Name: Aislamiento y caracterización de los neutrófilos con propiedades antitumorales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Aprenda a aislar neutrófilos con propiedades antitumorales mediante gradiente de densidad y co-cultivo con células tumorales marcadas con luciferasa. Esta técnica minimiza la activación no específica y evalúa la citotoxicidad sin etiquetas radiactivas.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Los neutrófilos son las más abundantes de todas las células blancas de la sangre y son los primeros en responder en casos de infección y la inflamación. Como tales, son muy sensibles a las señales externas y se activan fácilmente. Además, los neutrófilos tienen una vida media muy corta y una rápida rotación. En conjunto, estas características plantean varias dificultades en el trabajo con los neutrófilos, de tal manera que se requieren estrategias experimentales únicas. Por ejemplo, hay varias estrategias de purificació...

Los neutrófilos se caracterizaron inicialmente como las células inmunes innatas que sirven como primera línea de defensa contra los microorganismos invasores. Hoy en día se sabe que los neutrófilos han más funciones de gran alcance, estar involucrado en el montaje de la respuesta inmune adaptativa contra antígenos extraños 1,2, regulación de la hematopoyesis 3, 4 angiogénesis y cicatrización de heridas 5. Además, los neutrófilos pueden afectar el crecimiento del tumor y la progresión metastásica en virtud de sus actividades pro- y anti-tumorales 6,7. Los neutrófilos se caracterizan por un núcleo segmentado polimórfica (por lo tanto denominado polimorfonucleares (PMN) leucocitos) y contienen al menos tres subclases distintas de gránulos, así como vesículas secretoras 8 (Figura 1A-C). Los neutrófilos poseen alta capacidad fagocítica y de alta actividad de la oxidasa NADPH crítico para la eliminación microbiana, y secretan una amplia gama de quimioquinas importantes por lotracción de los neutrófilos adicionales y otras células inmunes en el sitio de la inflamación 8,9. Los neutrófilos se caracterizan por la expresión de una gran cantidad de receptores de la superficie, incluyendo los receptores de tipo Toll (TLRs), lectina tipo C receptores (CLR), receptor del complemento 3 (CD11b / CD18) y otras moléculas de adhesión (por ejemplo, L-selectina, LFA-1, VLA-4 y carcinoembrionario relacionados antígeno-molécula de adhesión celular 3 (CEACAM3 / CD66b)), receptores de quimiocinas (por ejemplo, CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2), los receptores quimioatrayentes (por ejemplo, PAFR, LTB 4 y R C5aR) , receptores de citoquinas (por ejemplo, G-CSFR, IL-1R, IL-4R, IL-12R, IL-18R, TNFR), formil-receptores de péptidos (por ejemplo, FPR1-3), y los receptores de Fc (por ejemplo, CD16 (Fc? RIII ), CD32 (RII) y CD64 (Fc? RI) 10. En los ratones, los neutrófilos suelen identificarse como CD11b + Ly6G +, mientras que los neutrófilos humanos se identifican utilizando los marcadores de leucocitos CD11b, CD15, CD16 y CD66b. También es generalmente aceptado para teñir para la mieloperoxidasa proteínas granulares (MPO) y la elastasa de neutrófilos (NE) para la detección de los neutrófilos en los tejidos. Aún no está claro si las diversas funciones de los neutrófilos están mediados por la misma célula o por sub-poblaciones de células distintas. La acumulación de datos sugieren la presencia de una población heterogénea de neutrófilos que exhibe un alto grado de plasticidad afectados por estímulos proinflamatorios y el microambiente 11,12. Fridlender et al. 13 groseramente han dividido a los neutrófilos en el cáncer en dos grandes grupos de población denominado N1 con propiedades antitumorales y N2 con propiedades pro-tumorales. En el cáncer, así como en la inflamación crónica, existe una sub-población adicional compuesta de células granulocíticas mieloides derivadas de supresores (G-MDSCs) que suprimen las respuestas de células T 14. G-MDSCs se considera que son las células mieloides inmaduras se caracterizan por un CD11b + Ly6Cbajo hi fenotipo Ly6G en ratones 15, mientras que con un CD15 + / CD16 baja fenotipo en humanos 16. G-MDSCs expresan niveles más altos de arginasa y la mieloperoxidasa, mientras que los niveles más bajos de citocinas y quimiocinas que los neutrófilos circulantes normales. Son menos de fagocitosis y migratoria, pero producen mayores niveles de ROS 15,17,18. En el presente artículo vamos a describir algunas metodologías básicas para el aislamiento y la caracterización de los neutrófilos con propiedades antitumorales. Mientras que los neutrófilos constituyen la población más grande de todas las células blancas de la sangre en la circulación humana (45 - 70%; 1800 - 6000 / l), en ratones, en condiciones normales, son más bien escasa (10 - 15%; 300-500 / l ). El recuento de neutrófilos aumenta de manera constante sobre la inflamación y en ocasiones en el cáncer, lo que representa un estado de inflamación crónica 7. Los neutrófilos se desarrollan a partir multipotentes precursor mieloide común (CMP) cells en la médula ósea, a través de un proceso de diferenciación que pasan las etapas de mieloblastos (MB), promielocitos (PM), mielocitos (MC), metamielocitos (MM) y células de la banda (BC) 8. Los neutrófilos, post-mitóticas maduras pueden permanecer dentro de la médula ósea de 4-7 días antes de que se liberan a la circulación 8. Facturación de neutrófilos en la sangre suele ser rápida con una vida media promedio de 6 - 12 horas, que puede ser prolongado en condiciones inflamatorias. Neutrófilos no estimulados han limitado la actividad anti-tumorigénicos, una característica que puede ser adquirida mediante la exposición de los neutrófilos ingenuos a las quimiocinas IL-8 (CXCL2), CCL2, CCL5 y CXCL5 6,19 o artificialmente, al exponerlos a la forbol éster de forbol 12 -myristate 13-acetato (PMA) 6. La corta vida media de los neutrófilos en la sangre junto con el bajo número de neutrófilos (~ 3-5 x 10 5) alcanzado entre el 1 ml de sangre de un inocente 6-8 semanas de edad ratón, han hechodifícil de explorar la función de los neutrófilos circulantes ratón in vitro. Para superar esta dificultad, se han utilizado otras fuentes. Por ejemplo, un gran número de neutrófilos pueden ser obtenidas de la médula ósea 20 o el peritoneo tras la inducción de la inflamación estéril (por ejemplo, después de la inyección intraperitoneal de caldo de tioglicolato o Zymosan A). Cabe señalar que los neutrófilos obtenidos a partir de la cavidad peritoneal no ejercen ninguna actividad anti-tumorigénico (observación no publicada). . Granot et al 6 observó que los ratones BALB / c inoculados ortotópicamente con el ratón 4T1 línea celular de carcinoma de mama desarrollar neutrofilia que agrava con la progresión tumoral 6 (Figura 2A), de tal manera que 20 a 40000000 neutrófilos de la sangre pueden ser fácilmente aislados de 1 ml de sangre 3 - 4 weeks post-inoculación del tumor. Estos neutrófilos han adquirido las actividades antitumorales, y en consecuencia han sido coineutrófilos nidos tumorales arrastradas (RTE), a fin de distinguirlos de los neutrófilos ingenuos 6 (Figura 2B). Mientras que los neutrófilos de alta densidad (HDN, la Figura 1A) son altamente anti-tumorigénicos, los neutrófilos de baja densidad (LDN, Figura 1B) generados en el contexto de cáncer no son 21. Además, los neutrófilos de alta densidad de la médula ósea y el bazo de ratones portadores de tumores tienen actividad anti-tumor (datos no publicados). Cabe señalar que con la progresión del tumor del bazo se vuelve gradualmente agrandada (esplenomegalia), con cantidades crecientes de neutrófilos. Cabe señalar que la RTE se generan también en otros modelos de cáncer incluyendo tanto espontáneas (MMTV-PYMT y MMTV-Wnt1 tumores mamarios y tumores de pulmón impulsados ​​k-Ras) y se inyectaron (AT-3 (MMTV-PYMT) y carcinoma de mama E0771 células, células de carcinoma de pulmón de Lewis LLC y células de melanoma B16-F10). Sin embargo, la medida de la movilización de neutrófilos en estos tumo modelos es mucho menor que los ratones inoculados-4T1, alcanzando 5-10 x 10 6 neutrófilos en 1 ml de sangre después de 3 semanas.

<table><tbody><tr><td>LÍNEAS CELULARES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Células de carcinoma de mama 4T1 de ratón</td><td>ADCC</td><td>CRL-2539</td><td>Medio de crecimiento: DMEM + 10 % inactivado por calor FBS</td></tr><tr><td>ARTÍCULOS Y EQUIPOS DE PLÁSTICO Placa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de cultivo de tejidos de 24 pocillos&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td>Placa estéril</td></tr><tr><td>de cultivo de tejidos de 100 mm&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Estéril</td></tr><tr><td>25 cm2 Matraz de cultivo</td><td>Nunc</td><td>156340</td><td>Plato de cultivo estéril</td></tr> de <tr><td>grado bacteriano de 90 mm&nbsp;</td><td>Miniplast, Ein Shemer, Israel</td><td>20090-01-017</td><td>Tubo de</td></tr><tr><td>centrífuga cónico estéril estéril de 15 ml&nbsp;</td><td>Miniplast, Ein Shemer, Israel</td><td>835015-40-111</td><td>Tubo de</td></tr><tr><td>centrífuga cónica estéril estéril de 50 ml&nbsp;</td><td>Miniplast, Ein Shemer, Israel</td><td>835050-21-111</td><td>Halcón estéril</td></tr><tr><td>12 x 75 mm Tubo de poliestireno de fondo redondo&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>352058</td><td>placa de migración estéril</td></tr><tr><td>Millicell 24 con un tamaño de poro de 5&mu; m&nbsp;</td><td>Merck Millipore</td><td>PSMT010R1</td><td></td></tr><tr><td>Placa de pocillo blanca estéril de 96 pies de fondo plano&nbsp;</td><td>Costar</td><td>3917</td> Filtro de células <td>estériles</td></tr><tr><td>(40 mm)&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>Aguja estéril</td></tr><tr><td>20G x 1.5" BD</td><td>Microlance 3&nbsp;</td><td>301300</td><td>Aguja estéril</td></tr> de <tr><td>23G x 1"&nbsp;</td><td>BD Microlance 4</td><td>300800</td><td>Aguja estéril</td></tr><tr><td>de 25G x 5/8"&nbsp;</td><td>BD Microlance 5</td><td>300600</td><td>Jeringa estéril</td></tr> de <tr><td>0,3 ml con aguja de 30G x 8 mm</td><td>BD Micro-Fine Plus Demi</td><td>320829</td><td>Clips estériles</td></tr> de <tr><td>9 mm&nbsp;</td><td>BD, AutoClip&nbsp;</td><td>427631</td><td>Imán estéril</td></tr><tr><td>EasySep&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>MACS LS Columna de separación&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-201</td><td>Imán separador estéril</td></tr><tr><td>MidiMACS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio para microscopio&nbsp;</td><td>Menzel-Gl&auml; ser Superfrost&nbsp; Agitador orbital Plus Thermo J1800AMNZ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sky line, ELMI</td><td>S-3.02.10L</td><td></td></tr><tr><td>Lector de placas&nbsp;</td><td>TECAN</td><td>InfiniteF200Pro</td><td></td></tr><tr><td>POWDER</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA), fracción V</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Bromodeoxyuridina (BrdU)&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>550891</td><td>CFSE estéril</td></tr><tr><td>(5-(y 6-)-Carboxifluoresceína, éster de succinimidilo)</td><td>Sondas moleculares</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>Dextrano T500</td><td>Sigma</td><td>31392</td><td></td></tr><tr><td>Heparina sal sódica de la mucosa intestinal porcina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Azida sódica (NaN3)</td><td>Sigma</td><td>S8032</td><td>Altamente tóxico, maneje con cuidado</td></tr><tr><td>Polvo de tioglicolato&nbsp;</td><td>Difco</td><td>225650</td><td></td></tr><tr><td>Zymosan A</td><td>Sigma</td><td>Z4250</td><td></td></tr><tr><td>MEDIOS Y SUPLEMENTOS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)</td><td>Sigma</td><td>D5796</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Opti-MEM&reg; Reduje el suero medio&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>31985062</td><td>Estéril</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medio</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td>Suero</td></tr><tr><td>fetal bovino estéril (FBS), inactivado por calor</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td> estéril <td>Industrias Biológicas, Beth HaEmek, Israel</td><td>03-020-1A</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td> estéril <td>Industrias Biológicas, Beth HaEmek, Israel</td><td>03-042-1B</td><td>Penicilina estéril</td></tr><tr><td>Estreptomicina x 1000 solución</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td><td>03-031-5</td><td>Solución</td></tr><tr><td>salina tamponada con fosfato estéril (PBS) sin Mg2+ y Ca2+&nbsp;</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td><td>02-023-1</td><td>PBS estéril</td></tr><tr><td>x 10 sin Ca2+ y Mg2+&nbsp;</td><td>Industrias Biológicas, Beth HaEmek, Israel</td><td>02-023-5A</td><td>Agua estéril</td></tr><tr><td>de grado HPLC&nbsp;</td><td>J.T. Baker</td><td>4218-03</td><td>Autoclave</td></tr><tr><td>SOLUCIONES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACK &ndash; Tecnologías de vida de amonio-cloruro-potasio</td><td>&nbsp;</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>Solución de bromodeoxiuridina (BrdU) (10 mg/ml) en PBS</td><td></td><td></td><td>Disuelva 10 mg de BrdU en 1 ml de PBS y filtro estéril.</td></tr><tr><td>CFSE, 5 mM en DMSO</td><td></td><td></td><td>Disuelva 2,8 mg de CFSE en 1 ml de DMSO. Dividir en alícuotas de 10 ml en tubos estériles de 200 ml y almacenar en la oscuridad a -20oC.</td></tr><tr><td>Solución de eosina Y</td><td>Sigma</td><td>HT110-2-32</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hanks</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td><td>02-016-1A</td><td></td></tr><tr><td>Heparina estéril, 20 mg/ml en PBS</td><td></td><td></td><td>Disuelva 100 mg de heparina en 5 ml de PBS estéril y filtre estéril a través de un filtro de 0,2 mm.</td></tr><tr><td>Histopaco-1119&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>Filtro estéril a través de un filtro de 0,2 mm.</td></tr><tr><td>Histopaco-1077&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td>Filtro estéril a través de un filtro de 0,2 mm.</td></tr><tr><td>Tampón de lisis para cultivo celular luciferasa x5</td><td>Promega</td><td>E153A</td><td>Diluir 1:5 en agua estéril justo antes de usar.</td></tr><tr><td>Solución de ensayo de luciferasa</td><td>Promega</td><td>E1501</td> Contiene polvo de sustrato de ensayo de <td>luciferasa (E151A) y tampón de ensayo de luciferasa (E152A)</td></tr><tr><td>Solución de hematoxilina de Mayer&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>MHS-32</td><td></td></tr><tr><td>PBS + 0,5% BSA</td><td></td><td></td><td>Disuelva 2,5 g de BSA en 500 ml de PBS y filtre estéril a través de un filtro de 0,2 mm.</td></tr><tr><td>PBS + 1% BSA</td><td></td><td></td><td>Disuelva 1 g de BSA en 100 ml de PBS y filtre estéril a través de un filtro de 0,2 mm.</td></tr><tr><td>5x PBS con 2,5% de BSA</td><td></td><td></td><td>Disuelva 12,5 g de BSA en una mezcla de 250 ml de agua estéril de grado HPLC y 250 ml de PBSx10, y filtre estéril a través de un filtro de 0,2 mm.</td></tr><tr><td>PBS que contiene 0,5% de BSA y 2 mM de EDTA</td><td></td><td></td><td>Disuelva 250 mg de BSA en 50 ml de PBS estéril y agregue 200 ml de 0,5M de EDTA pH 8.0, filtro estéril a través de un filtro de 0,2 mm.</td></tr><tr><td>Tampón FACS (PBS que contiene 0,5% de BSA, 2 mM de EDTA y 0,02% de NaN3)</td><td></td><td></td><td>Disuelva 250 mg de BSA en 50 ml de PBS&nbsp; estéril y añada 200 ml de 0,5M de EDTA pH 8,0 y 500 ml de NaN3 al 2%, filtro estéril a través de un filtro de 0,2 mm.</td></tr><tr><td>Solución salina (0,9% NaCl)</td><td></td><td></td><td>Disolver 9 g de NaCl en 1.000 ml ddw, solución</td></tr><tr><td></td><td></td> de<td>autoclave de NaCl al 0,2%</td><td>Disolver 2 g de NaCl en 1.000 ml de ddw, autoclave</td></tr><tr><td>1,6% NaCl</td><td></td><td></td> solución <td>Disolver 16 g de NaCl en 1.000 ml ddw, autoclave</td></tr><tr><td>2 % Azida sódica</td><td></td><td></td><td>Disolver 1 g de azida sódica en 50 ml ddw estéril, mantener a 4oC. Altamente tóxico.</td></tr><tr>Solución <td></td><td></td><td>de tioglicolato al 3%</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Disolver 3 g de tioglicolato en polvo en 100 ml ddw. &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Hervir hasta que la solución se vuelva amarilla y se autoclave en autoclave.</td></tr><tr><td>Solución de azul de tripano (0,4%)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>Diluir 1:10 en PBS para obtener una solución al 0,04%.</td></tr><tr><td>Solución de tripsina B&nbsp;</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td><td>03-046-1</td><td></td></tr><tr><td>Zymosan A</td><td></td><td></td> estéril 1 mg/ml <td>Resuspenda 1 mg de Zymosan A en 1 ml de PBS estéril en un tubo Eppendorf. Agite vigorosamente e incube el tubo a 37 oC durante 30 min. No lo haga en autoclave. Prepare la solución fresca antes de usarla.</td></tr><tr><td>KITS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EasySep Kit de selección de PE</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18557</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Cóctel de selección de PE&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18151</td><td></td></tr><tr><td>las nanopartículas magnéticas EasySep&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18150</td><td></td></tr><tr><td>Ratón Anti-Ly6G Kit MicroBead</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-332</td><td></td></tr><tr><td>Kit de enriquecimiento de neutrófilos para ratones EasySep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>19762</td><td></td></tr><tr><td>Kit de enriquecimiento de neutrófilos humanos EasySep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>19257</td><td></td></tr><tr><td>Kit de flujo FITC BrdU</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td></td><td></td>559619</tr><tr><td>MACS Kit de aislamiento de neutrófilos</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-658</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo de fagocitosis&nbsp;</td><td>Compañía Química de las Islas Caimán&nbsp;</td><td>500290</td><td></td></tr><tr><td>ANTICUERPOS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo bloqueador FcR&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>101302</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-Ly6G purificado para ratas&nbsp;</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>551459</td><td>clon 1A8</td></tr><tr><td>PE anticuerpo anti-ratón anti-ratón anti-ratón &nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>127608</td><td>Clon 1A8</td></tr><tr><td>FITC-conjugado rata anti-ratón Ly6G</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>551460</td><td>Clon 1A8</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 rata anti-ratón Ly6G&nbsp;</td><td>TONBO Biosciences</td><td>65-1276</td><td>Clon 1A8</td></tr><tr><td>violetaFluor 450-conjugado rata anti-ratón Ly6G&nbsp;</td><td>TONBO Biosciences</td><td>75-1276</td><td>Clon 1A8</td></tr><tr><td>FITC-conjugado rata anti-ratón CD11b</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>553310</td><td>Clon M1/70</td></tr><tr><td>FITC-conjugado rata anti-ratón Ly-6G y Ly-6C (GR-1)</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>553127</td><td>Clon RB6-8C5</td></tr><tr><td>PE-conjugado rata anti-ratón CD45</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>553081</td><td>Clon 30-F11</td></tr><tr><td>FITC-conjugado rata anti-ratón F4/80&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab60343</td><td>Clon BM8</td></tr><tr><td>FITC-conjugado ratón anti-humano CD66b&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>305103</td><td>Clon G10F5</td></tr><tr><td>Anticuerpos purificados para el control del isotipo de rata (IgG2a, k)&nbsp;</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>553927</td><td>Clon R35-95</td></tr><tr><td>LEAF Hámster Armenio purificado anti-ratón CD3e Anticuerpo BioLegend</td><td></td><td>100314</td><td>Clon 145-2C11</td></tr></tbody></table>

aislamiento y caracterización de los neutrófilos con propiedades antitumorales

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Los neutrófilos, la más abundante de todas las células blancas de la sangre en la circulación humana, juegan un papel importante en la defensa del huésped contra los microorganismos invasores. Además, los neutrófilos desempeñan un papel central en la vigilancia inmune de las células tumorales. Tienen la capacidad de reconocer las células tumorales e inducir la muerte de células tumorales, ya sea a través de un mecanismo dependiente del contacto celular que implica peróxido de hidrógeno o a través de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). Los neutrófilos con actividad anti-tumor se pueden aislar a partir de sangre periférica de pacientes con cáncer y de ratones portadores de tumores. Estos neutrófilos se denominan neutrófilos tumorales arrastradas (diez) para distinguirlos de los neutrófilos de sujetos sanos o ratones naïve que no muestran actividad citotóxica significativa tumor. En comparación con otras células blancas de la sangre, los neutrófilos muestran diferente flotabilidad por lo que es factible obtener a&gt; 98% de la población de neutrófilos puro cuando se somete a un gradiente de densidad. Sin embargo, ademása la población de neutrófilos de alta densidad normal (HDN), en pacientes con cáncer, en ratones portadores de tumores, así como en condiciones inflamatorias crónicas, las poblaciones de neutrófilos de baja densidad distintas (LDN) aparecen en la circulación. LDN co-purifica con la fracción mononuclear y se puede separar a partir de células mononucleares utilizando cualquiera de las estrategias de selección positivos o negativos. Una vez que la pureza de los neutrófilos aislados se determina por citometría de flujo, pueden ser utilizados para in vitro y en ensayos funcionales in vivo. Se describen técnicas para el seguimiento de la actividad anti-tumor de los neutrófilos, su capacidad para migrar y para producir especies reactivas del oxígeno, así como la supervisión de su capacidad fagocítica ex vivo. Describimos más técnicas para etiquetar los neutrófilos para el seguimiento in vivo, y para determinar su capacidad anti-metastásico in vivo. Todas estas técnicas son esenciales para la comprensión de cómo obtener y caracterizar los neutrófilos con anti-tumorfunción.

En un estudio reciente se identificó una función anti-metastásica de neutrófilos 6. Los neutrófilos de ratones portadores de tumores adquirir un fenotipo citotóxico y tienen la capacidad para matar las células tumorales 6. Esto está en contraste con los neutrófilos de ratones naïve que no tienen efecto anti-tumoral significativa 6. Varias de las técnicas descritas en la Sección de Protocolo se han utilizado para el estudio de la función de neutrófilos anti-tumor in vitro e i...

Los neutrófilos desempeñan un papel importante no solo en la defensa del huésped contra los microorganismos invasores, sino que también están implicados en la vigilancia inmunitaria de las células tumorales. En este trabajo describimos técnicas relacionadas con el aislamiento de neutrófilos con propiedades antitumorales y métodos para monitorizar la función de neutrófilos antitumorales in vitro e in vivo.

Aislamiento y caracterización de los neutrófilos con propiedades antitumorales

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

El objetivo general de este procedimiento es estudiar la función de los neutrófilos en el cáncer. Esto se logra primero obteniendo la sangre periférica. En el segundo paso, los neutrófilos se purifican mediante un gradiente de densidad seguido de un cultivo conjunto nocturno.Con células tumorales marcadas con luciferasa, se cuantifica entonces la actividad de la luciferasa en las células. En última instancia, la cantidad de luciferasa en cada co-cultivo puede correlacionarse inversamente con la citotoxicidad de los neutrófilos presentes en cada co-cultivo. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la separación de neutrófilos mediante anticuerpos y otros métodos para evaluar la viabilidad celular, es que este procedimiento minimiza la activación no específica de los neutrófilos y permite la medición de la viabilidad celular sin el uso de etiquetas radiactivas.Para demostrar este procedimiento, contaremos con la participación de un estudiante de posgrado de mi laboratorio y del Dr. Simoni, investigador postdoctoral de mi laboratorio. Para aislar neutrófilos de un ratón con tumor, comience por diluir un mililitro de sangre obtenida mediante punción cardíaca en PBS que contenga 0,5 % de BSA hasta un volumen final de seis mililitros. A continuación, agregue tres mililitros de sacarosa estéril filtrada de 1,119 gramos por mililitro en la parte inferior de un tubo cónico de centrífuga de polipropileno de 15 mililitros. Luego, incline el tubo lentamente y con cuidado.Coloque tres mililitros de sacarosa estéril filtrada de 1,077 gramos por mililitro encima de la sacarosa de 1,119 gramos por mililitro, seguido de los seis mililitros de sangre diluida. Separe las células mediante centrifugación en gradiente de sacarosa durante 30 minutos a 700 Gs a temperatura ambiente. Al finalizar la separación, la mayor parte de los eritrocitos se encontrará en el fondo del tubo.Los neutrófilos de alta densidad estarán alrededor de la marca de tres mililitros, en el anillo de color blanco a rojo, en la interfase entre las capas de sacarosa. Mientras tanto, los leucocitos de baja densidad estarán en el anillo blanco, en la interfase entre la capa de 1.077 gramos por mililitro y el PBS que contiene BSA, alrededor de la marca de seis mililitros; aspire la capa de P-B-S-B-S-A hasta cinco milímetros por encima de la capa de células de baja densidad. Luego, utilizando una punta de pipeta de un mililitro, retire las células de baja densidad mediante succión lenta mientras agita suavemente las células. Dispense las células en 30 mililitros de PBS con 0,5 % BSA. Luego transfiera los neutrófilos de alta densidad a un tubo separado con 30 mililitros de PBS más BSA. De la misma manera, centrifugue ambos conjuntos de células y luego resuspenda los pellets en 36 mililitros de agua estéril de grado HPLC.Después de 30 segundos, restablezca la isotonicidad de las células con nueve mililitros de PBS 5X suplementado con 2,5 % de BSA y centrifugue para sedimentar las células. Nuevamente, re suspenda las células en 10 mililitros de PBS-BSA y determine el número de células viables mediante exclusión con azul de trian. Luego, tras otra centrifugación, re suspenda los neutrófilos en medio de incubación a la densidad celular final adecuada.Para aislar los neutrófilos circulantes de un paciente con cáncer. Comience mezclando 10 mililitros de sangre humana heparinizada con un volumen igual de 3% DExT strand T 500 en solución salina durante una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente para sedimentar los eritrocitos. Cuando los glóbulos rojos se hayan asentado, coloque lentamente el sobrenadante rico en leucocitos sobre 10 mililitros de sacarosa al 1,077 gramos por mililitro y separe las células mediante centrifugación. Como se acaba de demostrar, los neutrófilos humanos de alta densidad estarán presentes en el sedimento, mientras que los neutrófilos de baja densidad se purificarán conjuntamente con los monocitos y linfocitos en la interfase entre la capa de sacarosa al 1,077 gramos por mililitro y el plasma.Después de recolectar los neutrófilos como se acaba de demostrar, diluya las células en 10 mililitros de cloruro de sodio al 0,2 % durante 30 segundos para lisar los eritrocitos contaminantes. Luego añada 10 mililitros de cloruro de sodio al 1,6 % para restablecer la isotonicidad de las células e invierta el tubo una vez para mezclar. Centrifugue las células y lave el sedimento tres veces en 20 mililitros de HBSS.Luego cuente las células y resuspenda en RPMI 1640, suplementado con 2 %FBS, a la densidad celular adecuada. Para aislar neutrófilos inducidos por tioglicolato o Xan. Utilice una jeringa tuberculínica con una aguja de 23 gauge de una pulgada para administración intraperitoneal.Injecte un mililitro de la solución adecuada en el abdomen del ratón. De cuatro a 24 horas después, inyecte cinco mililitros de PBS estéril en el peritoneo del animal sacrificado utilizando una jeringa de cinco mililitros equipada con una aguja de calibre 25 y longitud de cinco octavos de pulgada. Masajee suavemente el peritoneo y luego aspire nuevamente el líquido hacia la jeringa para recolectar las células del exudado peritoneal.Lave las células en RPMI 1640, medio suplementado con 10 % FBS. Luego, para eliminar los macrófagos, incube una concentración de 10⁶ células por mililitro en una placa de cultivo celular de calidad para cultivo de tejidos que contenga medio suplementado con FBS durante dos horas a 37 grados Celsius. Para teñir los neutrófilos aislados, re suspenda 1 × 10⁵ de las células en alícuotas de 50 microlitros de PBS y centrifugue las suspensiones celulares en un adaptador para preparación de capa delgada de células a 150 × g. Después de cinco minutos, separe las portaobjetos previamente etiquetados del adaptador, fije y tiña las células.A continuación, lave las laminillas 15 veces con agua del grifo. Deje que las laminillas sequen al aire nuevamente y luego examine las células bajo un microscopio óptico para evaluar la actividad antitumoral de los neutrófilos. Diluya cinco veces diez a la cuarta células tumorales marcadas con luciferasa por mililitro en medio óptimo con suero reducido, suplementado con 0,5 % de FBS.Luego, siembre cinco veces 10 a la tercera de las células tumorales en 100 microlitros de medio optimizado con suero reducido que contiene 0,5 %FBS en cada pocillo de una placa de cultivo celular de tejidos blanca de 96 pocillos con fondo plano. Cuatro horas después, agregue una vez 10 a la quinta de neutrófilos en 50 microlitros de medio optimizado con suero reducido que contiene 0,5 %FBS a cada pocillo para una incubación nocturna. A la mañana siguiente, aspire suavemente el sobrenadante y lave cada pocillo con 200 microlitros de PBS.Luego aspire el PBS y agregue 50 microlitros de tampón de lisis pasiva a cada pocillo. A continuación, incube la placa cubierta con papel de aluminio en un agitador orbital a 150 RPM a temperatura ambiente. Después de 20 minutos, cargue la placa en un lector de placas de luminiscencia.Inyecte 50 microlitros de solución de ensayo de luciferasa en cada pocillo y lea la quimioluminiscencia durante 10 segundos por pocillo. Finalmente, utilice la fórmula para calcular el porcentaje de lisis tumoral y evaluar el grado de citotoxicidad de neutrófilos en este experimento representativo de uno por diez a la quinta. Los neutrófilos se co-cultivaron con células diana 4T1 que expresan luciferasa, como se acaba de demostrar, en co-cultivos con neutrófilos purificados de ratones libres de tumor.Se observó muy poca muerte de las células tumorales. Sin embargo, los neutrófilos purificados de ratones con tumores exhibieron un nivel significativo de citotoxicidad para evaluar las propiedades inmunosupresoras de los neutrófilos de baja y alta densidad. El número de linfocitos T esplénicos positivos para CD ocho tras la estimulación con anti-CD tres o anti-CD tres más neutrófilos de baja o alta densidad se evaluó tras la activación con anti-CD tres.Se observó un aumento dramático en las células positivas para CD8. Sin embargo, el co-cultivo con neutrófilos de baja densidad indujo una reducción notable en las células positivas para CD8, un efecto que no se observó en presencia de neutrófilos de alta densidad. La retención de CFSE también se evaluó como indicador de proliferación.Observe el desplazamiento hacia la izquierda en las células tratadas con anti-CD3 y en las células tratadas con anti-CD3 cultivadas en presencia de neutrófilos de alta densidad, lo que demuestra en ambos casos un aumento en la proliferación de células CD8 positivas. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la medición de ráfagas oxidativas, fagocitosis o migración para responder preguntas adicionales, tales como: ¿cómo se ve afectada la función de los neutrófilos en diferentes escenarios patológicos?

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

En este reporte se describe un protocolo para el aislamiento de las poblaciones altamente purificadas de leucocitos que se infiltran en los tumores. Este protocolo es una adaptación del protocolo de Miltenyi Biotech para mejorar el rendimiento y la pureza para el aislamiento de las células del tejido tumoral compleja.

El aislamiento de las células inmunes de tumores primarios

En este video, demostramos el aislamiento de neutrófilos citotóxicos de alta densidad y neutrófilos de baja densidad de la sangre de un ratón portador de tumores mediante centrifugación discontinua en gradiente de sacarosa.

Aislamiento de neutrófilos citotóxicos a partir de sangre de ratón portadora de tumores

Este video muestra un ensayo para generar neutrófilos asociados a tumores (TAN) antiangiogénicos. Al tomar un tumor de melanoma murino que contiene TAN proangiogénicos, las células individuales se aíslan mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y se tratan con un inhibidor de la nicotinamida fosforribosil transferasa (NAMPT) para reducir la capacidad de estimular la angiogénesis.

Generación de neutrófilos antiangiogénicos asociados a tumores

Los neutrófilos son el tipo más abundante de glóbulos blancos. Aquí se describe el aislamiento de neutrófilos de la sangre humana mediante el método de separación en gradiente de densidad y la diferenciación de células promielocíticas humanas (HL60) a lo largo de la vía granulocítica; para probar su papel en la sensibilidad de las células de linfoma a los agentes antilinfomas.

Aislamiento de neutrófilos y análisis para determinar su papel en el linfoma de células sensibles a los agentes terapéuticos

Aquí se describen nuevos protocolos para aislar y caracterizar micropartículas derivadas de humano y ratón neutrófilos. Estos protocolos utilizan técnicas immunoblotting para analizar contenido de micropartículas, ultracentrifugación y citometría de flujo, y pueden ser utilizados para estudiar el papel de micropartículas derivadas de diversos tipos celulares en función de las células.

Aislamiento y caracterización de micropartículas de neutrófilos derivado de estudios funcionales

Aquí, presentamos un método en el que neutrófilos baja densidad humanos (LDN), recuperados del líquido de lavado peritoneal postoperatorio, producen enormes trampas extracelulares neutrófilos (redes) y atrapan eficientemente las células tumorales libres que posteriormente crecen.

Neutrófilos trampas extracelulares generadas por los neutrófilos de baja densidad obtienen de líquido de lavado Peritoneal mediato accesorio y el crecimiento de células tumorales

Aquí, presentamos un protocolo para detectar la presencia de neutrófilos en las secciones fijas/permeabilized histología y evaluar el estado de activación de los neutrófilos purificados vivo. En particular, el péptido de40 MUB ATA lactoferrina presente en gránulos específicos de neutrófilos y terciarios. Exposición de los contenidos del gránulo a través de permeabilización o neutrófila activación permite el marcado de los neutrófilos.

El péptido de40 de MUB para uso en la detección de eventos de la inflamación mediada por neutrófilos

Aquí, mostramos el potencial terapéutico de los neutrófilos anti-angiogénicos asociados a tumores después de su transferencia a ratones portadores de tumores. Este protocolo se puede utilizar para manipular la actividad de neutrófilos ex vivo y para evaluar posteriormente su funcionalidad in vivo en el desarrollo de tumores. Es un modelo adecuado para estudiar posibles inmunoterapias basadas en neutrófilos.

Transferencia de neutrófilos asociados a tumores manipulados a ratones portadores de tumores para estudiar su potencial angiogénico en Vivo

Este protocolo detalla un método para el aislamiento de neutrófilos de sangre total, capas buffy o membranas de leucoféresis, logrando un buen rendimiento, alta pureza y mínima activación celular. Utilizamos la purificación por gradiente, la sedimentación de glóbulos rojos (RBC) y la lisis de RBC para obtener una preparación de neutrófilos de alta calidad / pureza.

Aislamiento de neutrófilos humanos de sangre entera y buffy coats

Este protocolo definido describe un enfoque de microscopía de alto rendimiento en tiempo real para visualizar y cuantificar la liberación de trampas extracelulares (NET) de neutrófilos humanos in vitro. El método reproducible permite la investigación de las características y la cinética de la liberación de NET tras la estimulación con distintos inductores de NETosis y permite la evaluación de la farmacología de los antagonistas de NETosis.

Cuantificación microscópica en tiempo real y de alto rendimiento de la liberación de trampas extracelulares de neutrófilos humanos y evaluación de la farmacología de los antagonistas

Aquí, proporcionamos un enfoque confiable para aislar neutrófilos de densidad baja y normal de la sangre total utilizando aislamiento magnético (selección negativa) y medio de gradiente de densidad discontinuo. Garantiza el aislamiento intacto de las células de alta pureza (≥93%), lo que facilita el análisis preciso de las subpoblaciones de neutrófilos, crucial para comprender sus funciones en la salud y la enfermedad.

Aislamiento y caracterización de neutrófilos de densidad baja y normal a partir de sangre total

Aprenda a aislar neutrófilos con propiedades antitumorales mediante gradiente de densidad y co-cultivo con células tumorales marcadas con luciferasa. Esta técnica minimiza la activación no específica y evalúa la citotoxicidad sin etiquetas radiactivas.

Aislamiento y caracterización de los neutrófilos con propiedades antitumorales

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