Preparación Facile y Eficiente de la glicopolímeros fluorescentes Tri-componentes a través de polimerización BALSA controlado

El objetivo general de este procedimiento es la síntesis bien controlada de glicopolímeros lineales estadísticos fluorescentes mediante fragmentación por adición reversible, transferencia en cadena o polimerización en balsa. Esto se logra sintetizando primero el monómero glico, dos lacto, bioetil metacrilamida, o L-A-E-M-A. El segundo paso es utilizar la polimerización en balsa de L-A-E-M-A-N dos aminoácidos de metacrilamida, o A EMA y N dos hidroxietilo acrilamida o un GAA para sintetizar el correspondiente polímero de glicopolímero de baja dispersión.

A continuación, el glicopolímero se modifica en una de sus aminas primarias mediante la reacción con el éster medio de carboxifluoresceína xito para producir un glicopolímero fluoresceína. El paso final es unir el polímero de glicopolímero nativo de fluoresceína a perlas de rosa recubiertas de lectina con una especificidad de unión de carbohidratos conocida. En última instancia, la microscopía fluorescente se utiliza para analizar la unión de los glicopolímeros a las perlas surgidas, lo que confirma que el glicopolímero posee el carbohidrato de interés y está marcado con una etiqueta fluorescente.

La ventaja de la polimerización RAF sobre los métodos existentes que emplean polimerizaciones convencionales de radicales libres es que el proceso de ira es una técnica de polimerización de control que minimiza el número de cadenas derivadas del iniciador. Esto da como resultado polímeros de pesos moleculares predeterminados y un estante de dispersión de polietileno muy estrecho. Las polimerizaciones se pueden aplicar a una mezcla definida de monómeros para la preparación de glicopolímeros fluorescentes específicos.

Estos glicopolímeros tienen capacidades de unión definidas que se pueden verificar mediante el uso de perlas recubiertas de lectina. La preparación eficiente de glicopolímeros fluorescentes debería resultar de gran valor para la investigación en glicobiología en el futuro. Para empezar, disuelva dos gramos de ácido lactobiónico en tres mililitros de metanol anhidro.

A continuación, agregue lentamente etanol absoluto gota a gota a la solución hasta que se vuelva turbia. Utilice un evaporador rotativo para eliminar todos los disolventes. Repita este proceso tres veces para producir 1,94 gramos de lacto bioo one five lactone con un rendimiento del 98%.

Añadir una solución de un gramo de lacto biolactona en tres mililitros de metanol a una solución de A EMA y MEHQ en dos mililitros de metanol. A continuación, añade un mililitro de trietilamina y remueve la mezcla a temperatura ambiente. Después de 48 horas, agregue 20 mililitros de agua desionizada a la mezcla y transfiérala a un evaporador rotativo.

Evapore hasta que esté completamente seco. Disuelva el residuo en 20 mililitros de agua desionizada y aplique la solución en la parte superior de una columna de intercambio aniónico de 10 por 20 milímetros. Coloque un vaso de precipitados que contenga un miligramo de MEHQ debajo de la salida y eluya la columna en el vaso de precipitados.

Después de extraer la solución en un evaporador rotativo, disuelva el residuo en 20 mililitros de agua desionizada y agregue un miligramo de alícuotas de resina de intercambio iónico. Hasta que una prueba de hidrante sea negativa, se realiza en pruebas de hidrante retirando un microlitro de la solución y aplicándolo a una placa de cromatografía en capa fina. Rocíe la placa con una solución de etanol al 2% y caliente a 90 grados centígrados durante un minuto en una placa caliente.

Se ha alcanzado el punto final cuando no se forma ningún color azul. A continuación, filtre la solución a través de un embudo de vidrio fritado en un tubo de ensayo. Congele la solución a menos 80 grados centígrados y luego transfiérala a un liofilizador para que se seque.

Disolver el residuo en una cantidad mínima de metanol y precipitar el producto añadiendo menos 20 grados centígrados y acetona anhidra. Recoja el L-A-E-M-A precipitado por filtración a través de un embudo de vidrio fritado. Transfiera el embudo y el precipitado a un desecado al vacío para secar primero a 0,5 gramos de aproximadamente 150 nanopartículas de óxido de aluminio de malla a un mililitro de HEAA de grado comercial en un tubo de ensayo de dos mililitros.

Centrifugar el tubo a 300 veces G durante 30 segundos y utilizar la capa superior como HEAA libre de inhibidores, disolver cuidadosamente 32,8 miligramos de L-A-E-M-A, 1,7 miligramos de EMA y 27,5 microlitros de HEAA sin inhibidores y 0,4 mililitros de agua desionizada y transferir la solución a un tubo de flanco de un mililitro bien limpio. A continuación, agregue 50 microlitros de reactivo de balsa y 50 microlitros de reactivo iniciador al tubo y mezcle golpeando suavemente el costado del tubo con la válvula cerrada. Conecte el tubo a una línea de vacío y congele el contenido con un baño de etanol de hielo seco.

A continuación, reduzca la presión del tubo para tenderlo a 50 militorr con una bomba y cierre la válvula. Retire el baño de hielo seco y deje que el contenido se descongele. Repita el ciclo de congelación, vacío y descongelación dos veces con más cuidado.

Inspeccione el tubo para asegurarse de que el contenido esté completamente disuelto y haga un vórtice suave si es necesario. Antes de sentarse, retire el tubo cerrado de la línea de vacío y colóquelo en una bolsa de vacío de plástico transparente. Evacúe el aire de la bolsa con una bomba manual de plástico.

A continuación, coloque la bolsa en un baño de agua tapado a 70 grados centígrados durante 24 horas. A continuación, retire el tubo de la bolsa y transfiera su contenido a una bolsa de diálisis con un límite de peso molecular de 3.500 Daltons. Coloque la bolsa de diálisis en un vaso de precipitados y dialice contra dos litros de agua desionizada durante 24 horas.

Transfiera el contenido de la bolsa de diálisis a un tubo de ensayo y colóquelo en un congelador a menos 80 grados centígrados. Una vez congelado, transfiéralo a un liofilizador y séquelo. Para obtener primero el esponjoso polímero glicopolímero blanco PMA LA EMA, prepare una solución de cinco miligramos de PMA LA EMA en 0,9 mililitros de PBS.

A continuación, agregue lentamente 0,6 miligramos de carboxifluoresceína cina, eter medio en 100, microlitros de dimetilformamida a la solución agitada rápidamente, el microtubo y la lámina, y agite lentamente durante 16 horas a temperatura ambiente, transfiera la solución a una bolsa de diálisis con un límite de peso molecular de 3, 500 Daltons. Coloque la bolsa en un vaso de precipitados y dialice contra dos litros de agua desionizada durante 16 horas mientras la mantiene protegida de la luz. Transfiera el contenido de la bolsa de diálisis a un tubo de ensayo.

Después de congelar la solución a menos 80 grados centígrados, liofilice. Para obtener el glicopolímero fluorescente amarillo esponjoso marcado P-M-A-L-A-E-M-A, determine el peso molecular promedio del número, el peso, el peso molecular promedio y la dispersidad de los polímeros glicográficos con un sistema de HPLC. Primero con 1,5 mililitros de PBS con una suspensión de 50 microlitros de perlas de aro recubiertas de lectina de galera Krista en un tubo de centrífuga.

A continuación, centrifugar el tubo a 300 veces G durante un minuto. A continuación, desecha el sobrenadante y repite el lavado dos veces más antes de añadir finalmente 0,5 mililitros de PBS. Agregue una solución de tres microgramos de fluoresceína marcada con PMA LA EMA en seis microlitros de PBS al tubo que contiene las perlas recubiertas de lectina.

Use fluoresceína marcada con P-M-A-G-A-E-M-A como control negativo. A continuación, envuelva los tubos en papel de aluminio e incubelos a temperatura ambiente durante una hora. Centrifugar el tubo durante un minuto y desechar el sobrenadante.

A continuación, reutilice, suspenda las perlas en 1,5 mililitros de PBS fresco y repita el lavado tres veces. Por último, suspende las perlas en 0,2 mililitros de PBS Transfiere cuatro microlitros de las perlas suspendidas a un pocillo de un microscopio de inmunofluorescencia. Deslice y cubra con un disco de vidrio para cubrir.

Imágenes del portaobjetos utilizando un microscopio fluorescente equipado con un filtro FITC de objetivo 10 x y una cámara. Los glicopolímeros se analizaron por cromatografía de permeación en gel. Los polímeros sintetizados sin usar balsa tienen una dispersidad mucho mayor que los fabricados con balsa.

Cuando se marca con fluoresceína, la apariencia física del glicopolímero cambia de blanco a un color amarillo fuerte que se muestra bajo la luz ultravioleta. Una solución de polímero sin etiquetar permanece oscura mientras que el polímero marcado con fluoresceína brilla en verde brillante, lo que confirma la presencia de la unión específica de la etiqueta a las perlas recubiertas de lectina solo ocurre con polímeros que llevan residuos de azúcar colgantes, las perlas brillan en verde cuando se unen, mientras que permanecen oscuras cuando se tratan con polímeros que carecen de residuos de azúcar colgantes. Esta técnica de polimerización basada en balsa permite una gran flexibilidad en el tipo de glicopolímeros que se pueden sintetizar.

El marcaje posterior de los glicopolímeros también se puede lograr con una gran variedad de reactivos fluorescentes, capaces de reaccionar con medios primarios en un ambiente acuoso. Los investigadores en el campo de la glicobiología pueden utilizar esta técnica para obtener fácilmente glicopolímeros altamente versátiles y definidos. Estos glicopolímeros se pueden utilizar como herramientas para explorar las especificidades de unión a los carbohidratos, como las observadas en las vías respiratorias de los pacientes con fibrosis quística o las involucradas en muchos tipos de cánceres humanos.