Lectura granel simple de Digital ácidos nucleicos Cuantificación ensayos

El objetivo general de este procedimiento es simplificar la lectura de ensayos en gotas digitales mediante el uso de un instrumento convencional de PCR en tiempo real para medir la fluorescencia total del ensayo. Esto se logra primero preparando reacciones de amplificación de las muestras de interés, dos estándares y formando gotas para particionar cada una en miles de reactores del tamaño de nanolitros. El segundo paso consiste en incubar las gotas para amplificar los ácidos nucleicos dentro de cada gota.

A continuación, se mide la fluorescencia total de cada muestra o estándar mediante un QPC estándar o un termociclador. El paso final consiste en predecir la fracción de gotas fluorescentes en las muestras de interés utilizando una curva estándar generada a partir de las muestras estándar. Para verificar el desempeño de este método, se puede utilizar microscopía fluorescente para evaluar independientemente el rendimiento de cuantificación del ensayo de fluorescencia total.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el recuento de gotas es que no requiere instrumentación especializada antes de comenzar la reparación de este ensayo. Se necesitan todos los reactivos necesarios, tal como se describe en el texto del protocolo, y dos patrones. Uno, un control sin molde, como agua libre de nucleasas, y otro con alta concentración de molde, como ADN lambda. Desnaturalice 3,3 microlitros de cada patrón con 3,3 microlitros de tampón de desnaturalización en un tubo A-Q-P-C-R.

Incubarlo a temperatura ambiente durante tres minutos. Detener cada reacción con 3,3 microlitros de tampón de neutralización. De manera similar, desnaturalizar 3,3 microlitros de la plantilla de interés con 3,3 microlitros de tampón de desnaturalización incubado a temperatura ambiente durante tres minutos.

Detenga la reacción con 3,3 microlitros de tampón de neutralización. Prepare 11 microlitros de mezcla maestra por muestra para reducir los falsos positivos. Exponga la mezcla maestra a luz UV antes de formar las gotas.

Primero, prepare 10 microlitros de mezcla premezclada por muestra en un tubo transparente de 0,5 mililitros o 1,5 mililitros sobre hielo. La mezcla premezclada consiste en oligonucleótido aleatorizado, tampón de reacción de la ADN polimerasa B-S-A, dn, NTPs y agua libre de nucleasas. Coloque el tubo en agua sobre hielo y expóngalo a luz UV después de la exposición a UV.

Incube el colorante de unión A-D-S-D-N-A y la dieta de referencia con la mezcla de premezcla. Añada la ADN polimerasa PHI 29 al final para asegurar que la polimerasa no entre en contacto con niveles de pH mucho más altos o más bajos que 7,5. Mezcle bien y combine 10 microlitros de la plantilla desnaturalizada o estándar con 10 microlitros de la mezcla maestra; mezcle bien.

Dado que las gotas pueden ser muy sensibles a la electricidad estática y al esfuerzo cortante, el experimentador debe quitarse la ropa que pueda generar electricidad estática y ponerse a tierra antes de formar las gotas. El dispositivo microfluídico utilizado para esta demostración fue fabricado en el laboratorio y cuenta con una entrada de aceite y dos entradas acuosas con una unión de enfoque de flujo para la generación de gotas. Utilice dos bombas de jeringa para controlar los caudales de 55 microlitros de aceite con surfactante y 20 microlitros de mezcla de reacción a través del chip microfluídico.

Para generar 20 001 gotas de nanolitros, uno de los pasos más difíciles consiste en recolectar las gotas sin perturbar la emulsión. Es importante pipetear lentamente y, preferiblemente, utilizar una punta de gran apertura.

Recolecte todas las gotas en tubos PCR para cada muestra. Aliquote 30 microlitros de aceite en tubos PCR nuevos con tapas ópticas utilizando una punta de gran orificio y pipeteando muy lentamente. Transfiera 20 microlitros de gotas encima del aceite.

Los volúmenes constantes aseguran que el ensayo sea lo más preciso posible. Cierre las tapas de los tubos firmemente, ya que las tapas sueltas permitirán que el aceite se evapore; manipule los tubos de emulsión desde la parte superior del tubo, lo más alejado posible de la emulsión. Se puede utilizar un termociclador PCR, un termociclador A-Q-P-C-R o una placa calefactora para la amplificación isotérmica.

Se utiliza un termociclador A-Q-P-C-R en esta demostración. Incube las muestras durante siete horas a 30 grados Celsius y desactive durante un minuto a 75 grados Celsius. Inmediatamente después de la reacción y la activación.

Mida los niveles de fluorescencia para todas las muestras utilizando el termociclador QPCR. Para cada muestra, divida la intensidad de fluorescencia del colorante fluorescente para el ADN de doble cadena (D DS DNA) entre la intensidad de fluorescencia del colorante de referencia.

Reste la fluorescencia de fondo o la fluorescencia normalizada del control sin molde de todas las muestras. Elabore una curva estándar lineal utilizando las mediciones correctivas de fluorescencia de los patrones. El patrón de control sin molde representa la fluorescencia de una muestra con 0 % de gotas fluorescentes y la concentración alta de molde.

La medición de fluorescencia es la fluorescencia esperada para una muestra con 100 % de gotas fluorescentes utilizando la curva estándar correspondiente. Prediga las proporciones intermedias de gotas positivas y negativas basándose en su fluorescencia masiva. Este método utiliza un instrumento convencional de PCR en tiempo real para medir la fluorescencia masiva de ensayos digitales basados en gotas.

Se mezclaron previamente gotas fluorescentes y no fluorescentes en diferentes proporciones y se realizó una comparación entre la fluorescencia en masa y la fracción de gotas positivas. Como era de esperar, la fluorescencia en masa y el recuento de gotas positivas aumentan linealmente con la fracción de entrada de gotas fluorescentes. Se compararon las proporciones predichas basadas en patrones con las fracciones de entrada fluorescente esperadas.

La línea indica el valor esperado dada una relación lineal. Los resultados muestran un buen desempeño en la cuantificación de la relación de gotas a lo largo de dos órdenes de magnitud de rango dinámico. Para probar este método en un ensayo real de amplificación del genoma completo cuantitativo, se midieron los niveles de fluorescencia y las fracciones de gotas positivas de una gota digital.

Se midió el ensayo de MDA con concentraciones crecientes de ADN molde Lambda. La línea indica la fracción fluorescente esperada utilizando la distribución de Poisson para modelar los datos del experimento. Se muestran imágenes fluorescentes representativas de las gotas, tanto la fluorescencia masiva como la fracción de gotas positivas de las muestras digitales de MDA, que escalan según lo esperado con el promedio de molde por gota, lo que indica que la lectura masiva puede capturar fielmente el resultado de un ensayo digital.

Este método puede beneficiar a otros ensayos digitales, como la PCR digital, acelerando la paralelización y simplificando la lectura del ensayo.