) espectros (D 2 O) para glycopolymer PMA-LAEMA. (Esta cifra se ha modificado de Wang et al. 14) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig3large.jpg" target="_blank">Súplica</a>Se Haz clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52922/52922fig4.jpg" /> Figura 4. Asignado 1 H- (A) y 13 C-RMN (B) espectros (D 2 O) para el PMA-Gaema. (Esta cifra se ha modificado de Wang et al. 14) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52922/52922fig5.jpg" /> Figura 5. Gel rastros de cromatografía de permeación de sede en BALSA PMA-Gaema y PMA-LAEMA preparan con y sin utilizar agente BALSA. En contraste con el PMA-LAEMA preparado sin BALSA agente (azul), RAFT-<html> PMA-LAEMA basado (verde) tiene una dispersidad mucho menor (M w / M n). Basado en BALSA PMA-Gaema (rojo) y PMA-LAEMA tener perfiles GPC similares, pero el primero tiene un M más pequeño n debido a la ausencia de azúcares colgantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52922/52922fig6.jpg" /> Figura 6. PMA-LAEMA antes y después del post-modificación con fluoróforo. (A) En comparación con el blanco no marcado glycopolymer (tubo de la izquierda), marcado con fluoresceína PMA-LAEMA muestra un color amarillo fuerte (tubo de la derecha). (B) Bajo los rayos UV, no marcado PMA-LAEMA (tubo izquierdo, 1 mg / ml en PBS) es oscuro y presenta sin fluorescencia, mientras PMA-LAEMA-fluoresceína marcado (trompa derecha, 1 mg / ml en PBS) espectáculos fuerte fluorescencia verde.: //www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig4large.jpg &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52922/52922fig7.jpg" /> Figura 7. Erythrina crista-galli lectina (ECL) perlas de agarosa recubiertas unen-D-galactosidasa β contiene glicopolímeros, y no aquellos que no posean un azúcar colgante. (A) PMA-LAEMA-fluoresceína (3 mg) demostraron unión fuerte con ECL , mientras que en (B) PMA-Gaema-fluoresceína, que posee ningún residuo colgante de β-D-galactósido, no mostró unión con las perlas recubiertas de lectina. Barra de escala = 100 micras. Tabla 1. Valores dirigidas a un de los parámetros de síntesis y composiciones reales de los glicopolímeros. A) los valores de orientación, valores queestán deseada de los productos; b) DP, el grado de polimerización; c) NA, no está disponible. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody style="vertical-align:middle;text-align:center"><tr><td style="width:120px"></td><td style="width:40px"> DP b </td><td style="width:70px"> Dispersidad </td><td style="width:120px"> Contenido real de glycomonomers mol% </td><td> Contenido real de amina primaria mol% </td></tr><tr><td> Los valores de orientación </td><td> 100 </td><td> &lt;1.3 </td><td> 20 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> PMA-LAEMA </td><td> 99 </td><td> 1.26 </td><td> 19 </td><td> 3.2 </td></tr><tr><td> PMA-GAEMA </td><td> 89 </td><td> 1.32 </td><td> NA c </td><td> 2.7 </td></tr></tbody></table>

Se demuestra una síntesis eficiente de tres pasos de glicopolímeros fluorescentes basados en RAFT, que consiste en preparación de glucomonómero, copolimerización y post-modificación. Este protocolo se puede utilizar para preparar glicopolímeros estadísticos basados en RAFT con las estructuras deseadas.

Preparación Facile y Eficiente de la glicopolímeros fluorescentes Tri-componentes a través de polimerización BALSA controlado

Synthetic glycopolymers are instrumental and versatile tools used in various biochemical and biomedical research fields. An example of a facile and ...

El objetivo general de este procedimiento es la síntesis bien controlada de polímeros lineales estadísticos y fluorescentes de tipo glicano, utilizando la polimerización reversible por adición-fragmentación con transferencia de cadena, o polimerización RAFT. Esto se logra primero sintetizando el monómero glicano, el metacrilamida de etil lactobio, o L-A-E-M-A. El segundo paso consiste en utilizar la polimerización RAFT de L-A-E-M-A, metacrilamida de 2-aminoetilo, o AEMA, y acrilamida de 2-hidroxietilo, o AGAA, para sintetizar el polímero glicano correspondiente con baja dispersidad.A continuación, el glicopolímero se modifica en una de sus aminas primarias mediante reacción con el éster mixto de carboxifluoresceína para producir un glicopolímero marcado con fluoresceína. El paso final consiste en unir el glicopolímero marcado con fluoresceína a microesferas recubiertas con lectina que presentan especificidad conocida de unión a carbohidratos. Finalmente, se utiliza microscopía de fluorescencia para analizar la unión de los glicopolímeros a las microesferas, confirmando que el glicopolímero posee el carbohidrato de interés y está marcado con una etiqueta fluorescente.La ventaja de la polimerización RAF frente a los métodos existentes que emplean polimerizaciones convencionales por radicales libres radica en que el proceso wrath es una técnica de polimerización controlada que minimiza el número de cadenas derivadas del iniciador. Esto da lugar a polímeros con pesos moleculares predeterminados y una distribución de polidispersidad muy estrecha. Las polimerizaciones pueden aplicarse a una mezcla definida de monómeros para la preparación de glicopolímeros fluorescentes específicos.Estos polímeros glicídicos tienen capacidades de unión definidas que pueden verificarse mediante el uso de perlas recubiertas con lectinas. La preparación eficiente de polímeros glicídicos fluorescentes debería resultar de gran valor para la investigación en biología glicídica en el futuro. Para comenzar, disuelva dos gramos de ácido lactobiónico en tres mililitros de metanol anhidro.A continuación, agregue lentamente etanol absoluto gota a gota a la solución hasta que apenas se vuelva turbia. Utilice un evaporador rotatorio para eliminar todos los disolventes. Repita este proceso tres veces para producir 1,94 gramos de lacto bioo uno cinco lactona con un rendimiento del 98 %.Añada una solución de un gramo de lactobionolactona en tres mililitros de metanol a una solución de AEMA y MEHQ en dos mililitros de metanol. A continuación, añada un mililitro de trietilamina y agite la mezcla a temperatura ambiente. Después de 48 horas, agregue 20 mililitros de agua desionizada a la mezcla y transfiérala a un evaporador rotatorio.Evapore hasta sequedad completa. Disuelva el residuo en 20 mililitros de agua desionizada y aplique la solución a la parte superior de una columna de intercambio aniónico de 10 por 20 milímetros. Coloque un vaso de precipitados que contenga un miligramo de MEHQ debajo de la salida y eluya la columna hacia el vaso de precipitados.Después de extraer la solución en un evaporador rotatorio, disuelva el residuo en 20 mililitros de agua desionizada y agregue alícuotas de un miligramo de resina de intercambio iónico. Continúe hasta que la prueba de anhídrido sea negativa, realizando pruebas de anhídrido mediante la extracción de un microlitro de la solución y su aplicación en una placa de cromatografía en capa fina. Rocíe la placa con una solución al 2% de anh en etanol y caliente a 90 grados Celsius durante un minuto en una placa calefactora.Se ha alcanzado el punto final cuando no se forma ningún color azul. A continuación, filtre la solución a través de un embudo de vidrio fritado en un tubo de ensayo. Congele la solución a menos 80 grados Celsius y luego transfiérala a un liofilizador para liofilizarla.Disuelva el residuo en una cantidad mínima de metanol y precipite el producto añadiendo acetona anhidra a menos 20 grados Celsius. Recopile el L-A-E-M-A precipitado por filtración a través de un embudo de vidrio fritado. Transfiera el embudo y el precipitado a un desecador al vacío para secar, primero con 0,5 gramos de nanopartículas de óxido de aluminio de aproximadamente malla 150 por un mililitro de HEAA de grado comercial en un tubo de ensayo de dos mililitros.Centrifugar el tubo a 300 veces G durante 30 segundos y utilizar la capa superior como HEAA libre de inhibidor. Disolver cuidadosamente 32,8 miligramos de L-A-E-M-A, 1,7 miligramos de a EMA y 27,5 microlitros de HEAA libre de inhibidor y 0,4 mililitros de agua desionizada, y transferir la solución a un tubo de 1 mililitro previamente limpiado. A continuación, añadir 50 microlitros de reactivo raft y 50 microlitros de reactivo iniciador al tubo y mezclar golpeando suavemente el costado del tubo con la válvula cerrada. Conectar el tubo a una línea de vacío y congelar el contenido utilizando un baño de etanol con hielo seco.Luego reduzca la presión del tubo hasta aproximadamente 50 militorr con una bomba y cierre la válvula. Retire el baño de hielo seco y permita que el contenido se descongele. Repita cuidadosamente el ciclo de congelación, vacío y descongelación otras dos veces más.Inspeccione el tubo para asegurarse de que el contenido esté completamente disuelto y agite suavemente en vórtex si es necesario. Antes de colocarlo, retire el tubo cerrado de la línea de vacío y colóquelo en una bolsa de plástico transparente al vacío. Extraiga el aire de la bolsa con una bomba manual de plástico.Luego, coloque la bolsa en un baño de agua cubierto a 70 grados Celsius durante 24 horas. A continuación, retire el tubo de la bolsa y transfiera su contenido a una bolsa de diálisis con un corte de peso molecular de 3.500 Daltons. Coloque la bolsa de diálisis en un vaso de precipitados y realice la diálisis frente a dos litros de agua desionizada durante 24 horas.Transfiera el contenido de la bolsa de diálisis a un tubo de ensayo y colóquelo en un congelador a ochenta grados Celsius bajo cero. Una vez congelado, transfiéralo a un liofilizador y sométalo a liofilización. Para obtener el polímero blanco esponjoso PMA LA EMA, primero prepare una solución de cinco miligramos de PMA LA EMA en 0,9 mililitros de PBS.A continuación, agregue lentamente 0,6 miligramos de carboxi fluoresceína cin, éter medio en 100 microlitros de dimetilformamida a la solución agitada rápidamente, el microtubo y el papel de aluminio, y agite lentamente durante 16 horas a temperatura ambiente. Transfiera la solución a una bolsa de diálisis con un límite de peso molecular de 3.500 Daltons. Coloque la bolsa en un vaso de precipitados y realice la diálisis frente a dos litros de agua desionizada durante 16 horas, manteniéndola protegida de la luz. Transfiera el contenido de la bolsa de diálisis a un tubo de ensayo.Después de congelar la solución a menos 80 grados Celsius, liofilizar. Para obtener el polímero de glicoconjugado etiquetado con fluoresceína de color amarillo esponjoso P-M-A-L-A-E-M-A, determinar el peso molecular promedio numérico, el peso molecular promedio ponderal y la dispersidad de los polímeros de glicoconjugado mediante un sistema de HPLC. Primero, añadir 1,5 mililitros de PBS a una suspensión de 50 microlitros de microesferas de aro recubiertas con lectina de eritrocrista galactosilada en un tubo de centrífuga.Luego, centrifugue el tubo a 300 veces G durante un minuto. A continuación, deseche el sobrenadante y repita la lavada otras dos veces antes de agregar finalmente 0,5 mililitros de PBS. Agregue una solución de tres microgramos de PMA LA EMA marcada con fluoresceína en seis microlitros de PBS al tubo que contiene las perlas recubiertas con lectina.Utilice P-M-A-G-A-E-M-A marcado con fluoresceína como control negativo. A continuación, envuelva los tubos con papel de aluminio e incúbelos a temperatura ambiente durante una hora. Centrifugue el tubo durante un minuto y deseche el sobrenadante.Luego, reúse, suspenda las perlas en 1,5 mililitros de PBS fresco y repita el lavado tres veces. Finalmente, reúsela suspendiendo las perlas en 0,2 mililitros de PBS. Transfiera cuatro microlitros de las perlas suspendidas a un pocillo de un microscopio de inmunofluorescencia. Coloque la muestra en un portaobjetos y cúbrala con una lámina de vidrio para su registro.Imágenes de la preparación utilizando un microscopio fluorescente equipado con un objetivo de 10 x, filtro FITC y cámara. Los glicopolímeros se analizaron mediante cromatografía de permeación en gel. Los polímeros sintetizados sin usar raft presentan una dispersidad mucho mayor que aquellos elaborados con raft.Cuando se marca con fluoresceína, la apariencia física del glicopolímero cambia de blanco a un color amarillo intenso visible bajo luz ultravioleta. Una solución del polímero sin marcar permanece oscura, mientras que el polímero marcado con fluoresceína emite un brillo verde intenso, confirmando la presencia de la etiqueta. La unión específica a perlas recubiertas de lectina solo ocurre con polímeros que portan residuos azucarados colgantes; las perlas emiten color verde al unirse, mientras que permanecen oscuras cuando se tratan con polímeros que carecen de dichos residuos. Esta técnica de polimerización basada en balsas permite una gran flexibilidad en el tipo de glicopolímeros que pueden sintetizarse.La posterior marcación de los glicopolímeros también puede realizarse con una gran variedad de reactivos fluorescentes, capaces de reaccionar con grupos primarios en un entorno acuoso. Los investigadores en el campo de la glicobiología pueden utilizar esta técnica para obtener fácilmente glicopolímeros altamente versátiles y definidos. Estos glicopolímeros pueden emplearse como herramientas para explorar las especificidades de unión a carbohidratos, como las observadas en el tracto respiratorio de pacientes con fibrosis quística o aquellas implicadas en muchos tipos de cánceres humanos.

facile-efficient-preparation-tri-component-fluorescent-glycopolymers

Research

Investigación

JoVE Journal

Chemistry

Química

Aquí se describe una estrategia única para la creación de matrices biocompatibles, capas continuas con interfaces entre capas distintas para la ingeniería de tejidos. Tal andamio podría proporcionar un entorno adaptable ideal para modular el comportamiento celular por varias señales biológico, químico o...

Gradiente de densidad multicapa polimerización (DGMP): una técnica novedosa para la creación de multi-compartimiento, Andamios personalizables para Ingeniería de Tejidos

Nuestro laboratorio ha desarrollado hidrogeles de poliacrilamida de ADN-reticulada, un sistema dinámico de hidrogel, para entender mejor los efectos de la modulación de la rigidez del tejido en función de la célula. Aquí, ofrecemos esquemas, descripciones y protocolos para preparar estos hidrogeles.

Preparación de ADN-poliacrilamida reticulada hidrogeles

Presentamos un protocolo para formar rápidamente vesículas poliméricas gigantes (pGVs). Brevemente, las soluciones poliméricas se deshidratan en películas de agarosa secas adheridas a cubreobjetos. La rehidratación de las películas poliméricas da como resultado una rápida formación de pGV. Este método avanza enormemente en la preparación de vesículas gigantes sintéticas para aplicaciones directas en estudios biomiméticos.

Formando polímerosomas de tamaño gigante Uso de rehidratación asistida-Gel

Este artículo describe un proceso para producir nanopartículas poliméricas autoensambladas utilizando polimerización por dispersión mediada por luz visible. El uso de luz visible de baja energía para controlar la polimerización permite la formación reproducible de micelas autoensambladas en forma de gusano con un alto contenido de sólidos.

Síntesis Facile de micelas similares a gusanos de luz visible mediada por dispersión Polimerización con catalizador Photoredox

Polimerización por precipitación no agitada proporciona un enfoque de prototipado rápido, reproducible para la síntesis de los estímulos sensibles al poli (N -isopropylacrylamide) microgeles de estrecha distribución de tamaños. En esta síntesis protocolo, la caracterización de dispersión de luz y fluorescencia de seguimiento de partículas individuales de estos microgeles en una configuración de la microscopía de campo amplio se demuestran.

Síntesis controlada y de seguimiento de la fluorescencia de muy uniforme de poli (<em&gt; N</em&gt; -isopropylacrylamide) microgeles

Presentamos un protocolo para la síntesis de hidrogeles funcionalizados con RGD como dispositivos para la administración de células y fármacos. El procedimiento consiste en la cicloadición de alquina-azida catalizada por cobre (CuAAC) entre el ácido poliacrílico modificado con alquino (PAA) y un derivado de RGD-azida. Los hidrogeles se forman mediante policondensación asistida por microondas y se investigan sus propiedades fisicoquímicas.

La síntesis de hidrogeles funcionalizado-RGD como una herramienta para aplicaciones terapéuticas

Se describen los protocolos para la fabricación de hidrogeles degradables interpenetrantes basados en hidrazona Cross-linking de oligómeros poliméricos en la escala de a granel microescala, nanoescala y el último para la preparación de nanopartículas de gel y nanofibras.

Fabricación de hidrogeles degradables de interpenetrantes en múltiples escalas de la longitud mediante extrusión reactiva, microfluídica, uno mismo-Asamblea y Electrospinning

Se presenta un protocolo para la síntesis y caracterización de movimiento difusivo de los polímeros cíclicos en el nivel de una sola molécula.

Síntesis de polímeros cíclicos y caracterización de su movimiento difusivo en el estado fundido en la molécula de un solo nivel

A continuación, se presenta un protocolo para preparar y visualizar estructuras secundarias (por ejemplo, fibras, arquitecturas toroidal, y nano-esferas) derivados de policarbodiimidas helicoidales. La morfología caracterizada tanto por microscopía de fuerza atómica (AFM) y microscopía electrónica de barrido (SEM) se demostró que dependerá de la estructura molecular, la concentración, y el disolvente de elección.

Morfologías auto-montaje Obtenido a partir helicoidales policarbodiimida copolímeros y sus derivados de triazol

Las varillas de microgel con grupos reactivos complementarios se producen a través de microfluídica con la capacidad de interconectarse en solución acuosa. Los microgeles anisómetros se atascan y se entrelazan en construcciones estables con poros más grandes en comparación con los sistemas de base esférica. Los microgeles modificados con GRGDS-PC forman construcciones 3D macroporosas que se pueden utilizar para el cultivo celular.

Andamios 3D macroporosos interconectados de varillas de microgel

Aprende a sintetizar glicopolímeros fluorescentes mediante polimerización RAFT controlada. Este método eficiente produce polímeros de baja dispersidad con propiedades de unión específicas para investigación en glicobiología.

Preparación Facile y Eficiente de la glicopolímeros fluorescentes Tri-componentes a través de polimerización BALSA controlado

Explorar más videos