Name: Preparación de altamente poroso Coordinación Polymer Coatings en macroporosas Polymer Monolitos de Enriquecimiento mejorada de Phosphopeptides (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Aprende a preparar monolitos de polímero macroporoso recubiertos con polímeros de coordinación microporosos para la extracción selectiva de fosfopéptidos. Este método mejora la selectividad y eficiencia en proteómica.

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Este trabajo se ha realizado en la Fundición Molecular, Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley y cuenta con el apoyo de la Oficina de Ciencias, Oficina de Ciencias Básicas de la Energía, División de Instalaciones de Usuarios Científicos del Departamento de Energía de los Estados Unidos, bajo el Contrato No. DE-AC02–05CH11231. Se agradece el apoyo financiero de F.M. por parte de una beca ME-Fulbright y de A.S. por parte de la Comisión de Educación Superior de Pakistán.

NOTA: Antes de comenzar, compruebe todas las hojas de datos de materiales pertinentes (MSDS). Varios de los productos químicos utilizados en los procedimientos de síntesis y de aplicación son tóxicos. Siga todas las prácticas de seguridad apropiadas y utilizar el equipo adecuado de protección (bata, pantalones largos, zapatos cerrados, gafas de seguridad, guantes). Utilice todo el equipo de protección personal al manipular criogénica de nitrógeno líquido para las medidas de adsorción de nitrógeno (guantes aislantes, careta). 1. poroso polímero Preparación Monolito a Granel y Formato de columna capilar <ol><li> Bulk Polymer Monolith para la caracterización <ol><li> Purificar estireno, divinilbenceno y ácido metacrílico a través de una columna de alúmina básica, con el fin de eliminar los inhibidores de la polimerización. Colocar 10 g de alúmina básica en un ml jeringa de plástico desechable 25 con una torunda de lana de vidrio de envasado en la punta de la jeringa. Hacer pasar aproximadamente 10 ml de monómero a través de la columna. </li><li> Cargar los monómeros (50 mg estireno, divinilbenceno 100 mg y 50 mg de ácido metacrílico) y los agentes formadores de poros (300 mg de tolueno y 300 mg isooctano) en un vial de vidrio de 1 ml. Añadir el iniciador de la polimerización, 4 mg de 2,2&#39;-azobisisobutironitrilo (AIBN, 1% con respecto a los monómeros). </li><li> Homogeneizar por sonicación durante 10 min. Eliminar el oxígeno disuelto por burbujeo de nitrógeno a través del líquido durante 10 min. Sellar la tapa del frasco con la película de parafina y colocarlo en un baño de agua a 60 ° C durante 6 horas para polimerizar la mezcla. </li><li> Enfriar a temperatura ambiente y romper el frasco con cuidado. Transferir el monolito de polímero en un dedal de extracción de celulosa. Colocar el cartucho de extracción en una cámara de extracción Soxhlet y ensamblar a un matraz de fondo redondo que contiene un volumen de metanol, que es al menos tres veces el volumen de la cámara de extracción. Montar un condensador a la parte superior de la cámara de extracción. Realizar la extracción Soxhlet por ebullición del metanoldurante 16 h, asegurando la eliminación completa de los monómeros sin reaccionar y agentes formadores de poros. </li><li> Secar durante la noche en un horno de vacío a 60 ° C. Confirmar la presencia de grupos funcionales carboxílicos para unir el PCP por Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR). Medir el área de superficie por porosimetría de adsorción de nitrógeno. </li></ol></li><li> La funcionalización de sílice Capilares para la Preparación de columnas monolíticas <ol><li> Cortar 2 m de 100 micras Identificación del capilar de sílice fundida de poliamida recubierto. Conéctelo a una jeringa de vidrio desde 0,25 hasta 0,50 ml y lavar el capilar con acetona. Eliminar la acetona por aclarado el capilar con agua. </li><li> Con el fin de activar el recubrimiento de sílice interna del capilar, utilizar una bomba de jeringa a fluir una solución 0,2 M acuosa de NaOH a 0,25 l / min durante 30 min. Enjuague con agua hasta que el efluente es neutral. </li><li> Utilice tiras de papel de pH para comprobar el pH del efluente. Con el fin de protonar los grupos silanol del capilar, bombear un aqueo 0,2 Msolución de HCl nosotros a través del capilar a 0,25 l / min durante 30 min. Enjuague con agua hasta que el efluente es neutral. Enjuague con etanol. </li><li> Bombear un 20% (w / w) solución de etanol de 3- (trimetoxisilil) propil metacrilato (pH 5 ajustado con ácido acético) en 0,25 l / min durante 1 hora. En este paso, el capilar de sílice está funcionalizado con grupos vinilo con el fin de fijar el monolito de polímero a la superficie interior capilar. </li><li> Enjuague con acetona y seco, en una corriente de nitrógeno y dejar a temperatura ambiente durante la noche antes de su uso. Cortar el capilar en pedazos más cortos de longitud 20 cm. </li></ol></li><li> Preparación de columnas monolíticas capilares <ol><li> Preparar una mezcla de polimerización idénticas como para el monolito de polímero a granel (sección 1.1) en un vial de vidrio de 1 ml con un septo de caucho. Añadir iniciador AIBN 1% con respecto a los monómeros. Homogeneizar por sonicación durante 10 min. </li><li> Purgar la mezcla de polimerización con nitrógeno mediante el acoplamiento de un capilar de sílice no funcionalizadoa una corriente de nitrógeno. <ol><li> Insertar el capilar corriente de nitrógeno a través del septo de caucho del vial y sumergirlo en la mezcla de polimerización de manera que el nitrógeno burbujas a través del líquido. Deje la tapa del frasco ligeramente suelto para evitar sobrepresiones. Purgar durante 10 min. </li><li> Levantar el capilar corriente de nitrógeno de la mezcla de polimerización para el espacio de cabeza del vial, y cerrar herméticamente la tapa. Insertar un capilar funcionalizado a través del septo en la mezcla de polimerización. El exceso de presión generada en el capilar a través del nitrógeno inyectado en el espacio de cabeza bombea la mezcla de polimerización a través del capilar funcionalizado. </li><li> Recoger varias gotas de mezcla de polimerización a partir del efluente del capilar para asegurarse de que está completamente lleno y cerrarlo con un tapón de caucho. Tome el capilar fuera del vial muy cuidadosamente y cerrar la entrada del capilar con un septum de goma. </li></ol></li><li> Polimerizar la mezclatura contenida en el capilar en un baño de agua a 60 ° C durante 6 horas. Enfriar a temperatura ambiente y cortar unos pocos milímetros de ambos extremos del capilar. Eliminar los monómeros sin reaccionar y agentes formadores de poros mediante el lavado de la columna con acetonitrilo utilizando una bomba de HPLC a 3 l / min durante 30 min. Compruebe contrapresión de la columna capilar. </li></ol></li></ol> 2. Crecimiento del Hierro-benzenetrycarboxylate (FeBTC) PCP <ol><li> Crecimiento del FeBTC MSP en un polímero a granel Monolito para la caracterización <ol><li> Moler el monolito previamente secado utilizando un mortero. </li><li> Sumergir 100 mg del polvo monolito en 5 ml de 2 mM FeCl 3 · 6H 2 O en etanol durante 15 min. Filtro de vacío usando un filtro de nylon (0,22 micras) y se lava el polvo con etanol. Sumergir el polvo monolito en 5 ml de 2 mM de ácido 1,3,5-bencenotricarboxílico (BTC) en etanol durante 15 min. Filtro de vacío usando un filtro de nylon (0,22 micras) y se lava el polvo con etanol.</li><li> Repita el paso número 2 como se desee. El crecimiento de la capa de metal-orgánica final será definido por el número de ciclos aplicados. Típicamente, se realizan entre 10 y 30 ciclos. Confirmar la presencia de nuevos poros por porosimetría de adsorción de nitrógeno. Medir la cantidad de sitios de metal adicionales por análisis termogravimétrico (TGA). </li></ol></li><li> Crecimiento de la FeBTC Ministerio de Salud Pública en una columna monolítica capilar para el enriquecimiento de fosfopéptidos <ol><li> El uso de una bomba de jeringa. Enjuague el monolito capilar con 2 mM FeCl 3 · 6H 2 O en etanol durante 15 min a 2 l / min. Lavar con etanol durante 15 min a 2 l / min. Enjuague el monolito capilar con una mM BTC 2 en etanol durante 15 min a 2 l / min. Lavar con etanol durante 15 min a 2 l / min. </li><li> Repita el paso 1 como se desee. El crecimiento de la capa de metal-orgánica final será definido por el número de ciclos realizados. </li></ol></li></ol> 3. La proteína de digestión y Enrichment de Phosphopeptides <ol><li> La digestión de proteínas <ol><li> Disolver 0,5 ml de leche desnatada en 1 ml de agua y se divide en 200 l fracciones. </li><li> Para la digestión de las proteínas añadir bicarbonato de amonio 160 l 1 M y ditiotreitol 50 l 45 mM de cada fracción, con el fin de escindir los enlaces disulfuro. Incubar a 50 ° C en un termomezclador durante 15 min. </li><li> Añadir poco a poco 50 l de una solución acuosa de yodoacetamida 100 mM, mientras que la solución se enfrió a temperatura ambiente. Yodoacetamida evitará la formación de nuevos enlaces disulfuro. </li><li> Incubar en la oscuridad durante 15 min a temperatura ambiente. Añadir 1 ml de agua desionizada. Añadir 2 g de tripsina y digerir las proteínas en un termomezclador a 37 ° C durante 14 horas. </li><li> Terminar la digestión por acidificación con 10 l de ácido trifluoroacético al 1%, y colocándolo en el termomezclador durante 5 min a temperatura ambiente. Guarde las proteínas digeridas a -20 ° C. </li></ol></li><li> Enriquecimiento de fosfopéptidos utilizando una columna capilar Ministerio de Salud Pública. <ol><li> Lavar la columna con 100 l de una mezcla 4: 1 de acetonitrilo que contiene un ácido trifluoroacético al 0,1% durante 10 min a un caudal de 1 l / min. Bombear la digestión de la proteína a través de la columna a 2 l / min durante 30 min. </li><li> Lavar los péptidos no fosforilados de nuevo con una mezcla 4: 1 de acetonitrilo que contiene un ácido trifluoroacético al 0,1% durante 10 min a un caudal de 1 l / min. Lavar con agua durante 10 min a un caudal de 1 l / min. </li><li> Fosfopéptidos eluir utilizando una solución tampón de pH 7 de fosfato 250 mM bombeado a 1 l / min durante 15 min. Recoger el eluyente en un vial y desalar la solución utilizando un protocolo estándar 19. Preparar un ácido / ml de 2,5-dihidroxibenzoico 2 mg de utilizarlo como la matriz para la espectrometría de láser asistida por matriz de desorción / ionización tiempo de vuelo de masas (MALDI-TOF-MS). Dibujado 2 l de ácido 2,5-dihidroxibenzoico en la punta para eluir el phosphopeptides y detectar directamente sobre la placa de MALDI. </li><li> Analizar las manchas por MALDI-TOF-MS y regenerar la columna mediante el lavado a fondo con agua y luego metanol. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El monolito de polímero original contiene grupos funcionales carboxílicos capaces de unirse a los metales. La coordinación de los sitios de metal iniciales sobre el material original, somos capaces de hacer crecer una capa PCP (Figura 1), la incorporación de una serie de sitios de metales adicionales que configuran una red microporosa. Esto hace que los materiales presentados MSP atractivos para los procedimientos de extracción o purificación donde están involucrados especies metálicas, tales como la té...

Polímeros de coordinación poroso (PCP) son compuestos de coordinación basado en centros metálicos unidos por ligandos orgánicos con la repetición de las entidades de coordinación que se extienden en 1, 2 o 3 dimensiones que pueden ser amorfo o cristalino 1-3. En los últimos años, esta clase de materiales porosos ha atraído una gran atención debido a su alta porosidad, tunability química de ancho, y su estabilidad. PCP se han explorado para una gama de aplicaciones, incluyendo el almacenamiento de gas, separación de gas, y la catálisis 3-6, y muy recientemente, las primeras aplicaciones analíticas de los PCP se han descrito 7. Debido a su mayor funcionalidad química y alta porosidad PCP han sido blanco por su enorme potencial para la mejora de los procesos de purificación y separaciones cromatográficas, y una serie de informes sobre este tema se han publicado 7-13. Sin embargo, el rendimiento de los PCP no se encuentra actualmente en un Equivalenivel nt con materiales cromatográficos existentes probablemente debido a la rápida difusión a través de grandes huecos entre partículas en lechos de relleno de estos sólidos debido a sus morfologías normalmente de forma irregular de sus partículas o cristales. Este embalaje distribuida irregularmente conduce a un rendimiento menor de lo esperado, así como contrapresiones alta columna e indeseables morfologías forma de pico 14,15. Con el fin de resolver el problema de la rápida difusión a través de los huecos entre las partículas y concomitantemente mejorar el rendimiento de los PCP para aplicaciones analíticas, el desarrollo de un material híbrido basado en un monolito de polímero macroporoso 16 que contiene el PCP en la superficie de los macroporos haría ser deseable. Monolitos de polímeros son materiales de una sola pieza que puedan sostener el flujo convectivo a través de sus poros, lo que los convierte en una de las alternativas más eficientes para cordón de envases y se han comercializado con éxito por varios c autónomo<html> as empresas 17,18. Monolitos polímero poroso se basan generalmente en la polimerización de un monómero y un reticulante en presencia de porógenos, que son típicamente mezclas binarias de solventes orgánicos. Los materiales monolíticos obtenidos tienen una estructura microglobular y una alta porosidad y el flujo de permeabilidad. Un enfoque simple para unificar estos materiales para preparar un monolito de polímero que contiene un PCP se basa en la adición directa de los PCP tal como se sintetizan en la mezcla de polimerización del monolito. Este enfoque dio lugar a los PCP enterrado en su mayoría dentro de un esqueleto de polímero, y no ser activo para la aplicación ulterior del material final 14,15. Un enfoque sintético diferente es claramente necesario con el fin de, por ejemplo, desarrollar películas uniformes de PCP, o marcos de metal-orgánicos cristalinos (MOF) donde la mayoría de los poros contenidos en el cristal son accesibles desde los macroporos del monolito de polímero. t &quot;&gt; Aquí nos presenta un protocolo simple para la preparación de un material híbrido de metal-polímero orgánico (MSP), basado en un soporte de polímero macroporoso con grupos funcionales adecuados para la unión de PCP, que pueden ser implementados fácilmente como un auto-contenida sola monolito de polímero -piece en un formato de columna con propiedades óptimas para aplicaciones de flujo continuo. El procedimiento de síntesis de polímeros es seguido por una solución basada en la temperatura ambiente sencillo &#160; método para hacer crecer un recubrimiento de PCP en la superficie interna de los poros de la monolito 19-20. Como el primer ejemplo, se describe la preparación de un hierro (III) benzenetricarboxylate (FeBTC) película de polímero de coordinación dentro de un poli macroporoso (ácido estireno-divinilbenceno-metacrílico) monolito. Este método es eficaz para la preparación de polvos a granel, así como columnas capilares y el protocolo descrito es fácilmente implementable a otros PCP. Como un ejemplo del potencial de MOPHs como materiales funcionales para el flujo-throuaplicaciones gh, que aplican los países desarrollados FeBTC Ministerio de Salud Pública, que contiene una capa densa de Fe (III) centros para enriquecer fosfopéptidos de mezclas de proteínas digeridas explotan la afinidad de unión de fosfopéptidos a Fe (III). El protocolo desarrollado 21 se compone de tres partes principales: Preparación del soporte monolito de polímero orgánico macroporoso; el crecimiento del revestimiento PCP en la superficie de los poros de la monolito; aplicación para el enriquecimiento de fosfopéptidos.

<table><tbody><tr><td>Capilares recubiertos de poliimida</td><td>Polymicro Technologies TSP100375</td><td></td><td>100 &mu; m d.c.</td></tr><tr><td>Metacrilato de 3-(trimetoxisilil)propilo, 98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440159</td><td></td></tr><tr><td>estireno, 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W323306</td><td>Grado técnico</td></tr><tr><td>Difinilbenceno, 80%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>414565</td><td></td></tr><tr><td>ácido metacrílico, 98%</td><td>Mallinckrodt</td><td>MK150659</td><td></td></tr><tr><td>Tolueno, &ge; 99.5%</td> <td>Productos químicos EMD</td><td>MTX0735-6</td><td></td></tr><tr><td>Isooctano, &ge; 99,5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650439</td><td></td></tr><tr><td>2,2'-azobisisobutironitrilo, 98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441090</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de aluminio (alúmina básica)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>199443</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de hierro (III) hexahidratado, 97%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>236489</td><td></td></tr><tr><td>1,3,5-bencenitriácido carboxílico, 95%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>482749</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo, &ge; 99,5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>360457</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de amonio, &ge; 99,5%</td>Ácido trifluoroacético <td>Sigma-Aldrich</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>, &ge; 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>etanol, &ge; 99.8%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2854</td><td></td></tr><tr><td>Yodoacetamida, &ge; 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol, &ge; 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato sódico monobásico dihidratado, &ge; 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico dihidratado, &ge; 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fosfórico, &ge; 85%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>438081</td><td></td></tr><tr><td>ácido 2,5-dihidroxibenzoico, &ge; 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85707</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8003</td><td>Páncreas bovino</td></tr><tr><td>&beta;-caseína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6905</td><td>Leche bovina</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta ZipTip</td><td>Resina Merck Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td>C18</td></tr></tbody></table>

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Preparation of Highly Porous Coordination Polymer Coatings on Macroporous Polymer Monoliths for Enhanced Enrichment of Phosphopeptides

Describimos un protocolo para la preparación de materiales híbridos basados en recubrimientos poliméricos de coordinación altamente porosos en la superficie interna de monolitos poliméricos macroporosos. El enfoque desarrollado se basa en la preparación de un polímero macroporoso que contiene grupos funcionales de ácido carboxílico y el posterior crecimiento controlado paso a paso basado en soluciones de una capa de un polímero de coordinación porosa en la superficie de los poros del monolito polimérico. El híbrido de polímero metal-orgánico preparado tiene una alta área de superficie de microporos específicos. La cantidad de sitios de hierro (III) se incrementa a través de la coordinación metal-orgánica en la superficie de los poros del soporte polimérico funcional. El aumento de los sitios metálicos está relacionado con el número de iteraciones del proceso de recubrimiento.
El esquema de preparación desarrollado se adapta fácilmente a un formato de columna capilar. El polímero poroso funcional se prepara como un monolito poroso autónomo de un solo bloque dentro del capilar, lo que produce un dispositivo de separación de flujo continuo con una excelente permeabilidad al flujo y una contrapresión modesta. La columna híbrida de polímero metal-orgánico mostró un excelente rendimiento para el enriquecimiento de fosfopéptidos a partir de proteínas digeridas y su posterior detección mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo de desorción/ionización láser asistida por matriz. El protocolo experimental presentado es muy versátil y puede implementarse fácilmente en diferentes soportes y recubrimientos de polímeros orgánicos con una gran cantidad de polímeros de coordinación porosa y marcos metal-orgánicos para múltiples aplicaciones de purificación y/o separación.

Una ilustración esquemática de la PCP crecimiento en la superficie de los poros del monolito de polímero orgánico se muestra en la Figura 1. En esta figura, se ilustra el inicial Fe (III) átomos retenidas en la superficie de los poros del monolito de polímero original, coordinado a grupos funcionales carboxílicos . Utilizando el protocolo descrito en el presente documento ligando orgánico adicional y Fe iones (III) se añaden a la superficie, la conformación de una red de coordinación poroso dentro del m...

Se presenta un procedimiento para la preparación de medios de separación híbridos porosos compuestos por un monolito de polímero macroporoso recubierto internamente por un polímero de coordinación microporoso de alta área superficial.

Preparación de altamente poroso Coordinación Polymer Coatings en macroporosas Polymer Monolitos de Enriquecimiento mejorada de Phosphopeptides

We describe a protocol for the preparation of hybrid materials based on highly porous coordination polymer coatings on the internal surface of macroporous ...

El objetivo general del siguiente experimento es preparar un nuevo material de soporte con un rendimiento mejorado en la extracción selectiva de péptidos fosforilados. Esto se logra mediante la preparación adecuada de un monolito macroporoso de polímero con grupos funcionales apropiados. Primero, una especie metálica se inmoviliza en los grupos funcionales de un monolito de polímero, haciendo que el soporte sea selectivo para la extracción de péptidos fosforilados.A continuación, se realiza un crecimiento paso a paso de múltiples capas del armazón metalorgánico con el fin de aumentar la cantidad de sitios metálicos, aumentando así la selectividad para péptidos fosforilados. Los resultados muestran una mejor selectividad en la extracción de péptidos fosforilados a partir de digestiones proteicas basada en la espectrometría de masas por desorción/ionización láser asistida por matriz y tiempo de vuelo. El enriquecimiento de péptidos O generalmente se lleva a cabo mediante cromatografía de afinidad por iones metálicos, que se realiza sobre partículas de sílice convencionales o partículas poliméricas, las cuales se empaquetan en una columna cromatográfica.Nuestro material combina las ventajas de un monolito polimérico macroporoso, que posee buenas propiedades de transporte de masa, con la alta capacidad de unión de un armazón organometálico. Logramos esto mediante el crecimiento secuencial del armazón organometálico a partir de la superficie del monolito, de modo que al final contamos con múltiples capas de líneas metálicas disponibles para interactuar con el analito. La demostración visual de la preparación del monolito polimérico y del crecimiento del armazón organometálico es fundamental, ya que ambos procesos son muy difíciles de aprender. Existen varios pasos importantes a los que se debe prestar atención para obtener un monolito con buenas propiedades superficiales y porosidad.Para comenzar, corte dos metros de una capilar de sílice fundida recubierta con poliamida y con un diámetro interno de 100 micrones conectada a una jeringa de vidrio de 25 mililitros y lave la capilar con acetona. Luego elimine la acetona enjuagando la capilar con agua. A continuación, coloque una jeringa de vidrio de 250 microlitros llena con hidróxido de sodio acuoso 0,2 molar en la bomba de jeringa y haga fluir la solución a 0,25 microlitros por minuto a través de la capilar durante 30 minutos con el fin de activar el recubrimiento interno de sílice.Después de 30 minutos, enjuague el capilar con agua hasta que el efluente sea neutro. Utilice tiras de pH de papel para verificar el flujo de pH neutro. A continuación, cargue la jeringa con ácido clorhídrico acuoso 0,2 molar y bombee la solución a través del capilar a 25 microlitros por minuto para protonar los grupos ciol; después de 30 minutos de flujo, enjuague nuevamente el capilar con agua hasta que el flujo sea neutro.Una vez que el pH sea neutro, enjuague los capilares con una jeringa de 250 microlitros llena con etanol al 100 %. A continuación, bombee una solución al 20 % de trimetil propil metacrilato en etanol a razón de 25 microlitros por minuto durante una hora para funcionalizar la superficie con grupos vinilo. A continuación, enjuague los capilares con acetona y luego séquelos con una corriente de nitrógeno.Deje reposar las muestras a temperatura ambiente durante la noche y luego córtelas en secciones de 20 centímetros de longitud. Prepare la mezcla de polimerización en un vial de vidrio de un mililitro con septum de goma según se describe en el protocolo de texto adjunto. Añada 1% de AIBN con respecto a los monómeros como iniciador y someta la mezcla a sonicación durante 10 minutos.A continuación, sujete un capilar de sílice no funcionalizado a una corriente de nitrógeno e insértelo a través del septo de goma en la mezcla de polimerización. Afloje ligeramente la tapa del vial y burbujee nitrógeno lentamente a través de la mezcla durante 10 minutos. Después de 10 minutos, levante el capilar de la corriente de nitrógeno desde la mezcla de polimerización hasta el espacio de cabeza del vial y cierre la tapa firmemente.Introduzca una de las capilares funcionalizadas a través del septo hasta la mezcla de polimerización. Utilice el exceso de presión generado por el nitrógeno para bombear la mezcla de polimerización hacia el interior de la capilar funcionalizada. Permita que varias gotas de la mezcla de polimerización fluyan por el efluente de la capilar para asegurar que se ha llenado completamente, y luego ciérrela con un septo de goma.Saque el capilar del vial con mucha precaución y cierre la entrada con un septum de goma. Coloque la mezcla contenida en el capilar en un baño de agua caliente a 60 grados Celsius durante seis horas para polimerizar. Una vez finalizado, enfríe el capilar a temperatura ambiente y luego corte unos milímetros de ambos extremos del capilar. A continuación, use una bomba de HPLC para lavar la columna con acetonitrilo a cuatro microlitros por minuto durante 30 minutos.Esto eliminará cualquier monómero inactivo y agentes formadores deficientes. Verifique la presión posterior de la columna capilar. A continuación, lave el monolito capilar en ciclos con los reactivos mostrados aquí para hacer crecer el recubrimiento orgánico metálico final.El grosor del recubrimiento se determina por el número de ciclos realizados. Lave los capilares con el recubrimiento organometálico preparado utilizando 100 microlitros de una mezcla cuatro a uno de acetonida trial y ácido tricloroacético acuoso al 0,1%. Luego, pase un digesto proteico a través de la columna a dos microlitros por minuto.Durante 30 minutos, lave nuevamente los péptidos no fosforilados con una mezcla en relación cuatro a uno de acetonitrilo y ácido trifluoroacético acuoso al 0,1 % durante 10 minutos a un caudal de un microlitro por minuto. Lave con agua durante 10 minutos a un caudal de un microlitro por minuto. Eluya los péptidos fosfo utilizando una solución tampón de fosfato 250 micromolar a pH 7, haciendo pasar la solución a través de la capilar a un caudal de un microlitro por minuto durante 15 minutos, recoja el eluido en un vial y desalinice la solución siguiendo un protocolo estándar.A continuación, prepare una solución de dos miligramos por mililitro de ácido dos cinco dihidroxibenzóico en metanol, y mezcle dos microlitros de esta solución con dos microlitros de la solución de fosfopéptido aludida. En la punta de una pipeta, coloque esta mezcla directamente sobre la placa de desorción/ionización por láser asistida por matriz, y deje secar completamente la muestra. Analice las muestras mediante espectrometría de masas por desorción/ionización por láser asistida por matriz y tiempo de vuelo; finalmente, regenere la columna lavándola exhaustivamente con agua, seguido de metanol en capilares modificados con múltiples capas de hierro disponible.Tres grupos son ideales para su uso en cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados; aquí se muestran espectros obtenidos de proteínas digeridas antes y después del enriquecimiento, que muestran una selectividad notable para 12 péptidos fosforilados diferentes. Experimentos representativos de caracterización proporcionan información valiosa sobre la aparición de nuevos poros. A continuación se muestra una imagen de un monolito en polvo masivo después de 30 ciclos de polímero coordinado poroso, conocidos como ciclos PCP, obtenida mediante microscopía electrónica de barrido.Después de 30 ciclos de PCP, se encontró que el tamaño de los anchos de poro en el material era inferior a tres nanómetros de diámetro en comparación con el polímero masivo. El material híbrido presenta una gran cantidad de área incremental con poros pequeños. Esto conduce a un aumento en la absorción de nitrógeno a través de un rango de presiones utilizando espectroscopía de infrarrojo por transformada de Fourier.La incorporación inicial de los grupos funcionales carboxílicos fue visible, así como el crecimiento del recubrimiento tras 10, 20 y 30 ciclos de PCP. Finalmente, se utilizó análisis termogravimétrico para medir la cantidad de sitios metálicos adicionales que se acumularon en cada ciclo. Aquí se muestra el análisis gravimétrico a través de un rango de temperaturas, que confirma la presencia de un mayor número de sitios metálicos conforme aumenta el número de ciclos.Tras seguir este protocolo, se puede desarrollar un procedimiento similar para diferentes centros metálicos en ligandos orgánicos con el fin de lograr separaciones eficientes de distintos analitos según su afinidad por un entramado particular. Considero que los materiales compuestos como el nuestro, que combinan polímeros macroporosos con estructuras organometálicas, tienen un gran potencial en el campo de la ciencia de las separaciones porque pueden mejorar notablemente la selectividad, la capacidad de unión y la eficiencia general de las separaciones, tanto a escala analítica como preparativa.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Chemistry

Química

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Preparación de altamente poroso Coordinación Polymer Coatings en macroporosas Polymer Monolitos de Enriquecimiento mejorada de Phosphopeptides (Video) | JoVE Journal

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