Name: Implantación de miniosmótica Bombas y Entrega de Trazadores del Tracto para estudiar la reorganización del cerebro en condiciones fisiopatológicas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Aprende a implantar minibombas osmóticas y administrar trazadores del tracto para estudiar la reorganización cerebral en condiciones patológicas. Este método permite analizar cambios en la conectividad neuronal y evaluar agentes terapéuticos en investigación neurorestauradora.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Dr. Werner Jackstädt (a Eduardo Sánchez-Mendoza), el Servicio Alemán de Intercambio Académico (DAAD; a Jeismar Carballo), el Consejo Alemán de Investigación (HE3173/2-1, HE3173/2-2 y HE3173/3-1; a Dirk M. Hermann), la Fundación Heinz Nixdorf (a Dirk M. Hermann).

Los experimentos con animales se realizaron con la aprobación del gobierno (G1361 / 13, AZ84-02.04.2013.A192 y G1362 / 13, AZ84-02.04.2013.A194; Bezirksregierung Düsseldorf) basado en directrices de NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Bombas 1. Preparación de miniosmótica <ol><li> En un entorno estéril (es decir., Campana de cultivo de células), obtener la bomba, catéter, moderador, infusión de cerebro cánula y los discos distanciadores para ser utilizado (Figura 1) de flujo. </li><li> Para la entrega de medicamentos directamente en los ventrículos utilizar un disco espaciador de modo que sólo la punta de la cánula de la aguja está en contacto con el ventrículo. Sujete la cánula al revés con un fórceps. Añadir dos gotas de adhesivo de cianoacrilato (CA) e introducir un disco espaciador. </li><li> Deja la cánula sobre una superficie plana orientada hacia arriba de manera que el pegamento entre el disco espaciador y se seca la cánula. </li><li> Cortar el catéter en secciones de aproximadamente 2,5 cm. </li><li> Para eabomba ch, preparar un mínimo de de 300-350 l de la solución de interés, ya que será necesaria para llenar completamente la bomba de extrusión por lo tanto todo el aire dentro de ella para evitar la formación de burbujas dentro del catéter. Bubbles impedirá el flujo de la solución en el cerebro. </li><li> Conectar cuidadosamente el catéter hasta el moderador de flujo. </li><li> Usando una jeringa de 2 ml conectado a la aguja proporcionado por el kit de infusión de cerebro, llenar la bomba hasta que una pequeña cantidad de solución escapa de la bomba, evitando de este modo las burbujas de aire en su interior. </li><li> Llene cuidadosamente el moderador de flujo y el catéter de prestar atención a impedir la realización burbujas restantes en el interior del catéter. </li><li> Introducir el moderador de flujo dentro de la bomba. </li><li> Una vez lleno, conecte cuidadosamente la cánula al extremo del catéter. Si se observa que una burbuja se forma quitar la cánula y cuidadosamente rellenar el catéter con vehículo o solución de fármaco y luego reintroducir la cánula. </li><li> Coloque el pump en un recipiente con solución salina estéril y dejar a 37 ° CO / N. </li><li> Antes de la implantación vuelva a revisar para la formación de burbujas. Si es necesario (es decir., Se observan burbujas) retire la cánula y vuelva a llenar el tubo. Vuelva a conectar la cánula. Esto debería tomar sólo unos pocos microlitros de solución. </li></ol> Bombas 2. Implantación de miniosmótica Nota: Para estos experimentos los animales fueron anestesiados por 1% de isoflurano (30% O 2, el 70% de N 2 O). Sin embargo, si esto no está disponible, el uso de inyecciones intraperitoneales de anestesia También es posible 11. <ol><li> Busque el animal en el dispositivo estereotáctico bajo anestesia y cubrir los ojos con un ungüento de protección para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia. Confirmar la anestesia mediante la observación de una falta de respuesta en la pata trasera cuando se presiona con los dedos o con un fórceps. No continúe hasta que el animal está completamente dormido. </li><li> Cortar la piel sobre la queanuncio, ya sea con unas tijeras o una máquina de afeitar. Cortar tanto como sea posible sin dañar la piel. </li><li> Limpiar la piel con etanol 70% y desinfectante con propiedades antibacterianas y fungicidas. </li><li> Con un escalpelo abrir una incisión de 1 cm ligeramente a la derecha de la línea media y exponer el cráneo. </li><li> Limpie el cráneo con un hisopo de algodón. Remojar con etanol al 70% y pasarlo sobre el cráneo. Esto inducirá el cráneo se seque. </li><li> Si el cráneo tiene sangrado ligero, use un cauterizador para eliminar ningún punto de sangrado. La sangre impide que la CA se seque adecuadamente sobre el hueso una vez se implanta la cánula. </li><li> Utilice el dispositivo estereotáctica para hacer una marca en el punto del cráneo donde se implantará la cánula. Para infusiones ventriculares en las coordenadas hemisferio izquierdo son -0.2 mm caudal, 0,9 mm lateral al bregma (Figura 2). </li><li> Perforar suavemente sobre el cráneo haciendo un ángulo de 45 °; esto evita que el taladro de ir accidentalmente en el Brainorte. Repetidamente perforar durante unos segundos y luego verifique la profundidad del agujero es. Deje de perforar una vez que el cráneo se ha adelgazado, pero aún no está totalmente penetrado. </li><li> Romper las meninges con la punta de una aguja estéril hasta que se logre el pleno acceso al cerebro. Hágalo con cuidado para no dañar el cerebro. </li><li> Limpie el cráneo con etanol al 70% utilizando un hisopo de algodón. </li><li> Introducir un fórceps rectos debajo de la piel del animal en una dirección antero-caudal. Utilice las pinzas para abrir el espacio de debajo de la piel en el lomo del animal en la que se implanta la bomba. Introducir la bomba en la parte posterior del animal dejando el catéter y la cánula exterior (Figura 2B). La bomba se mantendrá en esta posición hasta que se retira y no necesita ningún tipo de fijación. </li><li> Colocar con cuidado cuatro pequeñas gotas de pegamento al lado de la aguja en la cánula. </li><li> Introducir cuidadosamente la aguja a través del cráneo sin moverlo hacia los lados. Manténgalo en posición durante 15 a 30 segundos uasta la cánula está completamente unido (Figura 2C.1). Una vez en su lugar, la cánula llegará a 2,5 mm en la dirección ventral dorso si un disco espaciador se ha utilizado. Si adjunta correctamente, la cánula permanecerá adherida al hueso hasta el final del experimento. </li><li> Coloque un dedo sobre la lengüeta extraíble y luego usar la otra mano para cortarlo por el cuello con un conjunto de tijeras (Figura 2C.2). </li><li> Cierre de la herida en la piel con una sutura de 5-0 y añadir unas gotas de solución de povidona yodada (PVP-I) en la parte superior de la herida para prevenir la infección (Figura 2D). </li><li> Mueva el animal en una nueva jaula. No coloque animales operados con animales que aún no han sido operados. Mantenga a los animales que han sido implantados con bombas solos en sus jaulas durante el momento de la administración del fármaco. </li><li> No deje los ratones sin vigilancia hasta que estén despiertos y han recuperado decúbito esternal. </li></ol> 3. Bomba Removal Nota: Por lo general, el experimento terminará al final del plazo de entrega permitido por la bomba, sin embargo, es posible quitar la bomba con el fin de hacer experimentos secundarios como un seguimiento de la administración de fármacos. Con el fin de hacer inyecciones de trazadores de las vías por lo que es necesario retirar la bomba. <ol><li> Colocar el animal en el dispositivo de seterotactic bajo anestesia y cubrir los ojos con pomada protectora para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia. Confirmar la anestesia mediante la observación de una falta de respuesta en la pata trasera cuando se presiona con los dedos o con un fórceps. No continúe hasta que el animal está completamente dormido. </li><li> Abrir con cuidado la piel cortando a través de la incisión realizada en el día de la implantación de la bomba. </li><li> Con una pinza quirúrgica sostener la cánula y tire de ella. Se debe retirar fácilmente del cráneo. Como se espera sangrado suave, detenerlo mediante la colocación de un hisopo de algodón y esperar 1-2 minutos. </li><li> Tire de la bomba por el catéter. Éllp que os salga empujándola, creando presión sobre la piel. </li><li> Cierre de la herida de nuevo con una sutura de 5-0 y añadir unas gotas de PVP-I. </li><li> Mueva el animal en una nueva jaula. No coloque animales operados con animales que aún no han sido operados. Los animales que han sido sometidos a cirugía se pueden juntar. </li><li> No deje los ratones sin vigilancia hasta que estén despiertos y han recuperado decúbito esternal. </li><li> Deje que el animal se recupere durante 10 días antes de proceder a la inyección de trazador vías. </li></ol> 4. Presión Tracto trazador inyección en ángulos de 45 ° sobre el derecho Corteza Motora <ol><li> Colocar el animal en el dispositivo estereotáctico bajo anestesia y cubrir los ojos con un ungüento de protección para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia. Confirmar la anestesia mediante la observación de una falta de respuesta en la pata trasera cuando se presiona con los dedos o con un fórceps. No continúe hasta que el animal está completamente dormido. </li><li> Abra la herida en la cabeza. </li><li> doincline el cráneo con un 70% de etanol utilizando un hisopo de algodón. </li><li> Introducir una jeringa de vidrio de 5 l (26S ga) en el soporte vertical del dispositivo. Asegúrese de que el extremo inferior del soporte de vidrio es, precisamente, en la pieza de sujeción. La jeringa no debe ser demasiado lejos por debajo de ella como entonces será imposible para colocarlo en 45 ° desde la posición vertical y realizar la inyección. </li><li> Oriente la jeringa directamente sobre bregma y busque las coordenadas deseadas. Para una inyección en las coordenadas corteza motora son: Punto # 1: +0,5 mm rostral y 2,5 mm lateral con respecto al bregma. Punto # 2: 1,34 mm rostral, 2,5 mm lateral con respecto al bregma. </li><li> Una vez que las coordenadas se han localizado, indicar su posición sobre el cráneo con un marcador con una punta fina. Hacer sólo un punto en el cráneo como la liberación de tinta excesiva podría ocultar la correcta coordenadas. </li><li> Perforar con cuidado el cráneo que sostiene el taladro a 45 °. Como en el paso 2.8, compruebe el cráneo con frecuencia por lo que no es totalmente perfcorporado con el fin de evitar daños en el cerebro causada por el taladro. Utilice la punta de una jeringa para asegurar que todo el hueso se ha eliminado. </li><li> Carga de 600 nl de dilución del trazador tracto dentro de la jeringa. </li><li> Ajustar la posición vertical a 45 ° hacia el lado derecho del animal. Bajo el microscopio, coloque la punta de la aguja de la jeringa justo en frente del agujero. </li><li> Moverlo en la dirección vertical de 1,5 mm. Deje la aguja constante en esta posición durante 30 segundos a 1 minuto antes de hacer inyecciones de presión. </li><li> Inyectar 300 nl de dilución trazador en tres pasos de 100 nl separadas entre sí por 30 seg. Después de la última inyección, deje la jeringa constante durante 30 seg a 1 min a fin de evitar el trazador a fluir fuera del cerebro. </li><li> Lentamente tire de la jeringa, reubicarlo sobre el segundo agujero y repetir el mismo proceso con el 300 nl restante que están dentro de la jeringa. </li><li> Después de la segunda inyección, retire la jeringa y proceder a cerrar el que estánd con una sutura de 5-0 y añadir unas gotas de PVP-I. </li><li> Mueva el animal en una nueva jaula. No coloque animales operados con animales que aún no han sido operados. Los animales que han sido sometidos a cirugía se pueden juntar. No deje los ratones sin vigilancia hasta que estén despiertos y han recuperado decúbito esternal. </li><li> Deje que el animal se recupere durante 10 días antes del sacrificio. </li></ol> 5. Tracto trazador Observación <ol><li> Anestesiar el animal totalmente por las directrices institucionales. Confirmar la anestesia mediante la observación de una falta de respuesta en la pata trasera cuando se presiona con los dedos o con un fórceps. No continúe hasta que el animal está completamente dormido. </li><li> Perfundir los animales con 4% de paraformaldehído en PBS (pH 7) bajo protocolos estándar 6. </li><li> Retire el cerebro y posterior corrección por O / N inmersión en paraformaldehído al 4%. </li><li> Cryoprotect cerebros en sacarosa al 30% hasta que el cerebro se hunden. A continuación, retire el cerebro y congelar por 10 seg inmersión en nitrógeno líquido. Mantenga cerebros a -80 ° C hasta que se producen secciones. </li><li> Producir secciones a 20 micras para el análisis trazador tracto retrógrada y de 40 micras para el análisis trazador vías anterógrada seccionando en un cryostate. </li></ol> Nota: Las neuronas FG marcado se puede observar como las células blancas bajo la luz ultravioleta de excitación. BDA es detectado por O / N de incubación con un complejo avidina-biotina-peroxidasa y 3,3 &#39;diaminobencidina con la adición de níquel al 0,4% para mejorar el contraste de las fibras de 6,7.

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</ol>

Producción y el acceso abierto tasas de publicación proporcionadas por DURECT Corporation, que produce las bombas miniosmóticas utilizados en este artículo.

Durante muchos años, la investigación sobre enfermedades neurodegenerativas como el accidente cerebrovascular isquémico o lesión cerebral traumática se ha centrado en el desarrollo de terapias neuroprotectoras que tienen como objetivo promover la supervivencia neuronal en la fase de accidente cerebrovascular agudo. La gran mayoría de las terapias de drogas que se han encontrado para ser eficaz en modelos de roedores fallidas cuando se traduce a la clínica. Las razones para este fracaso terapéutico incluyen, pero no se limitan a la falta de efectos sostenida de fármaco que resulta en la persistencia de la recuperación neurológica funcional. Por tanto, es importante desarrollar estrategias que promueven la remodelación del cerebro en el largo plazo. Debido a que la promoción de la supervivencia neuronal por sí sola no es suficiente para permitir la recuperación de accidente cerebrovascular con éxito, según lo sugerido por el gran número de ensayos de neuroprotección fallidos, la estimulación de la plasticidad neuronal ha obtenido recientemente un gran interés en el campo. Medios para la administración de fármacos son la inyección intraperitoneal, cola i intravascularnjection, inyección femoral, inyección estereotáctica simple de los vectores en el cerebro y continuado de suministro constante mediante bombas miniosmóticas. Este último puede incluir la administración sistémica, si la bomba no tiene una cánula, o que se puede-dirigió órgano, como hemos demostrado para la entrega en el cerebro. Con la excepción de las bombas miniosmóticas y el uso de vectores virales, todas las otras estrategias inducirán concentraciones de fármaco fluctuantes. Para los experimentos a largo plazo que se convierte así en necesario someter al animal a la tensión de recibir inyecciones frecuentes. La BBB impone un impedimento importante para la captación cerebral de las proteínas o fármacos de la sangre, resultando en la necesidad de proteínas o de drogas enormes dosis con el fin de conseguir concentraciones terapéuticas en el cerebro. Por ejemplo Pellegrini et al. (2013) 5 rhEpo entregado por inyección intraperitoneal a una dosis equivalente a 75 UI / día para un animal de 30 g (750 UI / día para un 300 g de rata). En comparación, la entrega de RHEP dirigidao al cerebro nos permitió utilizar una dosis mucho más baja de sólo el 10 UI / día en nuestro estudio para la recuperación del accidente cerebrovascular con éxito, lo que nos permitió lograr la recuperación en una gran escala de tiempo a una tasa fija de 0,25 l / h. En este trabajo hemos demostrado el método de implantación de minibombas con una cánula conectada al cráneo con el fin de entregar la proteína de la plasticidad de promoción rhEpo directamente en el ventrículo, eludiendo así el BBB. Mediante este método, rhEpo promueve la recuperación neurológica en un número de maneras, incluyendo la reducción del tamaño del infarto, reducción de la formación de la cicatriz glial y la inducción de la angiogénesis. rhEpo también promovió la supervivencia neuronal y el aumento de las proyecciones de la corteza motora contralesional hacia el núcleo rojo denervado y núcleos faciales. El surgimiento de las fibras fue revelado por inyección del trazador anterógrado del tracto BDA en el cortex motor (Figuras 4A y 5A). Un correlato funcional para el surgimiento de las fibras es provided por la mejora de las habilidades motoras (Figura 5B). Además, hemos demostrado que el mismo enfoque para la inyección del trazador tracto se puede aplicar para dar a conocer las conexiones tálamo-cortical por inyección del trazador FG retrógrada del tracto (Figura 6B). En la preparación de la bomba miniosmótica, es fundamental tener en cuenta el punto de destino y el uso de espaciadores. Utilizamos un espaciador para reducir la longitud de la aguja de 0,5 mm como de esta manera la punta de la aguja está en contacto con el ventrículo en las coordenadas dadas (-0,2 mm caudal, 0,9 mm lateral, 2.5 mm dorso ventral, con respecto a bregma). Sin embargo, si las estructuras más profundas son el objetivo de la investigación, entonces no se necesitarán espaciadores. Del mismo modo, si se desea un punto de entrega más externa (es decir., La corteza), será necesario entonces más discos espaciadores. El catéter debe ser lo suficientemente largo para que la bomba no está demasiado cerca de la cabeza, ya que impedirá movimientos del mouse, sino también la longitud excesiva no demasiado largo ya que una vez implantado puede hacer que el catéter se doble, lo que aumenta el riesgo de eliminación de la cánula por el movimiento natural del ratón. Una sección de 2 cm de catéter da muy buenos resultados en términos de movilidad y estabilidad del implante (Figuras 1 y 2). La incubación de la bomba a 37 ° CO / N permite que la bomba para iniciar de inmediato el bombeo de la droga en el cerebro en el momento de la implantación. En la implantación de la bomba miniosmótica es crítico para asegurar que el cráneo se seca adecuadamente antes de la implantación de la cánula. Por lo general, la limpieza con 70% de etanol inducirá el hueso para secar, pero si se encuentra sangrado continuo, tocando el cráneo suavemente con un cauterizador se seque completamente. Es crítico para asegurar que la introducción de la aguja es tan vertical y lenta como sea posible. Una vez en posición, y mientras el pegamento se está secando, colocando el dedo en la parte superior de la cánula impide que se mueva hacia los lados over el cráneo. Especial cuidado se debe dar a la herida y la colocación de la cánula. Es importante que la incisión no se realiza exactamente sobre la línea media del cráneo, pero ligeramente hacia el lado derecho. Al cerrar la herida, si la incisión fue hecha en la línea media, la piel estará sobrecargado, lo que aumenta el riesgo de la apertura de la herida. Hacer la incisión ligeramente hacia un lado permitirá que los puntos de sutura para estar lejos de la parte más alta de la cánula. Como consecuencia habrá menos tensión en los puntos de sutura y la herida se cure adecuadamente. Los animales deben ser enjaulados solo y comprobar todos los días, especialmente durante los primeros 10-15 días después de la implantación. En caso de dehiscencia de la herida, heridas tienen que cerrarse tan pronto como sea posible. Si la cánula es retirado o el animal presenta una infección, el experimento tiene que ser terminada. No se recomienda la reimplantación de la cánula. Es muy importante para la implantación exitosa de usar cantidades adecuadas de tejido adadhesivo (no demasiado!) ya que se degrada el hueso y aumenta el riesgo de eliminación de cánula. Sin embargo, utilizando muy poco adhesivo también no sostendrá la cánula unida al hueso. Las bombas miniosmóticas pueden transportar medicamentos disueltos en una amplia variedad de sustancias, siendo la única limitación a esto que el disolvente es biocompatible. Además, dado que el volumen es pequeño (200 l), uno debe determinar si la concentración requerida para el experimento es adecuado y no provocar la precipitación dentro de la bomba. Tracto rastreo, ya sea con anterógrada o retrógrada trazadores es una técnica muy bien establecida para estudiar la conectividad cerebral y la plasticidad. Se debe tener en cuenta los marcos de uso estereotáxica al inyectar para asegurar la precisión en la orientación de la zona del cerebro que se desea estudiar (es decir, para evitar la inyección en el cuerpo calloso cuando se inyecta la corteza). Para todas las intervenciones quirúrgicas y con el fin de reducir el dolor yinflamación, los animales deben ser tratados con 0,1 mg / kg de buprenorfina antes de la intervención y Caprofen a 4 mg / kg una vez al día durante tres días después de la intervención. En conclusión, este enfoque proporciona una herramienta adecuada para el estudio de efecto de las proteínas o compuestos farmacológicos en el cerebro lesionado, lo que representa un método que es muy adecuado para estudios sobre la plasticidad del cerebro.

La administración de proteínas y compuestos farmacológicos en el cerebro son estrategias importantes para estudiar los mecanismos subyacentes a las enfermedades cerebrales y evaluar moléculas candidatas para nuevos tratamientos 1,2. En neurociencias experimentales, la administración de vectores como plásmidos o adenovirus se ha convertido en una herramienta importante para estudiar las acciones a largo plazo de las proteínas en el cerebro 3,4. Las inyecciones únicas de vectores presentan la ventaja de un sistema que, por sí solo, mantendrá niveles altamente estables del agente terapéutico en el cerebro 4. Sin embargo, para experimentos a largo plazo con fármacos purificados, la administración sistémica por inyección intraperitoneal induce estrés en ratones o ratas, y no es la mejor opción cuando se necesita una respuesta cerebral dirigida, requiriendo también grandes dosis de fármaco5. Las bombas miniosmóticas representan un sistema ideal para la administración directa prolongada del fármaco en el cerebro, evitando tanto la baja accesibilidad al cerebro como los picos de concentración del fármaco, ya que la administración del fármaco se produce directamente en un lugar específico del cerebro y a un caudal fijo determinado por el modelo de bomba elegido2,6,7. De hecho, este sistema nos ha permitido estudiar con éxito la recuperación cerebral después de un accidente cerebrovascular mediante la administración de varios fármacos como la eritropoyetina humana recombinante (rhEpo) y el factor de crecimiento endotelial vascular 6,7. 
La plasticidad cerebral es esencial para el recableado de las conexiones en respuesta a lesiones cerebrales. La plasticidad es un concepto amplio que abarca desde la formación o eliminación de contactos sinápticos, el crecimiento de espinas dendríticas y también la elongación o retracción de conexiones a larga distancia8,9. Anteriormente se creía que el cerebro no era capaz de reconstruir las conexiones después de una lesión. Sin embargo, muchos enfoques han demostrado que, si se estimula adecuadamente, puede restablecer la conectividad 6,7,10. Una técnica que es particularmente útil para estudiar esto es el uso de trazadores de tracto. Los trazadores del tracto anterógrado son compuestos que pueden entrar en las neuronas en el soma y luego distribuirse a lo largo de los axones hasta que estos alcanzan sus estructuras objetivo. Dos ejemplos son el azul en cascada (CB) y la amina de dextrano biotinilada (BDA). Por el contrario, los trazadores del tracto retrógrado, como la toxina del cólera B (CTB) o el fluororo (FG) ingresan a la neurona a través del terminal del axón y luego se distribuyen de nuevo al soma, revelando así el sitio de origen de las neuronas que se dirigen al sitio de inyección.
Aquí, presentamos los métodos que utilizamos para la implantación de bombas miniosmóticas para la administración directa de proteínas o fármacos que tienen efectos potenciales sobre la plasticidad neuronal, así como la inyección de BDA y FG para revelar las conexiones de entrada y salida a la corteza motora. El BDA también se utilizará como ejemplo de un trazador de tracto utilizado para demostrar una mayor plasticidad de los axones que emergen del co después de un accidente cerebrovascular bajo el tratamiento con rhEpo.

<table><tbody><tr><td>Bomba miniosmótica Alzet. Modelo 2004.</td><td>Alzet</td><td>000298</td><td>Contenedor de fármaco</td></tr><tr><td>Kit de infusión cerebral 3 1-3 mm</td><td>Alzet</td><td>0008851</td><td>Sistema de administración de fármaco</td></tr><tr><td>cerebral Loctite&nbsp; 454 Gel prisma&nbsp;</td><td>Loctite</td><td>45404</td><td>Adhesivo de cianoacrilato para la adhesión de la cánula al cráneo</td></tr><tr><td>Jeringa de vidrio 75N&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>87900/00</td><td>Inyección de trazadores de tracto</td></tr><tr><td>Biotina Dextrano Amina (10.000 MW)</td><td>Sondas moleculares</td><td>N-7167</td><td>Trazador de tracto anterógrado</td></tr><tr><td>Fluorogold</td><td>Fluorochrome, LLC.</td><td></td><td>Inyector</td></tr><tr><td>estereotáxico por excelencia (QSI)</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td>Dispositivo estereotáctico para la determinación de coordenadas, implantación de bombas e inyección de trazador de tracto.</td></tr></tbody></table>

implantación de miniosmótica bombas y entrega de trazadores del tracto para estudiar la reorganización del cerebro en condiciones fisiopatológicas

Implantation of Miniosmotic Pumps and Delivery of Tract Tracers to Study Brain Reorganization in Pathophysiological Conditions

El tratamiento farmacológico en modelos animales de enfermedad cerebral impone el problema de los protocolos de inyección repetida que pueden inducir estrés en los animales y dar lugar a niveles tisulares impermanentes del fármaco. Además, la administración de fármacos al cerebro es delicada debido a la barrera hematoencefálica (BBB), lo que reduce significativamente las concentraciones intracerebrales de fármacos selectivos tras la administración sistémica. Por lo tanto, un sistema que permite tanto la administración constante de fármacos sin niveles máximos como la elusión de la BHE es lograr concentraciones intracerebrales suficientemente altas de fármacos que sean impermeables a la BHE. En este contexto, las bombas miniosmóticas representan un sistema ideal para la administración constante de fármacos a una velocidad fija conocida que elude el problema del estrés de las inyecciones diarias en animales y que también puede utilizarse para la administración directa de fármacos en el cerebro. En este trabajo se describe un método para la implantación de bombas miniosmóticas y los cuidados postoperatorios que se deben dar a los animales para aplicar con éxito esta técnica. Incorporamos el paradigma experimental antes mencionado en los procedimientos estándar que se utilizan para estudiar la neuroplasticidad dentro del cerebro de ratones C57BL6. Por lo tanto, expusimos a los animales a un infarto cerebral de 30 minutos y se les implantaron bombas miniosmóticas conectadas al cráneo a través de una cánula para administrar un fármaco pro-plasticidad. Las pruebas conductuales se realizaron durante 30 días de tratamiento. Después de la retirada, los animales recibieron inyecciones de trazadores del tracto anterógrado para analizar la plasticidad neuronal en la fase crónica de recuperación. Los resultados indicaron que la neuroprotección por el fármaco administrado se acompañó de un aumento de las fibras motoras que cruzan la línea media del cerebro en las estructuras diana. Los resultados confirman el valor de estas técnicas para la administración de fármacos y los estudios de plasticidad cerebral en la neurociencia moderna.

Presentamos los animales a los 30 min de oclusión de la arteria cerebral media por el método de sutura intraluminal inducir una lesión en el cuerpo estriado izquierdo y luego entregado rhEpo directamente en el cerebro por medio de bombas miniosmóticas (Figura 1, Figura 3) durante 30 días a partir de 3 días después accidente cerebrovascular 6. La Figura 4 muestra un esquema del tracto espinal cortico que fue rastreado después de CB y BDA inyección y el área donde se inyectaron trazadores. Nos mostró una mejora de la fuerza de agarre y el rendimiento del motor (Figura 5) después de 14 y 42 días de entrega rhEpo respectivamente. Entrega de BDA en el cortex motor derecho de los animales que recibieron un golpe en el cuerpo estriado izquierdo, mostró un aumento en fibras motoras de cruzar la línea media a nivel del núcleo rojo y facial (Figura 5), lo que demuestra la tinción con éxito de la germinación fibras como consecuencia del tratamiento farmacológico con miniosmotBombas ic. tratamiento rhEpo también aumentó la supervivencia neuronal, retraso astrocitosis difusa, reduce la formación de cicatriz glial y el aumento de la angiogénesis en el período estudiado 6. Mediante el uso de esta misma técnica para la inyección del trazador tracto podemos detectar con éxito núcleos talámicos que están conectados a la corteza mediante la inyección de la retrógrada trazador FG tracto (Figura 6). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52932/52932fig1.jpg" /> Figura 1. Componentes de la bomba miniosmótica utilizado en este protocolo. El disco espaciador, cánula y pestaña desprendible, catéter, flujo moderador y bomba miniosmótica se pueden observar. El aspecto de la bomba completamente montado se puede ver en la figura 2A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig1large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> entro-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52932/52932fig2.jpg" /> Figura 2. Resumen de los puntos clave de implantación de la bomba. (A) El ratón se muestra como se coloca en el dispositivo estereotáctica con la bomba miniosmótica totalmente construido al lado de él. La flecha indica las coordenadas seleccionadas para la implantación. (B) La bomba se ha introducido en la parte posterior del animal y sólo la cánula permanece en el exterior. El cráneo ya ha sido perforado. (C) Aspecto de la cabeza después de la implantación. (C.1) La cánula está en posición, pero la pestaña extraíble no ha sido cortada. (C.2) La pestaña extraíble ha sido cortado y cosido de la herida puede ahora comenzar. (D) El asterisco muestra un animal recientemente implantado en comparación con un animal 30 días después de la implantación (#). Cuando ubicado correctamente, la herida debe permanecer cerrada hasta el final del procedimiento, como se muestra en la imagen.ove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/52932/52932fig3.jpg" /> Figura 3. tinción de Nissl que indica el lugar del implante en la corteza. Una pequeña incisión se puede observar en la parte de la corteza izquierda (flecha). La anchura de la zona penetrado es de aproximadamente 50 micras. La hay evidentes graves alteraciones de los tejidos basado en tinción de Nissl en comparación con la zona contralateral correspondiente (*). R: hemisferio derecho. L: hemisferio izquierdo. Barra de escala = 300 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52932/52932fig4.jpg" /> Figura 4. Tractoestrategia de inyección de trazador como publicado antes por Reitmeier et al. 6,7. (A) los sitios de inyección que indican esquemáticos para el trazador tracto BDA en la corteza motora contralateral mientras que CB se inyectaron en la corteza motora del hemisferio infartado. Las fibras se siguieron hasta el núcleo rojo (no mostrado) y el núcleo facial (véase la Figura 5). (B) El sitio de la inyección del trazador anterógrado del tracto BDA al lado de la corteza motora se muestra. Tenga en cuenta la flecha roja que indica el trayecto de la aguja mientras que la flecha negro muestra algunas células corticales etiquetados con el BDA. Cx: Corteza. CC: cuerpo calloso. V: ventrículo. FN: núcleo facial. Barra de escala en B = 200 micras. Figura 4A se reproduce con el permiso 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt = &quot;Figura 5&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52932 / 52932fig5.jpg&quot; /&gt; Después se detecta la Figura 5. Recuperación de un cerebro infartado después de la entrega de rhEpo. (A) BDA inyecta en la corteza motora contralesional en fibras corticobulbares a nivel del núcleo facial (Bregma -5,8 mm a -6,3 mm). Líneas de intersección de cada hemisferio se elaboraron en paralelo a la línea media y fibras que cruzan cada línea en dirección al hemisferio ipsilesional y contralesional se contaron y se expresó como porcentaje de fibras marcadas totales en el tracto corticoespinal. La eritropoyetina aumentó cruces de fibra en la dirección de los contralesional faciales Datos núcleo son medios + - SD. Los datos fueron analizados por ANOVA de una vía seguida por menos pruebas de diferencias significativas, §p &lt;0,05 en comparación con los ratones no isquémicos tratados con vehículo. (B) Comportamiento Motor mostró una mejora de fuerza de prensión manual y la coordinación en la prueba de varilla rota. Los datos son medias values + - SD. Los datos fueron analizados por medidas repetidas de dos vías ANOVA, seguido de un modelo lineal / menos significativos pruebas de diferencias para cada punto de tiempo. §p &lt;0,05 en comparación con la línea base pre-isquémica; * P &lt;0,05 en comparación con los ratones isquémicos tratados con vehículo. Figuras 5A y B se reproducen con el permiso 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52932/52932fig6.jpg" /> Figura 6. estructuras de destino alcanzada después de la inyección de Fluorogold (FG). (A) el lugar de inyección de FG al lado de la corteza motora, como se indica en la Figura 1. Nota la flecha roja indica el trayecto de la aguja y la flecha blanca indica unas pocas células marcadas en la corteza. (B) FG inyecta cerca del motorse detecta la corteza en el VPL. Fi: Fimbria. IC: cápsula interna. RT: núcleo reticular talámico. VPL: talámico núcleo ventral posterolateral. Barra de escala = 200 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Con el fin de estudiar la reorganización del cerebro en condiciones patológicas, utilizamos bombas miniosmóticas para la entrega directa de proteínas al cerebro, eludiendo la barrera hematoencefálica. A continuación, se inyectan trazadores del tracto para estudiar las alteraciones en la conectividad cerebral bajo la influencia de la proteína.

Implantación de miniosmótica Bombas y Entrega de Trazadores del Tracto para estudiar la reorganización del cerebro en condiciones fisiopatológicas

Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and ...

El objetivo general de este procedimiento es implantar bombas osmóticas miniaturizadas para administrar agentes terapéuticos al cerebro y luego entregar trazadores de vías para estudiar las modificaciones en la conductividad de la vía corticoespinal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación neurorestauradora, como por ejemplo cómo se alteran las conexiones a larga distancia dentro de los sistemas nerviosos centrales en presencia de agentes terapéuticos potenciales. La principal ventaja de estas técnicas es que la administración continua del agente terapéutico garantiza la reproducibilidad de los resultados, mientras que los trazadores de vías son agentes muy confiables para seguir los cambios morfológicos en las conexiones a larga distancia.Por lo general, las personas nuevas en estos métodos tendrán dificultades porque la precisión y las habilidades quirúrgicas son esenciales para prevenir daños cerebrales como consecuencia de las diversas intervenciones. Estaré demostrando el procedimiento junto con Jeismar Carballo, una estudiante de posgrado del laboratorio del profesor Hammond. Comience por preparar la bomba osmótica miniatura en un entorno estéril.Primero, use pinzas para sostener la cánula de infusión cerebral boca abajo. Luego, agregue dos gotas de adhesivo de cianoacrilato e introduzca un disco espaciador para la administración del fármaco hacia el ventrículo. A continuación, corte el catéter a 2,5 centímetros y conéctelo cuidadosamente al moderador de flujo.Luego, para evitar la formación de burbujas de aire, utilice una jeringa de 2 mililitros conectada a una aguja para llenar la bomba hasta que una pequeña cantidad de solución salga de ella. Ahora, llene cuidadosamente el moderador de flujo y el catéter, asegurándose de que no haya burbujas dentro del catéter. A continuación, coloque el moderador de flujo dentro de la bomba.Una vez llenado, conecte cuidadosamente la cánula al extremo del catéter, coloque la bomba en un recipiente con solución salina estéril y déjela a 37 grados Celsius durante la noche. Después de anestesiar al animal según los protocolos aprobados y confirmar la anestesia mediante la ausencia de respuesta a un pellizco en la pata trasera, coloque al animal en un marco estereotáxico. Cubra los ojos con una pomada protectora para prevenir el secado.Además, corte el pelaje sobre la cabeza lo más cerca posible de la piel y limpie la piel con etanol al 70 por ciento y un desinfectante con propiedades antibacterianas y fungicidas. Después de usar un escalpelo para abrir una incisión de 1 centímetro ligeramente a la derecha de la línea media, exponga el cráneo y límpielo con un hisopo de algodón empapado en etanol al 70 por ciento. Después de colocar el brazo estereotáxico sobre el bregma, mueva el brazo estereotáxico hasta las coordenadas para dirigirse al ventrículo.Marque este punto en el cráneo. Taladre suavemente el cráneo en este punto con el taladro inclinado a 45 grados para evitar daños accidentales al cerebro. Taladre repetidamente durante unos pocos segundos y luego verifique la profundidad del orificio.Detenga la perforación una vez que el cráneo se haya adelgazado pero aún no se haya penetrado por completo, luego rompa las meninges con la punta de una aguja estéril hasta que el acceso al cerebro esté despejado. A continuación, introduzca fórceps rectos bajo la piel del animal en dirección anterocaudal y utilice los fórceps para abrir el espacio bajo la piel en la parte posterior del animal donde se implantará la bomba. Introduzca la bomba en la parte posterior del animal dejando el catéter y la cánula fuera.Coloque cuidadosamente cuatro gotas pequeñas de pegamento sobre la cánula junto a la aguja. A continuación, introduzca cuidadosamente la aguja a través del cráneo, sin moverla lateralmente. Manténgala en posición durante 15 a 30 segundos hasta que la cánula quede completamente fijada.Es importante ser cuidadoso y preciso al introducir la aguja de la bomba y asegurarse de que la cánula esté correctamente fijada al cráneo para garantizar que complete el período de administración sin que el animal la retire. A continuación, coloque un dedo sobre la lengüeta desmontable y use tijeras para cortarla en la parte estrecha. Por último, cierre la incisión con sutura de número cero y desinfecte la incisión cerrada con solución de povidona-yodo.Traslade el animal a una jaula limpia y monitórelo hasta que recupere la recumbencia esternal. El animal debe alojarse individualmente durante la administración del fármaco. Después de preparar, anestesiar y colocar al animal en el marco estereotáxico como antes, abra la piel cortando a través de la incisión utilizada para la implantación de la bomba, luego sostenga la cánula con una pinza quirúrgica y extráigala como se muestra.Debe retirarse fácilmente del cráneo. Detenga cualquier sangrado manteniendo un hisopo con punta de algodón en el sitio durante uno o dos minutos. Sujete el catéter y retire la bomba jalando el catéter y empujando la bomba al mismo tiempo.Tras la retirada de la bomba, cierre la herida como antes y aplique unas gotas de povidona-yodo. Transfiera el animal a una jaula limpia y monitórelo hasta que recupere la movilidad. Diez días después de la retirada de la bomba osmótica miniatura, anestesie al animal, regresarlo al marco estereotáxico y abra la herida craneal.Limpie el cráneo con etanol al 70 por ciento. Coloque adecuadamente una jeringa de vidrio de cinco microlitros en el soporte vertical del dispositivo estereotáxico. Oriente la jeringa directamente sobre el bregma y muévala a las coordenadas deseadas para inyectar la corteza motora.Realice una marca en este punto con un marcador de punta fina. A continuación, mueva la jeringa al segundo punto y haga una pequeña marca en ese lugar. Perfore cuidadosamente el cráneo en ambos puntos manteniendo la fresa en un ángulo de 45 grados.Nuevamente, no perforar completamente el cráneo y utilizar la punta de una aguja para retirar el resto del hueso. Cargar la jeringa con 600 nanolitros del trazador. Luego, ajustar la posición de la aguja a un ángulo de 45 grados en el lado derecho del cráneo.Mientras observa a través del microscopio quirúrgico, coloque la punta de la aguja justo frente al orificio e inserte la aguja en el cerebro hasta una profundidad de 1,5 milímetros. La velocidad mostrada es solo con fines de demostración. Normalmente, espere 30 segundos entre cada paso de 0,5 milímetros.Deje la aguja en su lugar durante 30 segundos a un minuto. Como ha observado, la penetración de la aguja durante la inyección del trazador se realiza desde la capa de manto para evitar dirigirse a áreas incorrectas, lo cual podría provocar resultados confusos entre individuos. La retirada lenta de la aguja evitará el reflujo del trazador.A continuación, inyecte 300 nanolitros de trazador en tres pasos de 100 nanolitros, separando cada paso con un intervalo de 30 segundos. Después de la última inyección, deje la jeringa en su lugar durante 30 segundos a un minuto antes de retirarla lentamente. Coloque la punta de la jeringa sobre el segundo orificio.Introduzca la aguja como antes y luego repita la inyección con los 300 nanolitros restantes en la jeringa. Después de la segunda inyección, retire la jeringa y cierre la herida con sutura de número cero cinco. Nuevamente, coloque al animal en una jaula limpia y observe al animal mientras se recupera de la anestesia antes de devolverlo a la sala de alojamiento.Los animales fueron sometidos a 30 minutos de oclusión de la arteria cerebral media para inducir una lesión en el estriado izquierdo. Tres días después, se administró eritropoyetina humana recombinante mediante bombas osmóticas miniatura durante un período de 30 días. Se inyectó azul Cascade en el hemisferio infartado y se inyectó dextrano amina biotinilado en el hemisferio contralateral.Se siguieron las fibras hasta el núcleo facial. Se detectó dextrano amina biotinilado inyectado en la corteza motora contralateral a la lesión en las fibras corticobulbares. Se contaron las fibras hacia los hemisferios ipsilateral y contralateral a la lesión y se expresaron como porcentaje del total de fibras marcadas en el tracto corticoespinal.La eritropoyetina aumentó los cruces de fibras en dirección al núcleo facial contralateral. El comportamiento motor mostró una mejora en la fuerza de prensión manual en comparación con la línea base preisquémica tras la infusión de eritropoyetina humana recombinante. La coordinación motora, evaluada mediante la prueba del rotarod, también mejoró tras la infusión de eritropoyetina humana recombinante.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en menos de 30 minutos por intervención quirúrgica si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener una esterilidad adecuada durante la preparación de la bomba y durante la cirugía para prevenir infecciones cerebrales. El uso de trazadores de trayectos anterógrados y retrotrógrados es un enfoque seguro y no costoso que permite comprender la conectividad del cerebro tanto en estado de salud como en enfermedad.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo implantar y extraer bombas osmóticas miniatura y/o realizar inyecciones de trazadores de vías.

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Implantación de miniosmótica Bombas y Entrega de Trazadores del Tracto para estudiar la reorganización del cerebro en condiciones fisiopatológicas

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